Name: agroinfiltration and pvx agroinfection in potato and nicotiana benthamiana
Uploaded: 2014-01-03T19:45:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Arbetet stöds delvis av Wageningen University Fund (WUF), China Scholarship Council Program for Graduate Students och ett NWO-VIDI-anslag 12378.

1. Växtodlings- och testförhållanden
<ol><li>Odla och underhåll växter i kontrollerade växthus eller klimatkammare inom temperaturområdet 18-22 °C och under naturligt ljus eller med en 16 timmar / 8 timmar / natt regim. Ta bort axillärgrenar för att göra växterna mer hanterbara.</li>
	<li>För potatis, bevara in vitro-plantlets i sterila plastburkar som innehåller Murashige-Skoog (MS) medium (20 g/L sackaros, 5 g/L MS-salter med vitaminer, 8 g/L agar, pH 5.8) under kontrollerade förhållanden i klimatkammare vid 18 °C med ett 16 timmar/8 timmar dag/natt-system i två veckor och överför dem sedan till krukor med steriliserad jord i reglerade växthusutrymmen.</li>
</ol>2. Agroinfiltrering
<ol><li>Växtmaterial: För Nicotiana benthamiana, använd cirka 4-5 veckor gamla fröodlade växter. För potatis, använd cirka 4-5 veckor gamla transplantationer från in vitro. Välj unga, friska och fullt utvecklade löv för infiltrationer.</li>
	<li>
Agrobakteriekultur:<ol>
<li>Förbered YEB-mediet i förväg (tabell 1). Fyll de 50 ml rören med 10 ml YEB-medium kompletterat med 1 μl acetosyringone (200 mM), 100 μl MES-buffert (2-(N-morpholino)-etansulfonsyra, 1 M) och lämpliga antibiotika. Pipett 20 μl glycerollager av önskadestammar (tabell 2) (innehållande genen av intresse) i YEB. Initiera kulturer för alla Agrobacterium-stammar i denna analys samtidigt. Inkubera celler genom att skaka i 1-2 dagar vid 28 °C och 200 varv/min till en OD600 på cirka 1,0.</li>
		<li>Skörda celler genom centrifugering vid 3 000 x g i 10 min. Häll av supernaten och återanvänd pelleten i nygjord MMA-medium(tabell 3)till en OD600 på 0,3. Virvelcellerna är försiktigt till för att återanvända dem. För myntfiltrering av två bakteriestammar, blanda kulturen i ett 1:1-förhållande.</li>
		<li>Lämna kulturen på bänken vid rumstemperatur i 1-6 timmar före infiltrationer. Under tiden, märk ut de växter som ska infiltreras och datumet för experimentet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infiltreringar: Använd en 1 ml nållös spruta för att infiltrera Agrobacterium suspensionerna. Injicera försiktigt och långsamt bladpaneler med suspensionerna från sprutan (av hälso- och säkerhetsskäl bör ögonskydd bäras under denna process). Infiltrera minst tre växter för varje stam. Använd tre blad per växt för att fungera som triplikater. Obs: Normalt kan 1 ml Agrobacterium suspension s räcka för 3 växter av N. benthamiana. För potatis behövs mer suspension eftersom bladen av Solanum-arter är svårare att infiltrera. Nödvändiga volymer av suspensioner beror på Solanum-arten. Undvik korskontaminering genom att byta handskar eller sterilisera handskar med etanol mellan infiltrationer och genom att inte vattna växterna förrän dagen efter vaccinationen.</li>
	<li>Poäng: Poäng makroskopiska svar ca 3 dagar efter infiltration när celldöds fenotypen är klar (Figur 1). Om celldödsfenomenet är kvantitativt, använd de angivna kriterierna (figur 2). Kortfattat beror vågen för makroskopisk poängsättning av celldöd främst på celldödsprocenten i det infiltrerade området. Procentandelar av celldöden avbildas på en skala från 0% (inga symtom) till 100% (konfluentcelldöd). Mellanliggande svar sträcker sig från svaga svar som kloros till ökande nivåer av celldöd. Om så önskas kan den makroskopiska poängsättningen också kvantitativt bedömas med hjälp av modern fotoavbildningsutrustning.</li>
</ol>3. PVX Agroinfection
<ol><li>Växtmaterial: För N. benthamiana, använd cirka 2-3 veckor gamla fröodlade växter. För potatis, använd cirka 2-3 veckor gamla transplantationer från in vitro. För storskaliga tester, använd något äldre (4-5 veckor) växter, eftersom dessa växter har fler och större löv för att rymma ett högre antal Agrobacterium-vaccinationsplatser.</li>
	<li>
Agrobakterieodling: <ol>
<li>Förbered YEB-mediet i förväg. Fyll 10 ml-rören med 3 ml YEB kompletterat med lämpliga antibiotika. Pipett 20 μl glycerollager av önskadestammar (tabell 2) (innehållande genen av intresse) i YEB. Initiera kulturer för alla Agrobacterium-stammar i denna analys samtidigt. Inkubera celler genom att skaka i 1-2 dagar vid 28 °C och 200 varv/min till en OD600 på cirka 1,0.</li>
		<li>Pipett ca 300 μl av varje Agrobacterium stam och sprida dem på LB fasta agar medium plattor kompletteras med lämpliga antibiotika och inkubera celler vid 28 °C i 1-2 dagar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infektioner: Använd en spatel för att samla Agrobacteriumkulturen i plattan. Doppa en trätandpick i Agrobacteriumkulturen på spateln och genomborra bladen för att inokulera stora mängder bakterier. Inokulera minst tre växter för varje stam. Använd tre blad per växt för att fungera som triplikater. I varje blad, gör flera vaccinationsplatser för varje stam.</li>
	<li>Poäng: Poängma makroskopiska svar ungefär två veckor efter vaccination (Figur 3). För skärmar med hög data flöde spelar du in de kvalitativa svaren (ja/nej) för varje inokulerings plats. Beräkna sedan procentandelen svarswebbplatser och jämför dem med kontroller.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+exploiting+late+blight+resistance+in+the+age+of+effectors.">Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).</li><li>Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+discovery+and+functional+analysis+of+effector+proteins+of+fungal+and+oomycete+plant+pathogens.">Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+genomics+accelerates+discovery+and+functional+profiling+of+potato+disease+resistance+and+Phytophthora+infestans+avirulence+genes.">Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes.</a> Plos One. 3, 1-10 (2008).</li><li>Oh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+screens+of+Phytophthora+infestans+RXLR+effectors+reveal+diverse+phenotypes,+including+activation+of+the+Solanum+bulbocastanum+disease+resistance+protein+Rpi-blb2.">In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2.</a> Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).</li><li>Tyler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+genome+sequences+uncover+evolutionary+origins+and+mechanisms+of+pathogenesis.">Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis.</a> Science. 313, 1261-1266 (2006).</li><li>Haas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+and+analysis+of+the+Irish+potato+famine+pathogen+Phytophthora+infestans.">Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans.</a> Nature. 461, 393-398 (2009).</li><li>Levesque, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+necrotrophic+plant+pathogen+Pythium+ultimum+reveals+original+pathogenicity+mechanisms+and+effector+repertoire.">Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire.