Name: agroinfiltration and pvx agroinfection in potato and nicotiana benthamiana
Uploaded: 2014-01-03T19:45:00
Duration: 7 min 33 s
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O trabalho é parcialmente apoiado pelo Wageningen University Fund (WUF), China Scholarship Council Program for Graduate Students e uma bolsa NWO-VIDI 12378.

1. Condições de cultivo e teste de plantas
<ol><li>Cultivar e manter plantas em estufas controladas ou câmaras climáticas dentro da faixa de temperatura de 18-22 °C e sob regime de luz natural ou com um regime dia/noite de 16 horas/8 horas. Remova os ramos axilares para tornar as plantas mais gerenciáveis.</li>
	<li>Para batata, mantenha plantlets in vitro em frascos plásticos estéreis contendo meio Murashige-Skoog (MS) (20 g/L sacarose, 5 g/L MS sais com vitaminas, 8 g/L agar, pH 5.8) em condições controladas em câmaras climáticas a 18 °C com regime dia/noite de 16 horas/8 por duas semanas e depois transferi-los para potes de solo esterilizado em compartimentos de estufa regulados.</li>
</ol>2. Agroinfiltração
<ol><li>Material vegetal: Para Nicotiana benthamiana,use cerca de 4-5 semanas de plantas cultivadas com sementes. Para batata, use em torno de 4-5 semanas de transplantes de in vitro. Escolha folhas jovens, saudáveis e totalmente desenvolvidas para infiltrações.</li>
	<li>
Cultura de agrobacterium:<ol>
<li>Prepare o meio YEB com antecedência(Tabela 1). Encha os tubos de 50 ml com 10 ml de yeb médio suplementado com acetossiingona de 1 μl (200 mM), 100 μl de tampão MES (2-(N-morpholino)-ácido sulfônico de etano, 1 M) e os antibióticos apropriados. Pipeta 20 μl de glicerol das cepas desejadas(Tabela 2) (contendo o gene de interesse) no YEB. Inicie culturas para todas as cepas de Agrobacterium neste ensaio ao mesmo tempo. Incubar células agitando por 1-2 dias a 28 °C e 200 rpm a um OD600 de aproximadamente 1.0.</li>
		<li>Células de colheita por centrifugação a 3.000 x g por 10 min. Despeje o supernasce e resuspenda a pelota em meio MMA recém-feito(Tabela 3) a um OD600 de 0,3. Células de vórtice suavemente para resuspensá-las. Para a coinfiltração de duas cepas bacterianas, misture a cultura em uma proporção de 1:1.</li>
		<li>Deixe a cultura no banco em temperatura ambiente por 1-6 horas antes das infiltrações. Enquanto isso, rotule as plantas para serem infiltradas e a data do experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infiltrações: Use uma seringa sem agulha de 1 ml para se infiltrar nas suspensões agrobacterium. Injete cuidadosamente e lentamente os painéis de folha com as suspensões da seringa (por razões de saúde e segurança, a proteção dos olhos deve ser usada durante este processo). Infiltrar-se em pelo menos três plantas para cada cepa. Use três folhas por planta para servir como triplicados. Nota: Normalmente, 1 ml de suspensão de Agrobacterium pode ser suficiente para 3 plantas de N. benthamiana. Para a batata, mais suspensão é necessária porque as folhas das espécies de Solanum são mais difíceis de se infiltrar. Os volumes necessários de suspensões dependem da espécie Solanum. Evite a contaminação cruzada trocando luvas ou esterilizando luvas com etanol entre infiltrações e não regando as plantas até o dia seguinte à inoculação.</li>
	<li>Marcar: Respostas macroscópicas de pontuação cerca de 3 dias após a infiltração quando o fenótipo de morte celular é claro(Figura 1). Se o fenótipo de morte celular for quantitativo, utilize os critérios determinados(Figura 2). Resumidamente, as escalas para pontuação macroscópica da morte celular dependem principalmente dos percentuais de morte celular da área infiltrada. Os percentuais de morte celular são retratados em uma escala de 0% (sem sintomas) a 100% (morte celular confluente). As respostas intermediárias variam de respostas fracas, como clorose, a níveis crescentes de morte celular. Se desejar, a pontuação macroscópica também pode ser avaliada quantitativamente usando equipamentos modernos de fotodesfotografia.</li>
</ol>3. Agroinfecção PVX
<ol><li>Material vegetal: Para N. benthamiana,use cerca de 2-3 semanas de plantas cultivadas com sementes. Para batata, use cerca de 2-3 semanas de transplantes de in vitro. Para testes em larga escala, use plantas ligeiramente mais antigas (4-5 semanas), pois essas plantas têm folhas cada vez maiores para acomodar um número maior de pontos de inoculação de Agrobacterium.</li>
	<li>
Cultivo de agrobacteria: <ol>
<li>Prepare o meio YEB com antecedência. Encha os tubos de 10 ml com 3 ml de YEB complementados com os antibióticos apropriados. Pipeta 20 μl de glicerol das cepas desejadas(Tabela 2) (contendo o gene de interesse) no YEB. Inicie culturas para todas as cepas de Agrobacterium neste ensaio ao mesmo tempo. Incubar células agitando por 1-2 dias a 28 °C e 200 rpm a um OD600 de aproximadamente 1.0.</li>
