Name: agroinfiltration and pvx agroinfection in potato and nicotiana benthamiana
Uploaded: 2014-01-03T19:45:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Arbeidet støttes delvis av Wageningen University Fund (WUF), China Scholarship Council Program for Graduate Students og et NWO-VIDI-stipend 12378.

1. Plantevekst og testforhold
<ol><li>Vokse og vedlikeholde planter i kontrollerte drivhuse eller klimakamre innenfor temperaturområdet 18-22 °C og under naturlig lysregime eller med et 16 timers/8 timers dag/natt-regime. Fjern aksillære grener for å gjøre plantene mer håndterbare.</li>
	<li>For potet, opprettholde in vitro plantlets i sterile plast krukker som inneholder Murashige-Skoog (MS) medium (20 g / L sukrose, 5 g / L MS salter med vitaminer, 8 g / L agar, pH 5.8) under kontrollerte forhold i klimakamre ved 18 ° C med en 16 timer / 8 dag / natt regime i to uker og deretter overføre dem til potter av sterilisert jord regulert jord i regulerte drivhus.</li>
</ol>2. Agroinfiltrasjon
<ol><li>Plantemateriale: For Nicotiana benthamiana, bruk rundt 4-5 uker gamle frøvoksne planter. For potet, bruk rundt 4-5 uker gamle transplantasjoner fra in vitro. Velg unge, sunne og fullt utviklede blader for infiltrasjoner.</li>
	<li>
Agrobacterium kultur:<ol>
<li>Klargjør YEB-mediet på forhånd (Tabell 1). Fyll 50 ml rørene med 10 ml YEB medium supplert med 1 μl acetosyringon (200 mM), 100 μl MES-buffer (2-(N-morpholino)-etan sulfonsyre, 1 M) og passende antibiotika. Pipette 20 μl glyserolbestand av de ønskede stammene (Tabell 2) (som inneholder genet av interesse) inn i YEB. Initier kulturer for alle Agrobacterium-stammene i denne analysen samtidig. Inkuber celler ved å riste i 1-2 dager ved 28 °C og 200 o/min til en OD600 på ca. 1,0.</li>
		<li>Høst celler ved sentrifugering ved 3000 x g i 10 min. Hell av supernatanten og resuspend pelletsen i nylaget MMA-medium (Tabell 3) til en OD600 på 0,3. Virvelceller forsiktig for å resuspendere dem. For myntfiltrering av to bakteriestammer, bland kulturen i et 1: 1-forhold.</li>
		<li>La kulturen stå på benken ved romtemperatur i 1-6 timer før infiltrasjoner. I mellomtiden merker du plantene som skal infiltreres og datoen for eksperimentet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infiltrasjoner: Bruk en 1 ml sprøyte uten nål for å infiltrere Agrobacterium-suspensjonene. Injiser bladpanelene forsiktig og sakte med suspensjonene fra sprøyten (av helse- og sikkerhetsgrunner bør øyebeskyttelse brukes under denne prosessen). Infiltrer minst tre planter for hver stamme. Bruk tre blader per plante for å tjene som triplikater. Merk: Normalt kan 1 ml Agrobacterium suspensjon s være nok for 3 planter av N. benthamiana. For potet er det nødvendig med mer suspensjon fordi bladene av Solanum-arter er vanskeligere å infiltrere. Nødvendige mengder suspensjoner avhenger av Solanum-arten. Unngå krysskontaminering ved å bytte hansker eller sterilisere hansker med etanol mellom infiltrasjoner og ved ikke å vanne plantene før dagen etter inokuleringen.</li>
	<li>Scoring: Skår makroskopiske svar ca. 3 dager etter infiltrasjon når cellens dødsfenotype er klar (Figur 1). Hvis celledødsfenotypen er kvantitativ, bruker du de angitte vilkårene (Figur 2). Kort sagt, skalaene for makroskopisk skåring av celledød avhenger hovedsakelig av celledødsprosentene i det infiltrerte området. Prosentandeler av celledød er avbildet på en skala fra 0% (ingen symptomer) til 100% (samtidig celledød). Mellomliggende svar spenner fra svake responser som klorose til økende nivåer av celledød. Om ønskelig kan den makroskopiske skåringen også vurderes kvantitativt ved hjelp av moderne fotoavbildningsutstyr.</li>
</ol>3. PVX Agroinfection
<ol><li>Plantemateriale: For N. benthamiana, bruk rundt 2-3 uker gamle frøvoksne planter. For potet, bruk rundt 2-3 uker gamle transplantasjoner fra in vitro. For store tester, bruk litt eldre (4-5 uker) planter, da disse plantene har flere og større blader for å imøtekomme høyere antall Agrobacterium inokulasjonssteder.</li>
	<li>
Agrobacterium culturing:<ol>
<li>Forbered YEB-mediet på forhånd. Fyll 10 ml rørene med 3 ml YEB supplert med passende antibiotika. Pipette 20 μl glyserolbestand av de ønskede stammene (Tabell 2) (som inneholder genet av interesse) inn i YEB. Initier kulturer for alle Agrobacterium-stammene i denne analysen samtidig. Inkuber celler ved å riste i 1-2 dager ved 28 °C og 200 o/min til en OD600 på ca. 1,0.</li>
		<li>Pipette ca 300 μl av hver Agrobacterium stamme og spre dem på LB faste agar middels plater supplert med passende antibiotika og inkubere celler ved 28 °C i 1-2 dager.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infeksjoner: Bruk en spatel for å samle Agrobacterium kulturen i platen. Dypp en tannpirker i tre i Agrobacterium-kulturen på spatelen og pierce bladene for å inokulere store mengder bakterier. Inokuler minst tre planter for hver stamme. Bruk tre blader per plante for å tjene som triplikater. I hvert blad, gjør flere inokulasjonssteder for hver stamme.</li>
	<li>Scoring: Få makroskopiske svar omtrent to uker etter inokulering (Figur 3). For skjermer med høy gjennomstrømning registrerer du de kvalitative svarene (ja/nei) for hvert inokulasjonssted. Deretter beregner du prosentandelen av områder som svarer, og sammenligner dem med kontroller.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+exploiting+late+blight+resistance+in+the+age+of+effectors.">Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).</li><li>Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+discovery+and+functional+analysis+of+effector+proteins+of+fungal+and+oomycete+plant+pathogens.">Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+genomics+accelerates+discovery+and+functional+profiling+of+potato+disease+resistance+and+Phytophthora+infestans+avirulence+genes.">Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes.</a> Plos One. 3, 1-10 (2008).</li><li>Oh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+screens+of+Phytophthora+infestans+RXLR+effectors+reveal+diverse+phenotypes,+including+activation+of+the+Solanum+bulbocastanum+disease+resistance+protein+Rpi-blb2.">In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2.</a> Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).</li><li>Tyler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+genome+sequences+uncover+evolutionary+origins+and+mechanisms+of+pathogenesis.">Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis.</a> Science. 313, 1261-1266 (2006).</li><li>Haas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+and+analysis+of+the+Irish+potato+famine+pathogen+Phytophthora+infestans.">Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans.</a> Nature. 461, 393-398 (2009).</li><li>Levesque, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+necrotrophic+plant+pathogen+Pythium+ultimum+reveals+original+pathogenicity+mechanisms+and+effector+repertoire.">Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire.</a> Genome Biol. 11, 1-22 (2010).</li><li>Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+genomics:+new+insights+and+future+directions.">Oomycete genomics: new insights and future directions.</a> FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).</li><li>Stassen, J. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+identification+in+the+lettuce+downy+mildew+Bremia+lactucae+by+massively+parallel+transcriptome+sequencing.">Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing.</a> Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).</li><li>Kemen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gain+and+loss+during+evolution+of+obligate+parasitism+in+the+white+rust+pathogen+of+Arabidopsis+thaliana.">Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).</li><li>Win, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. , 1-13 (2012).</li><li>Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+effector+biology+of+plant-associated+organisms.">Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 115-122 (2009).</li><li>Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+catalogue+of+the+effector+secretome+of+plant+pathogenic+oomycetes.">A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006).</li><li>van der Hoorn, R. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+is+a+versatile+tool+that+facilitates+comparative+analyses+of+Avr9/Cf-9-induced+and+Avr4/Cf-4-induced+necrosis.">Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 439-446 (2000).</li><li>Dangl, J. L., Jones, J. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+and+integrated+defence+responses+to+infection.">Plant pathogens and integrated defence responses to infection.</a> Nature. 411, 826-833 (2001).</li><li>Kapila, J., de Rycke, R., van Montagu, M., Angenon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+system+for+intact+leaves.">An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves.</a> Plant Sci. 122, 101-108 (1997).</li><li>Kanneganti, T. D., Huitema, E., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+of+oomycete+and+fungal+genes.">In planta expression of oomycete and fungal genes.</a> Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).</li><li>Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H., Lamour, K., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+systems.+Oomycete+Genetics+and+Genomics.">In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics.</a> Diversity, Interactions, and Research Tools. 23, 455-475 (2009).</li><li>Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenolic+recognition+profiles+of+the+Agrobacterium+tumefaciens+VirA+protein+are+broadened+by+a+high+level+of+the+sugar+binding+protein+ChvE.">The phenolic recognition profiles of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein are broadened by a high level of the sugar binding protein ChvE.</a> J. Bacteriol. 180, 5632-5638 (1998).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+virus-induced+gene+silencing+implicates+heat+shock+protein+90+in+plant+disease+resistance.">High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance.</a> EMBO J. 22, 5690-5699 (2003).</li><li>Ma, L., Lukasik, E., Gawehns, F., Takken, F. L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+agroinfiltration+for+transient+expression+of+plant+resistance+and+fungal+effector+proteins+in+Nicotiana+benthamiana+leaves.">The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves.</a> Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).</li><li>Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., An&#233;, J. M., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+and+silencing:+A+rapid+tool+for+functional+gene+assay+in+potato.">Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato.</a> Plos One. 4, 1-8 (2009).</li><li>van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ternary+transformation+system:+constitutive+virG+on+a+compatible+plasmid+dramatically+increases+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+enabled+the+isolation+of+the+R3a+late+blight+resistance+gene+in+potato.">Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato.</a> Plant J. 42, 251-261 (2005).</li><li>Armstrong, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancestral+oomycete+locus+contains+late+blight+avirulence+gene+Avr3a,+encoding+a+protein+that+is+recognized+in+the+host+cytoplasm.">An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+spectrum+late+blight+resistance+in+potato+differential+set+plants+MaR8+and+MaR9+is+conferred+by+multiple+stacked+R+genes.">Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes.</a> Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).</li><li>Torto, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EST+mining+and+functional+expression+assays+identify+extracellular+effector+proteins+from+the+plant+pathogen+Phytophthora.">EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora.</a> Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfection-based+high-throughput+screening+reveals+specific+recognition+of+INF+elicitins+in+Solanum.">Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum.</a> Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).</li><li>Koncz, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoter+of+TL-DNA+gene+5+controls+the+tissue-specific+expression+of+chimeric+genes+carried+by+a+novel+type+of+agrobacterium+binary.">The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary.</a> Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+transformation-competent+Arabidopsis+genomic+library+in+Agrobacterium.">A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium.</a> Bio-Technol. 9, 963-967 (1991).</li><li>Rietman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel avirulence and potato resistance gene candidates revealed [PhD thesis]. , (2011).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li><li>van engelen, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pBINPLUS+-+an+improved+plant+transformation+vector+based+on+pBIN19.">pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19.</a> Transgenic Res. 4, 288-290 (1995).</li><li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATEWAYTM+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).</li><li>Xiang, C. B., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., Oliver, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mini+binary+vector+series+for+plant+transformation.">A mini binary vector series for plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).</li><li>Curtis, M. D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gateway+cloning+vector+set+for+high-throughput+functional+analysis+of+genes+in+planta.">A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta.</a> Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).</li></ol>