</a> Genome Biol. 11, 1-22 (2010).</li><li>Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+genomics:+new+insights+and+future+directions.">Oomycete genomics: new insights and future directions.</a> FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).</li><li>Stassen, J. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+identification+in+the+lettuce+downy+mildew+Bremia+lactucae+by+massively+parallel+transcriptome+sequencing.">Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing.</a> Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).</li><li>Kemen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gain+and+loss+during+evolution+of+obligate+parasitism+in+the+white+rust+pathogen+of+Arabidopsis+thaliana.">Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).</li><li>Win, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. , 1-13 (2012).</li><li>Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+effector+biology+of+plant-associated+organisms.">Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 115-122 (2009).</li><li>Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+catalogue+of+the+effector+secretome+of+plant+pathogenic+oomycetes.">A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006).</li><li>van der Hoorn, R. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+is+a+versatile+tool+that+facilitates+comparative+analyses+of+Avr9/Cf-9-induced+and+Avr4/Cf-4-induced+necrosis.">Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 439-446 (2000).</li><li>Dangl, J. L., Jones, J. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+and+integrated+defence+responses+to+infection.">Plant pathogens and integrated defence responses to infection.</a> Nature. 411, 826-833 (2001).</li><li>Kapila, J., de Rycke, R., van Montagu, M., Angenon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+system+for+intact+leaves.">An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves.</a> Plant Sci. 122, 101-108 (1997).</li><li>Kanneganti, T. D., Huitema, E., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+of+oomycete+and+fungal+genes.">In planta expression of oomycete and fungal genes.</a> Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).</li><li>Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H., Lamour, K., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+systems.+Oomycete+Genetics+and+Genomics.">In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics.</a> Diversity, Interactions, and Research Tools. 23, 455-475 (2009).</li><li>Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenolic+recognition+profiles+of+the+Agrobacterium+tumefaciens+VirA+protein+are+broadened+by+a+high+level+of+the+sugar+binding+protein+ChvE.">The phenolic recognition profiles of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein are broadened by a high level of the sugar binding protein ChvE.</a> J. Bacteriol. 180, 5632-5638 (1998).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+virus-induced+gene+silencing+implicates+heat+shock+protein+90+in+plant+disease+resistance.">High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance.</a> EMBO J. 22, 5690-5699 (2003).</li><li>Ma, L., Lukasik, E., Gawehns, F., Takken, F. L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+agroinfiltration+for+transient+expression+of+plant+resistance+and+fungal+effector+proteins+in+Nicotiana+benthamiana+leaves.">The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves.</a> Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).</li><li>Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., An&#233;, J. M., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+and+silencing:+A+rapid+tool+for+functional+gene+assay+in+potato.">Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato.</a> Plos One. 4, 1-8 (2009).</li><li>van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ternary+transformation+system:+constitutive+virG+on+a+compatible+plasmid+dramatically+increases+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+enabled+the+isolation+of+the+R3a+late+blight+resistance+gene+in+potato.">Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato.</a> Plant J. 42, 251-261 (2005).</li><li>Armstrong, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancestral+oomycete+locus+contains+late+blight+avirulence+gene+Avr3a,+encoding+a+protein+that+is+recognized+in+the+host+cytoplasm.">An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+spectrum+late+blight+resistance+in+potato+differential+set+plants+MaR8+and+MaR9+is+conferred+by+multiple+stacked+R+genes.">Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes.</a> Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).</li><li>Torto, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EST+mining+and+functional+expression+assays+identify+extracellular+effector+proteins+from+the+plant+pathogen+Phytophthora.">EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora.</a> Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfection-based+high-throughput+screening+reveals+specific+recognition+of+INF+elicitins+in+Solanum.">Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum.</a> Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).</li><li>Koncz, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoter+of+TL-DNA+gene+5+controls+the+tissue-specific+expression+of+chimeric+genes+carried+by+a+novel+type+of+agrobacterium+binary.">The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary.</a> Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+transformation-competent+Arabidopsis+genomic+library+in+Agrobacterium.">A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium.</a> Bio-Technol. 9, 963-967 (1991).</li><li>Rietman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel avirulence and potato resistance gene candidates revealed [PhD thesis]. , (2011).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li><li>van engelen, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pBINPLUS+-+an+improved+plant+transformation+vector+based+on+pBIN19.">pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19.</a> Transgenic Res. 4, 288-290 (1995).</li><li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATEWAYTM+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).</li><li>Xiang, C. B., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., Oliver, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mini+binary+vector+series+for+plant+transformation.">A mini binary vector series for plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).</li><li>Curtis, M. D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gateway+cloning+vector+set+for+high-throughput+functional+analysis+of+genes+in+planta.">A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta.</a> Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).</li></ol>