		<li>Pipeta cerca de 300 μl de cada cepa agrobacterium e espalhá-los em placas médias de ágar sólido LB complementadas com os antibióticos apropriados e incubar células a 28 °C por 1-2 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infecções: Use uma espátula para coletar a cultura Agrobacterium na placa. Mergulhe um palito de madeira na cultura Agrobacterium na espátula e fure as folhas para inocular grande quantidade de bactérias. Inocular pelo menos três plantas para cada cepa. Use três folhas por planta para servir como triplicados. Em cada folha, faça vários locais de inoculação para cada cepa.</li>
	<li>Marcar: Respostas macroscópicas de pontuação cerca de duas semanas após a inoculação(Figura 3). Para telas de alta produtividade, regis qualitativos (sim/não) para cada ponto de inoculação. Em seguida, calcule a porcentagem de sites de resposta e compare-os com controles.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+exploiting+late+blight+resistance+in+the+age+of+effectors.">Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).</li><li>Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+discovery+and+functional+analysis+of+effector+proteins+of+fungal+and+oomycete+plant+pathogens.">Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+genomics+accelerates+discovery+and+functional+profiling+of+potato+disease+resistance+and+Phytophthora+infestans+avirulence+genes.">Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes.</a> Plos One. 3, 1-10 (2008).</li><li>Oh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+screens+of+Phytophthora+infestans+RXLR+effectors+reveal+diverse+phenotypes,+including+activation+of+the+Solanum+bulbocastanum+disease+resistance+protein+Rpi-blb2.">In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2.</a> Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).</li><li>Tyler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+genome+sequences+uncover+evolutionary+origins+and+mechanisms+of+pathogenesis.">Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis.</a> Science. 313, 1261-1266 (2006).</li><li>Haas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+and+analysis+of+the+Irish+potato+famine+pathogen+Phytophthora+infestans.">Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans.</a> Nature. 461, 393-398 (2009).</li><li>Levesque, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+necrotrophic+plant+pathogen+Pythium+ultimum+reveals+original+pathogenicity+mechanisms+and+effector+repertoire.">Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire.</a> Genome Biol. 11, 1-22 (2010).</li><li>Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+genomics:+new+insights+and+future+directions.">Oomycete genomics: new insights and future directions.</a> FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).</li><li>Stassen, J. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+identification+in+the+lettuce+downy+mildew+Bremia+lactucae+by+massively+parallel+transcriptome+sequencing.">Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing.</a> Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).</li><li>Kemen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gain+and+loss+during+evolution+of+obligate+parasitism+in+the+white+rust+pathogen+of+Arabidopsis+thaliana.">Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).</li><li>Win, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. , 1-13 (2012).</li><li>Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+effector+biology+of+plant-associated+organisms.">Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 115-122 (2009).</li><li>Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+catalogue+of+the+effector+secretome+of+plant+pathogenic+oomycetes.">A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006).</li><li>van der Hoorn, R. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+is+a+versatile+tool+that+facilitates+comparative+analyses+of+Avr9/Cf-9-induced+and+Avr4/Cf-4-induced+necrosis.">Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 439-446 (2000).</li><li>Dangl, J. L., Jones, J. D. 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D., Huitema, E., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+of+oomycete+and+fungal+genes.">In planta expression of oomycete and fungal genes.</a> Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).</li><li>Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H., Lamour, K., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+systems.+Oomycete+Genetics+and+Genomics.">In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics.</a> Diversity, Interactions, and Research Tools. 23, 455-475 (2009).</li><li>Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+agroinfiltration+for+transient+expression+of+plant+resistance+and+fungal+effector+proteins+in+Nicotiana+benthamiana+leaves.">The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves.</a> Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).