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Forbigående analyser som agroinfiltrasjon og agroinfeksjon er effektive metoder som er avgjørende for moderne molekylær plantepatologiforskning. Til tross for noen begrensninger oppfyller disse metodene etterspørselen etter effektiv og robust funksjonell analyse med høy gjennomstrømning i anlegg.
Agroinfiltrasjonssystemet er en mye brukt funksjonell analyse i en rekke plantearter. Agroinfiltrasjon letter levering av flere transgenes i samme celle med samtidig uttrykk for interagerende proteiner. Dette er fordelaktig for å rekapitlere R-AVR-relasjoner, ved å myntfiltrere Agrobacterium-stammer som uttrykker Avr-gener med stammer som uttrykker de matchende R-genene. Også for kjente R-AVR-par kan slike myntfiltreringer brukes som positive kontroller. Å inkludere slike kontroller er viktig fordi i noen plantegenotyper kan transformasjonseffektiviteten være under terskelen for å oppdage svar. Inkludert negative kontroller, for eksempel en Agrobacterium-stamme som inneholder en vektor uten geninnsats, er også viktig for å avgjøre om en bestemt plantegenotype øker ikke-spesifikke forsvarsresponser på Agrobacterium. Denne funksjonen forekommer med en viss frekvens i potetkimplasma, og ikke alle Solanum-arter er godt egnet for dette Agrobacterium-baserteuttrykkssystemet. Generelt fungerer agroinfiltrasjonsanalysen veldig bra i N. benthamiana og de fleste potetgenotyper. I tillegg til effektoromics er det forskjellige andre potensielle applikasjoner for agroinfiltrasjonsteknikken, for eksempel produksjon av proteiner fra transgenes og proteinlokalisering i planteceller ved konfokal mikroskopi.
PVX agroinfection er et svært følsomt screeningsystem og vanligvis mer egnet for screening av høy gjennomstrømning. Siden Agrobacterium nå bare er lokalt til stede, er ikke-spesifikke svar på denne bakterien nå ikke veldig forstyrrende, da PVX-viruset overtar videre spredning av transgene. Planter kan imidlertid være motstandsdyktige mot PVX, eller montere ekstrem motstand (ER) respons, og i så fall er agroinfection-metoden ikke egnet. En annen begrensning ved PVX agroinfection-metoden er innsatsstørrelsen på genet av interesse. Observerte fenotyper av svar kan variere fra en intens svart nekrose rundt såret til svak nekrose nær inokulasjonsstedet. I både N. benthamiana- og Solanum-arter er PVX agroinfection anerkjent som mer følsom enn agroinfiltrasjon.
Med tanke på at den genetiske bakgrunnen til de forskjellige testede plantegenotypene kan ha noen begrensninger (se ovenfor), oppnår vi generelt lignende konklusjoner ved PVX-agroinfeksjon og agroinfiltrasjon. Disse resultatene er også sammenlignbare som oppnådd i andre analyser, for eksempel proteininfiltrasjoner29 og ELISA3. Tatt i betraktning fordelene og begrensningene til begge systemene, anbefaler vi at du bruker begge metodene for å enten utfylle hverandre eller bekrefte uavhengige resultater.