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Övergående analyser som agroinfiltrering och agroinfektion är effektiva metoder som är avgörande för modern molekylär växtpatologiforskning. Trots vissa begränsningar uppfyller dessa metoder efterfrågan på effektiv och robust funktionsanalys med hög genomströmning i växter.
Agroinfiltreringssystemet är en allmänt använd funktionell analys i en rad växtarter. Agroinfiltrering underlättar leveransen av flera transgener till samma cell med samtidiga uttryck av interagerande proteiner. Detta är fördelaktigt för att rekapitla R-AVR-relationer, genom att myntfiltra agrobakterier som uttrycker Avr-gener med stammar som uttrycker de matchande R-generna. För kända R-AVR-par kan sådana myntfiltreringar också användas som positiva kontroller. Att inkludera sådana kontroller är viktigt eftersom omvandlingseffektiviteten i vissa växtgenotyper kan ligga under tröskelvärdet för att upptäcka svar. Att inkludera negativa kontroller, t.ex. en Agrobacterium stam som innehåller en vektor utan en geninsats, är också viktigt för att avgöra om en viss växt genotyp höjer ospecificerade försvarssvar på Agrobacterium. Denna funktion förekommer vid en viss frekvens i potatisgroddsplasma, och inte alla Solanum-arter är väl lämpade för detta Agrobacterium-baseradeuttryckssystem. I allmänhet fungerar agroinfiltreringsanalysen mycket bra i N. benthamiana och de flesta potatisgenotyper. Förutom effectoromics finns det olika andra potentiella tillämpningar för agroinfiltreringstekniken, såsom produktion av proteiner från transgener och proteinlokalisering i växtceller genom konfokal mikroskopi.
PVX agroinfection är ett mycket känsligt screeningsystem och vanligtvis mer lämpligt för screening med hög genomströmning. Eftersom Agrobacterium nu bara är lokalt närvarande, är ospecificerade svar på denna bakterie nu inte särskilt störande, eftersom PVX-viruset tar över ytterligare spridning av transgenen. Växter kan dock vara resistenta mot PVX eller montera extrema motståndssvar (ER), och i så fall är agroinfection-metoden inte lämplig. En annan begränsning av PVX agroinfection-metoden är skärstorleken på den gen som är av intresse. Observerade fenotyper av svar kan variera från en intensiv svart nekros som omger såret till svag nekros nära vaccinationspunkten. I både N. benthamiana och Solanum arter, PVX agroinfection erkänns som känsligare än agroinfiltration.
Med tanke på att den genetiska bakgrunden hos de olika testade växtgenotyperna kan ha vissa begränsningar (se ovan), får vi i allmänhet liknande slutsatser av PVX-agroinfektion och agroinfiltrering. Dessa resultat är också jämförbara som erhållits i andra analyser, såsom proteininfiltrationer29 och ELISA3. Med tanke på fördelarna och begränsningarna med båda systemen rekommenderar vi att du använder båda metoderna för att antingen komplettera varandra eller bekräfta oberoende resultat.