</li><li>Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., An&#233;, J. M., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+and+silencing:+A+rapid+tool+for+functional+gene+assay+in+potato.">Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato.</a> Plos One. 4, 1-8 (2009).</li><li>van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ternary+transformation+system:+constitutive+virG+on+a+compatible+plasmid+dramatically+increases+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+enabled+the+isolation+of+the+R3a+late+blight+resistance+gene+in+potato.">Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato.</a> Plant J. 42, 251-261 (2005).</li><li>Armstrong, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancestral+oomycete+locus+contains+late+blight+avirulence+gene+Avr3a,+encoding+a+protein+that+is+recognized+in+the+host+cytoplasm.">An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+spectrum+late+blight+resistance+in+potato+differential+set+plants+MaR8+and+MaR9+is+conferred+by+multiple+stacked+R+genes.">Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes.</a> Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).</li><li>Torto, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EST+mining+and+functional+expression+assays+identify+extracellular+effector+proteins+from+the+plant+pathogen+Phytophthora.">EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora.</a> Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfection-based+high-throughput+screening+reveals+specific+recognition+of+INF+elicitins+in+Solanum.">Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum.</a> Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).</li><li>Koncz, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoter+of+TL-DNA+gene+5+controls+the+tissue-specific+expression+of+chimeric+genes+carried+by+a+novel+type+of+agrobacterium+binary.">The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary.</a> Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+transformation-competent+Arabidopsis+genomic+library+in+Agrobacterium.">A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium.</a> Bio-Technol. 9, 963-967 (1991).</li><li>Rietman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel avirulence and potato resistance gene candidates revealed [PhD thesis]. , (2011).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li><li>van engelen, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pBINPLUS+-+an+improved+plant+transformation+vector+based+on+pBIN19.">pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19.</a> Transgenic Res. 4, 288-290 (1995).</li><li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATEWAYTM+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).</li><li>Xiang, C. B., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., Oliver, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mini+binary+vector+series+for+plant+transformation.">A mini binary vector series for plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).</li><li>Curtis, M. D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gateway+cloning+vector+set+for+high-throughput+functional+analysis+of+genes+in+planta.">A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta.</a> Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Ensaios transitórios como agroinfiltração e agroinfecção são métodos eficientes que são vitais para a pesquisa moderna de patologia molecular vegetal. Apesar de algumas limitações, esses métodos atendem à demanda por análises funcionais eficientes e robustas de alto rendimento nas plantas.
O sistema de agroinfiltração é um ensaio funcional amplamente utilizado em uma variedade de espécies vegetais. A agroinfiltração facilita a entrega de vários transgenes na mesma célula com expressão simultânea de proteínas interativas. Isso é vantajoso para recapitular as relações R-AVR, por cunhar cepas de Agrobacterium que expressam genes Avr com cepas que expressam os genes R correspondentes. Além disso, para pares R-AVR conhecidos, tais coinfiltrações podem ser usadas como controles positivos. Incluir tais controles é importante porque em alguns genótipos de plantas, a eficiência de transformação pode estar abaixo do limiar para detectar respostas. A inclusão de controles negativos, por exemplo, uma cepa de Agrobacterium contendo um vetor sem uma inserção genética, também é essencial para determinar se um determinado genótipo vegetal levanta respostas de defesa inespecíficas ao Agrobacterium. Essa característica ocorre em uma certa frequência no germoplasma da batata, e nem todas as espécies de Solanum são adequadas para este sistema de expressão baseado em Agrobacterium. Geralmente, o ensaio de agroinfiltração funciona muito bem em N. benthamiana e na maioria dos genótipos de batata. Além da efetivação da biodinâmica, existem várias outras aplicações potenciais para a técnica de agroinfiltração, como a produção de proteínas a partir de transgenes e localização de proteínas em células vegetais por microscopia confocal.