Effectoromics, en høy-gjennomstrømning funksjonell genomikk tilnærming har nylig dukket opp som et kraftig verktøy for å identifisere resistens (R) gener i avlinger planter og matchende avirulens (Avr) gener av patogener1-4. I motsetning til den mer tidkrevende stabile transformasjonen med R-gener, er effektoromics-strategien basert på forbigående analyser av patogengensekvenser.
Siden genomikktiden har genomer av plantepatogener blitt utforsket mye. For eksempel for oomycetes, som inkluderer de mest ødeleggende plantepatogenene, har store samlinger av sekvenser blitt generert og analysert for gener som spiller en rolle under samspillet med planten5-10. En klasse av patogenproteiner representerer effektorer, som manipulerer vertscellestruktur og funksjon enten for å lette infeksjon (virulensfaktorer) eller for å utløse forsvarsresponser (avirulensfaktorer)11-13. Uttrykk for Avr-gener i planteceller som inneholder R-gener resulterer vanligvis i den overfølsomme celledødsresponsen (HR)14,15. I planta uttrykk for R og Avr gener kan oppnås ved hjelp av forbigående uttrykk systemer som Agrobacterium tumefaciens -basert forbigående transformasjon (agroinfiltrasjon)16. Denne forbigående transformasjonen kan også brukes i kombinasjon med virale uttrykkssystemer (agroinfection)17,18.
For agroinfiltrasjon er det mest brukte middelet A . tumefaciens, et bredt vertsområde patogen av dikotplanter. En . tumefaciens inneholder en tumorinduserende (Ti) plasmid. Overfør DNA (T-DNA) fra en Ti plasmid vil omfordele seg til plantecellene etter at virulensmaskineriet til bakterien er aktivert. Dette kan utløses i sårede planteceller, av de frigjorte lavmolekylære fenolforbindelser og monosaccharaides i et litt surt miljø19. Virulensgenet aktiveres etter infiltrasjon av Agrobacterium suspensjoner i bladpaneler definert av store årer. Deretter vil planteceller i bladpanelene bli forvandlet og uttrykke transgene (e) som finnes i T-DNA-regionen.
Agroinfection er basert på sårinokulert Agrobacterium, som formidler translokasjon av et virus til planteceller. Viruset sprer seg deretter videre til tilstøtende plantevev, i fravær av Agrobacterium. For agroinfection kan flere plantevirus brukes. RNA-virus er ideelle vektorer for genuttrykk fordi de kan formere seg til svært høye nivåer i infiserte planter. Blant plante RNA-virus er Potato Virus X (PVX) mye brukt til effektoromics-skjermer. For å lette funksjonelle tester for et innsatt gen ble binære vektorer som inneholder PVX-genomet flankert av Blomkålmosaikkviruset 35S-promotoren og nopaline synthase terminator, klonet inn i T-DNA av A. tumefaciens20. Etter at T-DNA er overført til planteceller, transkriberes PVX-genomet i T-DNA fra 35S-promotoren. Deretter sprer viruspartikler seg systemisk i de infiserte plantene, noe som resulterer i uttrykk for det innsatte genet. Denne metoden basert på både Agrobacterium og PVX kalles PVX agroinfection.
Her viser vi eksempler for både agroinfiltrasjon og PVX agroinfection analyser. Som vertsplanter bruker vi potetkimplasma (Solanum seksjon Petota), for hvilke effectoromics tilnærminger har vært banebrytende og bevist vellykket3,4. Vi bruker også Nicotiana benthamiana, som er kjent som et modellanlegg i Solanaceous planter14,21,22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Beef extract</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">B4888</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Bacteriological peptone</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0037</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0021</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MgSO4</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">208094</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MS salts (without vitamins)</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M0221</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MES</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M1503</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">LB broth powder</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">L3022</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D134406</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Syringe (1 ml)</td>
			<td style="width:267px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;">300013</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Incubator</td>
			<td style="width:267px;">Infors HT</td>
			<td style="width:219px;">Multitron II</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:267px;">Heraeus</td>
			<td style="width:219px;">Multifuge 3S-R</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:219px;">Biophotometer 6131</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agroinfiltration and pvx agroinfection in potato and nicotiana benthamiana