Effectoromics, en funktionell genomikmetod med hög genomströmning har nyligen dykt upp som ett kraftfullt verktyg för att identifieraresistens (R)gener i växtväxter och matchande avirulens(Avr)gener av patogener1-4. I motsats till den mer tidskrävande stabila omvandlingen med R-gener baseras effectoromics-strategin på övergående analyser av patogengensekvenser.
Sedan genomik-eran har genom av växtpatogener utforskats i stor utsträckning. Till exempel för oomycetes, som inkluderar de mest förödande växtpatogenerna, har stora samlingar av sekvenser genererats och analyserats för gener som spelar en roll under interaktionen medväxten 5-10. En klass av patogenproteiner representerar effektorer, som manipulerar värdcellens struktur och funktion antingen för att underlätta infektion (virulensfaktorer) eller för att utlösa försvarssvar (avirulensfaktorer)11-13. Uttryck av Avr-gener i växtceller som innehåller R-gener resulterar vanligtvis i överkänslig celldödsrespons (HR)14,15. I planta uttryck av R och Avr gener kan åstadkommas med hjälp av övergående uttryck system såsom Agrobacterium tumefaciens -baserad övergående omvandling (agroinfiltration)16. Denna övergående omvandling kan också tillämpas i kombination med virusuttryckssystem (agroinfektion)17,18.
För agroinfiltrering är det vanligaste medlet A . tumefaciens, en bred värdområdespatogen hos dicotväxter. A . tumefaciens innehåller en tumörframkallande (Ti) plasmid. Överförings-DNA (T-DNA) från en Ti-plasmid kommer att flyttas till växtcellerna efter att bakteriens virulensmaskineri har aktiverats. Detta kan utlösas i sårade växtceller, av de frigjorda fenolföreningarna med låg molekylvikt och monosackaraides i en något sur miljö19. Virulensgenen aktiveras efter infiltration av Agrobacterium suspensioner i bladpaneler definierade av stora vener. Då kommer växtceller i bladpanelerna att omvandlas och uttrycka de transgener som finns i T-DNA-regionen.
Agroinfection är baserad på sårinokerat agrobakterie, som förmedlar flyttning av ett virus till växtceller. Viruset sprider sig sedan vidare till angränsande växtvävnader, i avsaknad av Agrobacterium. För agroinfektion kan flera växtvirus användas. RNA-virus är idealiska vektorer för genuttryck eftersom de kan föröka sig till mycket höga nivåer i infekterade växter. Bland växt-RNA-virus används Potato Virus X (PVX) ofta för effectoromics skärmar. För att underlätta funktionella tester för en infogad gen klonades binära vektorer som innehåller PVX-genomet flankerade av blomkålsmosaikviruset 35S-promotorn och nopaline syntasterminatorn till T-DNA av A. tumefaciens20. Efter att T-DNA har överförts till växtceller transkriberas PVX-genomet i T-DNA från 35S-promotorn. Sedan sprids viruspartiklar systemiskt i de infekterade växterna, vilket resulterar i uttrycket av den infogade genen. Denna metod baserad på både Agrobacterium och PVX kallas PVX agroinfection.
Här visar vi exempel för både agroinfiltrering och PVX agroinfection analyser. Som värdväxter använder vi potatisgroddsplasma(Solanum-sektionen Petota), för vilken effektoromicsmetoder har banat väg och visat sig varaframgångsrika 3,4. Vi använder också Nicotiana benthamiana, som är känd som en modellväxt i Solanaceous växter14,21,22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Beef extract</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">B4888</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Bacteriological peptone</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0037</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0021</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MgSO4</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">208094</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MS salts (without vitamins)</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M0221</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MES</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M1503</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">LB broth powder</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">L3022</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D134406</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Syringe (1 ml)</td>
			<td style="width:267px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;">300013</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Incubator</td>
			<td style="width:267px;">Infors HT</td>
			<td style="width:219px;">Multitron II</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:267px;">Heraeus</td>
			<td style="width:219px;">Multifuge 3S-R</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:219px;">Biophotometer 6131</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agroinfiltration and pvx agroinfection in potato and nicotiana benthamiana