A agroinfecção PVX é um sistema de triagem altamente sensível e tipicamente mais adequado para triagens de alto rendimento. Uma vez que o Agrobacterium está agora apenas localmente presente, as respostas inespecíficas a esta bactéria não são agora muito perturbadoras, uma vez que o vírus PVX assume uma maior disseminação do transgene. No entanto, as plantas podem ser resistentes ao PVX, ou montar respostas de resistência extrema (ER), e nesse caso o método de agroinfecção não é adequado. Outra limitação do método de agroinfecção PVX é o tamanho da inserção do gene de interesse. Fenótipos observados de respostas podem variar de uma intensa necrose negra ao redor da ferida até necrose fraca perto do ponto de inoculação. Tanto nas espécies N. benthamiana quanto solanum, a agroinfecção PVX é reconhecida como mais sensível do que a agroinfiltração.
Mantendo em conta que o fundo genético dos diversos genótipos vegetais testados pode ter algumas restrições (veja acima), geralmente obtemos conclusões semelhantes por agroinfecção pvx e agroinfiltração. Esses resultados também são comparáveis como obtidos em outros ensaios, como infiltrações proteicas29 e ELISA3. Considerando as vantagens e limitações de ambos os sistemas, recomendamos usar ambos os métodos para complementar um ao outro ou confirmar resultados independentes.

Effectoromics, uma abordagem genômica funcional de alto rendimento surgiu recentemente como uma poderosa ferramenta para identificar genes de resistência (R) em plantas de cultura e avirulência correspondente(Avr) genes de patógenos1-4. Em contraste com a transformação estável mais demorada com genes R, a estratégia de efeitosomómicas é baseada em ensaios transitórios de sequências genéticas patógenas.
Desde a era genômica, genomas de patógenos vegetais têm sido amplamente explorados. Por exemplo, para oomycetes, que incluem os patógenos vegetais mais devastadores, grandes coleções de sequências foram geradas e analisadas para genes que desempenham um papel durante a interação com a planta5-10. Uma classe de proteínas patógenas representa os efeitos, que manipulam a estrutura e a função das células hospedeiras, seja para facilitar a infecção (fatores de virulência) ou para desencadear respostas de defesa (fatores de avirulência)11-13. Expressão de genes Avr em células vegetais contendo genes R geralmente resulta na resposta de morte celular hipersensível (HR)14,15. Na expressão de planta de genes R e Avr pode ser realizada utilizando sistemas de expressão transitória, como tumefaciens agrobacterium -transformação transitória baseada (agroinfiltração)16. Essa transformação transitória também pode ser aplicada em combinação com sistemas de expressão viral (agroinfecção)17,18.
Para a agroinfiltração, o agente mais usado é a A . tumefaciens, um amplo patógeno de gama hospedeira de plantas dicot. A . tumefaciens contém um plasmídeo indutor de tumor (Ti). Transferir DNA (T-DNA) de um plasmídeo ti será translocado para as células vegetais depois que o maquinário de virulência da bactéria for ativado. Isso pode ser desencadeado em células vegetais feridas, pelos compostos fenólicos de baixo peso molecular e monossacaraides em um ambiente ligeiramente ácido19. O gene da virulência é ativado após a infiltração de suspensões de Agrobacterium em painéis de folhas definidos por veias principais. Em seguida, as células vegetais nos painéis das folhas serão transformadas e expressarão os transgenes contidos na região do T-DNA.
A agroinfecção é baseada no Agrobacteriuminoculado de feridas, que media a translocação de um vírus para células vegetais. O vírus então se espalha ainda mais para tecidos vegetais adjacentes, na ausência de Agrobacterium. Para a agroinfecção, vários vírus vegetais podem ser usados. Os vírus RNA são vetores ideais para a expressão genética porque podem se multiplicar a níveis muito altos em plantas infectadas. Entre os vírus do RNA vegetal, o Vírus da Batata X (PVX) é amplamente utilizado para telas de efeitosomómicos. Para facilitar testes funcionais para um gene inserido, vetores binários que contêm o genoma PVX ladeado pelo promotor do vírus mosaico de couve-flor 35S e o exterminador de synthase nopaline, foram clonados no T-DNA de A. tumefaciens20. Depois que o T-DNA é transferido para células vegetais, o genoma PVX contido no T-DNA é transcrito pelo promotor do 35S. Em seguida, as partículas de vírus se espalham sistemicamente nas plantas infectadas, resultando na expressão do gene inserido. Este método baseado tanto na Agrobacterium quanto no PVX é chamado de agroinfecção PVX.