Agroinfiltrasjon og PVX-agroinfeksjon er to effektive forbigående uttrykksanalyser for funksjonell analyse av kandidatgener i planter. Det mest brukte middelet for agroinfiltrasjon er Agrobacterium tumefaciens, et patogen av mange dikotplantearter. Dette innebærer at agroinfiltrasjon kan brukes på mange plantearter. Her presenterer vi våre protokoller og forventede resultater når du bruker disse metodene på potet (Solanum tuberosum), dens relaterte vill tuberbærende Solanum-arter (Solanum-delen Petota) og modellanlegget Nicotiana benthamiana. I tillegg til funksjonell analyse av enkeltgener, for eksempel resistens (R) eller avirulens (Avr) gener, er agroinfiltrasjonsanalysen veldig egnet for å rekapitulere R-AVR-interaksjonene forbundet med spesifikke vertspatogeninteraksjoner ved ganske enkelt å levere R- og Avr-transgenes inn i samme celle. Noen plantegenotyper kan imidlertid øke ikke-spesifikke forsvarsresponser på Agrobacterium, som vi for eksempel observerte for flere potetgenotyper. Sammenlignet med agroinfiltrasjon er deteksjon av AVR-aktivitet med PVX agroinfection mer følsom, mer høy gjennomstrømning i funksjonelle skjermer og mindre følsom for ikke-spesifikke forsvarsresponser på Agrobacterium. Imidlertid kan ikke-spesifikk forsvar mot PVX oppstå, og det er fare for å gå glipp av svar på grunn av virusindusert ekstrem motstand. Til tross for slike begrensninger, er agroinfiltrasjon og PVX-agroinfeksjon etter vår erfaring både egnede og komplementære analyser som kan brukes samtidig for å bekrefte hverandres resultater.