Agroinfiltrering och PVX-agroinfektion är två effektiva övergående uttrycksanalyser för funktionell analys av kandidatgener hos växter. Det vanligaste medlet för agroinfiltrering är Agrobacterium tumefaciens, en patogen hos många dicotväxtarter. Detta innebär att agroinfiltrering kan tillämpas på många växtarter. Här presenterar vi våra protokoll och förväntade resultat när vi tillämpar dessa metoder på potatisen (Solanum tuberosum), dess relaterade vilda knölbärande Solanum-arter (Solanum-sektionen Petota) och modellväxten Nicotiana benthamiana. Förutom funktionell analys av enstaka gener, såsomresistens( R ) eller avirulens(Avr)gener, är agroinfiltreringsanalysen mycket lämplig för att rekapitulera R-AVR-interaktioner som är associerade med specifika värdpatogeninteraktioner genom att helt enkelt leverera R- och Avr-transgener till samma cell. Vissa växtgenotyper kan dock höja ospecificerade försvarssvar på Agrobacterium, som vi observerade till exempel för flera potatisgenotyper. Jämfört med agroinfiltrering är detektion av AVR-aktivitet med PVX-agroinfektion känsligare, mer hög genomströmning i funktionella skärmar och mindre känslig för ospecificerade försvarssvar på Agrobacterium. Men ospecificerat försvar till PVX kan uppstå och det finns en risk att missa svar på grund av virusinducerad extrem resistens. Trots sådana begränsningar är agroinfiltrering och PVX-agroinfektion enligt vår erfarenhet både lämpliga och kompletterande analyser som kan användas samtidigt för att bekräfta varandras resultat.