Aqui mostramos exemplos tanto para os ensaios de agroinfiltração quanto de agroinfecção PVX. Como plantas hospedeiras usamos germoplasma de batata ( seçãode solanum Petota),para a qual as abordagens de efeitos foram pioneiras e comprovadamente bem sucedidas3,4. Também utilizamos Nicotiana benthamiana, que é reconhecida como uma planta modelo em plantas solanáceas 14,21,22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Beef extract</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">B4888</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Bacteriological peptone</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0037</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0021</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MgSO4</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">208094</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MS salts (without vitamins)</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M0221</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MES</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M1503</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">LB broth powder</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">L3022</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D134406</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Syringe (1 ml)</td>
			<td style="width:267px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;">300013</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Incubator</td>
			<td style="width:267px;">Infors HT</td>
			<td style="width:219px;">Multitron II</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:267px;">Heraeus</td>
			<td style="width:219px;">Multifuge 3S-R</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:219px;">Biophotometer 6131</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agroinfiltration and pvx agroinfection in potato and nicotiana benthamiana

Agroinfiltração e agroinfecção PVX são dois ensaios eficientes de expressão transitória para análise funcional de genes candidatos em plantas. O agente mais usado para a agroinfiltração é o Agrobacterium tumefaciens, um patógeno de muitas espécies de plantas dicot. Isso implica que a agroinfiltração pode ser aplicada a muitas espécies vegetais. Aqui, apresentamos nossos protocolos e resultados esperados ao aplicar esses métodos à batata (Solanum tuberosum),suas espécies de Solanum com tubos selvagens relacionados (seçãode Solanum Petota) e a planta modelo Nicotiana benthamiana. Além da análise funcional de genes únicos, como genes de resistência (R) ou avirulência(Avr),o ensaio de agroinfiltração é muito adequado para recapitular as interações R-AVR associadas a interações específicas de patógenos hospedeiros, simplesmente fornecendo transgenes R e Avr na mesma célula. No entanto, alguns genótipos vegetais podem aumentar as respostas de defesa inespecíficas ao Agrobacterium,como observamos, por exemplo, para vários genótipos de batata. Em comparação com a agroinfiltração, a detecção da atividade de AVR com agroinfecção PVX é mais sensível, mais elevada em telas funcionais e menos sensível às respostas de defesa inespecíficas ao Agrobacterium. No entanto, a defesa inespecífica ao PVX pode ocorrer e há o risco de perder respostas devido à resistência extrema induzida pelo vírus. Apesar dessas limitações, em nossa experiência, a agroinfiltração e a agroinfecção PVX são ensaios adequados e complementares que podem ser usados simultaneamente para confirmar os resultados uns dos outros.

A Figura 1 mostra um experimento representativo de agroinfiltração com 7 efeitos diferentes (E1-E7) na batata e N. benthamiana. A morte celular aparece nos painéis de folhas infiltrados cerca de 3 dias após a infiltração. A extensão do fenótipo da morte celular precisa ser comparada com os controles. Uma mistura da cepa Agrobacterium AGL1(pVirG)23 contendo pBINplus-R3a e pK7WG2-AVR3a foi utilizada como controle positivo24,25, enquanto a AGL1(pVirG) foi utilizada como controle negativo. As figuras 1A e 1B mostram bons exemplos de agroinfiltração no genótipo de batata MaR8 (Mastenbroek R8)26 e N. benthamiana,respectivamente, que são muito favoráveis à agroinfiltração. Há morte celular confluente no painel de folhas coinfiltilhado com controle positivo, enquanto nenhuma resposta de morte celular ocorre com controle negativo ou pBINplus-R3a. Em MaR8, dois efeitos AVR3a (E2) e AVR4 (E3) induzem uma morte celular, enquanto os outros efeitos (E1 e E4-E7) não. Em N. benthamiana, nenhum dos efeitos testados induz uma resposta de morte celular. As figuras 1C e 1D mostram exemplos de agroinfiltração na batata selvagem Solanum berthaultii 483-1 e Solanum rechei 210-5, que não são bem agradáveis para a técnica de agroinfiltração. Em S. berthaultii 483-1, o tecido da folha mostra uma necrose inespecífica para controles negativos, bem como para todos os efeitos testados. Em S. rechei 210-5, painéis de folhas infiltrados mostram uma resposta de morte celular muito fraca ao controle positivo.