Figur 1 viser et representativt eksperiment av agroinfiltrasjon med 7 forskjellige effektorer (E1-E7) i potet og N. benthamiana. Celledød vises i de infiltrerte bladpanelene ca 3 dager etter infiltrasjon. Omfanget av celledødsfenotypen må sammenlignes med kontrollene. En blanding av Agrobacterium stammen AGL1 (pVirG)23 inneholder pBINplus-R3a og pK7WG2-AVR3a ble brukt som positiv kontroll24,25, mens AGL1 (pVirG) ble brukt som negativ kontroll. Figur 1A og 1B viser gode eksempler på agroinfiltrasjon i potetgenotypen MaR8 (Mastenbroek R8)26 og N. benthamiana, som er svært mottagelige for agroinfiltrasjon. Det er sammenfallende celledød i bladpanelet myntfiltrert med positiv kontroll, mens ingen celledødsrespons oppstår med negativ kontroll eller pBINplus-R3a. I MaR8 induserer to effektorer AVR3a (E2) og AVR4 (E3) en celledød, mens de andre effektorene (E1 og E4-E7) ikke gjør det. I N. benthamiana induserer ingen av de testede effektorene en celledødsrespons. Figur 1C og 1D viser eksempler på agroinfiltrasjon i villpotet Solanum berthaultii 483-1 og Solanum rechei 210-5, som ikke er godt egnet for agroinfiltrasjonsteknikken. I S. berthaultii 483-1 viser bladvevet en ikke-spesifikk nekrose til negative kontroller så vel som til alle testede effektorer. I S. rechei 210-5 viser infiltrerte bladpaneler svært svak celledødsrespons på positiv kontroll.
Figur 2 viser en rekke skåringsskalaer som kan brukes til å kvantifisere responsen på agroinfiltrated Agrobacterium. Prosentandeler av celledød er avbildet på en skala 0-100%. Observerte fenotyper spenner fra makroskopisk ikke synlige symptomer (0%), gjennom en rekke mellomliggende responser som viser klorose og økende nivåer av celledød, opp til konfluent celledød (100%).
Figur 3 viser et representativt eksperiment etter PVX-agroinfeksjon i potet. Normalt kan ekspanderende celledød bli funnet på stedene omtrent to uker etter tannplukking inokulering. Som vist i begge figurpanelene, er ekspanderende celledød til stede på stedene som var tannplukk inokulert med pGR106-CRN2 (positiv kontroll ved hjelp av effektor crinkler Crn2), som er en generell celledød induserende gen fra P. infestans27. Bortsett fra mindre respons på såring, er det ikke notert noen ekspanderende celledød på stedene som var tannplukk inokulert med pGR106-tom (negativ kontroll). I figur 3A, som representerer potetgenotypen MaR3 (Mastenbroek R3), induserte ikke to pGR106-effektorer (E1 og E2) celledød. I figur 3Bpresenteres et positivt resultat av effektorscreening i naturen Solanum huancabambense 354-1; celledødsrespons ble observert til to pGR106-effektorer (E1-E3, som representerer elicitins)28.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1.jpg"> Figur 1. Eksempler på agroinfiltrasjon i potet og N. benthamiana. Planter inkludert (A) en potetgenotype MaR8 (Mastenbroek R8), (B) N. benthamiana, ( C) Solanum berthaultii 483-1 og (D) Solanum rechei 210-5 ble infiltrert med en blanding av Agrobacterium stammen AGL1 (pVirG) 23 som inneholder pBINplus-R3a og pK7WG2-AVR3a (positiv kontroll), AGL1 (pvirG) (negativ kontroll), pBINPlus-R og syv effektorer (E1-E7). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å vise større bilde</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2.jpg"> Figur 2. Kvantifisering av agroinfiltrasjonsresponser. Bildet viser representative skåringsskalaer for celledød, alt fra 0% (ingen symptomer) til 100% (konfluent celledød). Mellomliggende svar spenner fra svake responser som klorose til økende nivåer av celledød. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å vise større bilde</a>.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3.jpg"> Figur 3. Eksempler på PVX agroinfection i potet. Potetgenotype MaR3 (Mastenbroek R3) (A) og Solanum huancabambense 354-1 (B) tannplukk inokulert med pGR106-CRN2 (positiv kontroll), pGR106-tom (negativ kontroll) og pGR106-E1-2 (effektorer) eller pGR106-E1-E3, henholdsvis. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å vise større bilde</a>.
Tabell 1. YEB-medium
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>1 L</td>
			<td>destillert H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>sukrose</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>biff ekstrakt</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>bakteriologisk peptone</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 g</td>
			<td>gjærekstrakt</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ml</td>
			<td>MgSO4 (1 M)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2. Vektorer og stammer som brukes til agroinfiltrasjon og PVX agroinfeksjon. Flere binære vektorer kan brukes. Vektorer i listen nedenfor tillater høyt uttrykk for kandidatgenene og har fungert godt i våre hender. Vi foretrekker å bruke Agrobacterium-stammen GV3101(pMP90)29 i N. benthamiana og finne AGL130 som inneholder hjelperen plasmid pVirG (pBBR1MCS-5.virGN54D)23 mer egnet i potet31. Ytterligere stammer har blitt analysert i andre grupper på ulike modellplanter, inkludert N. benthamiana, men ikke i potet32.
<img alt="Table 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table2.jpg">
GW: gateway versjon36
Tabell 3. MMA-medium. <img alt="Table 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table3.jpg">
Juster pH til 5,6.