Figur 1 visar ett representativt experiment med agroinfiltrering med 7 olika effektorer (E1-E7) i potatis och N. benthamiana. Celldöd förekommer i de infiltrerade bladpanelerna ca 3 dagar efter infiltration. Omfattningen av celldöds fenotypen måste jämföras med kontrollerna. En blandning av Agrobacteriumstammen AGL1(pVirG)23 som innehåller pBINplus-R3a och pK7WG2-AVR3a användes som positivkontroll 24,25, medan AGL1(pVirG) användes som negativ kontroll. Figurerna 1A och 1B visar goda exempel på agroinfiltrering i potatisgenotypen MaR8 (Mastenbroek R8)26 respektive N. benthamiana,som är mycket mottagliga för agroinfiltrering. Det finns konfluentcelldöd i bladpanelen myntfiltrated med positiv kontroll, medan ingen celldödsrespons uppstår med negativ kontroll eller pBINplus-R3a. I MaR8 inducerar två effektorer AVR3a (E2) och AVR4 (E3) en celldöd, medan de andra effektorerna (E1 och E4-E7) inte gör det. I N. benthamiana inducerar ingen av de testade effektorerna en celldödsrespons. Figurerna 1C och 1D visar exempel på agroinfiltrering i den vilda potatisen Solanum berthaultii 483-1 och Solanum rechei 210-5, som inte är väl mottagliga för agroinfiltreringstekniken. I S. berthaultii 483-1 visar bladvävnaden en ospecificerad nekros till negativa kontroller samt till alla testade effektorer. I S. rechei 210-5 visar infiltrerade bladpaneler mycket svag celldödsrespons på positiv kontroll.
Figur 2 visar ett intervall av poängskalor som kan användas för att kvantifiera svaret på agroinfiltrated Agrobacterium. Procentandelar av celldöden avbildas i skala 0-100%. Observerade fenotyper sträcker sig från makroskopiskt inte synliga symtom (0%), genom en rad mellanliggande svar som visar kloros och ökande nivåer av celldöd, upp till konfluent celldöd (100%).
Figur 3 visar ett representativt experiment efter PVX-agroinfektion i potatis. Normalt kan expanderande celldöd hittas på platserna cirka två veckor efter tandplockningsinokulering. Som visas i båda figurpanelerna finns expanderande celldöd på de platser som var tandplockning inokulerad med pGR106-CRN2 (positiv kontroll med hjälp av effector crinkler Crn2), som är en allmän celldöd inducerande gen från P. angreppans27. Bortsett från mindre svar på sårning noteras ingen expanderande celldöd på de platser som var tandplockning inokulerad med pGR106-tom (negativ kontroll). I figur 3A, som representerar potatisgenotypen MaR3 (Mastenbroek R3), inducerar två pGR106-effektorer (E1 och E2) inte celldöd. I figur 3Bpresenteras ett positivt resultat av effektorscreening i det vilda Solanum huancabambense 354-1. celldödssvar observerades på två pGR106-effektorer (E1-E3, som representerar elicitiner)28.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1.jpg"> Figur 1. Exempel på agroinfiltrering i potatis och N. benthamiana. Växter inklusive( A) en potatis genotyp MaR8 (Mastenbroek R8), (B) N. benthamiana, (C) Solanum berthaultii 483-1 och (D) Solanum rechei 210-5 infiltrerades med en Blandning av Agrobacteriumstammen AGL1(pVirG) 23 innehållande pBINplus-R3a och pK7WG2-AVR3a (positiv kontroll), AGL1(pvirG) (negativ kontroll), pBINplus-R3a. och sju effektorer (E1-E7). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa större bild</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2.jpg"> Figur 2. Kvantifiering av agroinfiltreringssvar. Fotografiet visar representativa poängskalor för celldöd, från 0% (inga symtom) till 100% (konfluentcelldöd). Mellanliggande svar sträcker sig från svaga svar som kloros till ökande nivåer av celldöd. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa större bild</a>.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3.jpg"> Figur 3. Exempel på PVX-agroinfektion i potatis. Potatisgenotyp MaR3 (Mastenbroek R3) (A) och Solanum huancabambense 354-1 (B) tandplockning inokulerad med pGR106-CRN2 (positiv kontroll), pGR106-tom (negativ kontroll) respektive pGR106-E1-2 (effektorer) eller pGR106-E1-E3. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa större bild</a>.
Tabell 1. YEB-medium
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>1 L (på 1 L)</td>
			<td>destillerat H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>sackaros</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>nötköttsextrakt</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>bakteriologisk pepton</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 g</td>
			<td>jästextrakt</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ml</td>
			<td>MgSO4 (1 M)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2. Vektorer och stammar som används för agroinfiltrering och PVX-agroinfektion. Flera binära vektorer kan användas. Vektorer i listan nedan tillåter högt uttryck för kandidatgenerna och har fungerat bra i våra händer. Vi föredrar att använda Agrobacterium stam GV3101 (pMP90)29 i N. benthamiana och hitta AGL130 som innehåller hjälparen plasmid pVirG (pBBR1MCS-5.virGN54D)23 mer lämplig i potatis31. Ytterligare stammar har analyserats i andra grupper på olika modellväxter inklusive N. benthamiana men inte i potatis32.
<img alt="Table 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table2.jpg">
GW: gateway version36
Tabell 3. MMA-medium. <img alt="Table 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table3.jpg">
Justera pH-skat till 5,6.