A Figura 2 mostra uma gama de escalas de pontuação que podem ser usadas para quantificar a resposta ao Agroinfilado Agrobacterium. Os percentuais de morte celular são retratados em uma escala de 0-100%. Os fenótipos observados variam de sintomas macroscopicamente não visíveis (0%), através de uma série de respostas intermediárias que apresentam clorose e níveis crescentes de morte celular, até morte celular confluente (100%).
A Figura 3 mostra um experimento representativo após a agroinfecção pvx na batata. Normalmente, a morte celular em expansão pode ser encontrada nos locais cerca de duas semanas após a inoculação da escolha do dente. Como mostrado em ambos os painéis de figuras, a expansão da morte celular está presente nos locais que foram inoculados com pGR106-CRN2 (controle positivo usando o efeito crinkler Crn2), que é um gene geral de morte celular indutor de P. infestans27. Além da pequena resposta ao ferimento, não é observada morte celular em expansão nos locais que foram inoculados com o pGR106-vazio (controle negativo). Na Figura 3A, representando o genótipo de batata MaR3 (Mastenbroek R3), dois efeitos pGR106 (E1 e E2) não induziram a morte celular. Na Figura 3B, é apresentado um resultado positivo da triagem de efeitos no solanum huancabambense selvagem 354-1; a resposta à morte celular foi observada em dois efeitos pGR106 (E1-E3, representando as provocações)28.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1.jpg"> Figura 1. Exemplos de agroinfiltração na batata e N. benthamiana. Plantas incluindo (A) um genótipo de batata MaR8 (Mastenbroek R8), (B) N. benthamiana,(C) Solanum berthaultii 483-1 e (D) Solanum rechei 210-5 foram infiltrados com uma mistura da cepa Agrobacterium AGL1(pVirG) 23 contendo pBINplus-R3a e pK7WG2-AVR3a (controle positivo), AGL1(pvirG) (controle negativo), pBINplus-R3a, e sete efeitos (E1-E7). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2.jpg"> Figura 2. Quantificação das respostas de agroinfiltração. A fotografia mostra escalas representativas de pontuação para morte celular, variando de 0% (sem sintomas) a 100% (morte celular confluente). As respostas intermediárias variam de respostas fracas, como clorose, a níveis crescentes de morte celular. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3.jpg"> Figura 3. Exemplos de agroinfecção PVX na batata. O genótipo de batata MaR3 (Mastenbroek R3) (A) e Solanum huancabambense 354-1 (B) dente-pick inoculado com pGR106-CRN2 (controle positivo), pGR106-vazio (controle negativo) e pGR106-E1-2 (efeitores), ou pGR106-E1-E3, respectivamente. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.
Mesa 1. Meio YEB
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>1 L</td>
			<td>destilado H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>sacarose</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>extrato de carne bovina</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>peptone bacteriológico</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 g</td>
			<td>extrato de levedura</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ml</td>
			<td>MgSO4 (1 M)</td>
		</tr>
</tbody></table>Mesa 2. Vetores e cepas utilizadas para agroinfiltração e agroinfecção PVX. Vários vetores binários podem ser usados. Vetores na lista abaixo permitem alta expressão dos genes candidatos e têm trabalhado bem em nossas mãos. Preferimos usar a cepa Agrobacterium GV3101(pMP90)29 em N. benthamiana e encontrar AGL130 contendo o pVirG plasmid auxiliar (pBBR1MCS-5.virGN54D)23 mais adequado na batata31. Cepas adicionais foram analisadas em outros grupos em várias plantas modelo, incluindo N. benthamiana, mas não na batata32.
<img alt="Table 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table2.jpg">
GW: gateway versão36
Mesa 3. Meio MMA. <img alt="Table 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table3.jpg">
Ajuste o pH para 5,6.

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Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltração e agroinfecção PVX são ensaios funcionais de rotina para expressão ectópica transitória de genes nas plantas. Esses métodos são ensaios eficientes em estratégias de efeitoomia (resistência rápida e descoberta genética de avirulência) e cruciais para pesquisas modernas em patologia molecular vegetal. Eles atendem à demanda por uma análise funcional robusta de alto rendimento nas plantas.

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