Watch this Scientific Journal Video about Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltrasjon og PVX agroinfeksjon er rutinemessige funksjonelle analyser for forbigående ektopisk uttrykk for gener i planter. Disse metodene er effektive analyser i effektoromics strategier (rask motstand og avirulens genoppdagelse) og avgjørende for moderne forskning innen molekylær plantepatologi. De oppfyller etterspørselen etter robust funksjonell analyse med høy gjennomstrømning i anlegg.

Agroinfiltrasjon og PVX Agroinfection i Potet og Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Research

JoVE Journal

Biology

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Effektiv Agroinfiltration of Plants for High-level Forbigående Expression of rekombinante proteiner

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimalisering og utnyttelse av<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediert Transient Protein Produksjonen i<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Forsamlingen og anvendelse av &#39;Skjær Rings&#39;: A Novel endotel modell for Orbital, Enveis og Periodisk Fluid Flow og skjærspenning

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging analysen i Nicotiana benthamiana blader for Transiently bestemme Protein-protein samhandling Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Plante-mikrobe samhandling: Transcriptional svar av Bacillus Mycoides potet Root eksudater

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Produksjon av IgG Fusion Proteiner Forbigående Uttrykt i Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Quantifying Cell Death Initiation Through Continuous Imaging

Studying Cell Death Initiation Using a Digital Microscope

A Streamlined Approach to Studying Cell Death Initiation in Hypersensitive Response (Video) | JoVE

Studerer celledødsinitiering ved hjelp av et digitalt mikroskop

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as ...

An Experimental Study on Colorado Potato Beetle Hibernation Under Natural Conditions

En eksperimentell studie på Colorado potetbille dvale under naturlige forhold

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and ...

In Planta Transient Transformation of Cacao Plants Using Agrobacterium tumefaciens

Vacuum-Forced Agroinfiltration for In planta Transformation of Recalcitrant Plants: Cacao as a Case Study

Author Spotlight: Tissue Culture-Free Agrobacterium-Mediated Transformation in Large Woody Plants

Transient in planta transformation is a fast and cost-effective alternative for plant genetic transformation. Most protocols for in planta transformation ...