Watch this Scientific Journal Video about Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltrering och PVX agroinfektion är rutinmässiga funktionella analyser för övergående ectopic uttryck av gener i växter. Dessa metoder är effektiva analyser i effektoromics strategier (snabb resistens och avirulens gen upptäckt) och avgörande för modern forskning inom molekylär växtpatologi. De uppfyller efterfrågan på robust funktionsanalys med hög genomströmning i växter.

Agroinfiltrering och PVX-agroinfektion i Potatis och Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Research

JoVE Journal

Biology

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-inducerad geners uttryck (VIGS) i Nicotiana benthamiana Och Tomat

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Effektiv Agroinfiltration av växter för hög nivå Transient Expression av rekombinanta proteiner

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Optimering och Utnyttjande av<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Medierad Transient Protein Produktion i<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Församlingen och tillämpning av &quot;Shear ringen&quot;: A Novel Endothelial modell för Orbital, enkelriktad och periodisk vätskeflöde och Shear stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferas komplettering Imaging test i Nicotiana benthamiana blad för övergående bestämma Protein-protein interaktioner Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Växt-mikrob interaktion: Transkriptionell svar av Bacillus Mycoides potatis Root exudat

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Produktion av IgG Fusion Proteiner Övergående Uttryckt i Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Quantifying Cell Death Initiation Through Continuous Imaging

Studying Cell Death Initiation Using a Digital Microscope

A Streamlined Approach to Studying Cell Death Initiation in Hypersensitive Response (Video) | JoVE

Studerar initiering av celldöd med hjälp av ett digitalt mikroskop

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as ...

An Experimental Study on Colorado Potato Beetle Hibernation Under Natural Conditions

En experimentell studie på koloradoskalbaggar som övervintrar under naturliga förhållanden

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and ...

In Planta Transient Transformation of Cacao Plants Using Agrobacterium tumefaciens

Vacuum-Forced Agroinfiltration for In planta Transformation of Recalcitrant Plants: Cacao as a Case Study

Author Spotlight: Tissue Culture-Free Agrobacterium-Mediated Transformation in Large Woody Plants

Transient in planta transformation is a fast and cost-effective alternative for plant genetic transformation. Most protocols for in planta transformation ...