Name: autonomously bioluminescent mammalian cells for continuous and real-time monitoring of cytotoxicity
Uploaded: 2013-10-28T20:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity at JoVE.com

Denne forskningsindsats er blevet støttet af National Science Foundation Division of Chemical, Bioengineering, Miljø og Transport (CBET) Systemer under award numre CBET-0.853.780 og CBET-1.159.344 og National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) under award nummer 1R43ES022567-01, og National Cancer Institute, Cancer Imaging Program under award nummer CA127745-01. Den IVIS Lumina instrument i dette arbejde er indhentet fra den amerikanske hær Defense University Research Instrumentering Program.

1.. Cell Preparation <ol><li> Inddrive et hætteglas med selvlysende HEK293 celler fra flydende nitrogen frosset lager og dyrke dem i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 0.01 mM ikke-essentielle aminosyrer, 1x antibiotikum-antimykotikum og 0,01 mM natriumpyruvat i en T 75 vævsdyrkningskolbe ved 37 ° C og 5% CO2. Note: Medierne og supplerende komponenter vil variere baseret på cellelinjer, og derfor bør vælges i overensstemmelse hermed. <...

<ol>
	<li>U.S. Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+really+FDA+approved?.">Is it really FDA approved?.</a> FDA Consumer Health Information. 2, (2009).</li><li>Hartung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicology+for+the+twenty-first+century.">Toxicology for the twenty-first century.</a> Nature. 460, 208-212 (2009).</li><li>Olson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concordance+of+the+toxicity+of+pharmaceuticals+in+humans+and+in+animals.">Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals.</a> Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).</li><li>Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+developments+in+cell+culture+technology.">Current developments in cell culture technology.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).</li><li>Li, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+human+ADME/Tox+drug+properties+in+drug+discovery.">Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).</li><li>Li, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+approaches+to+evaluate+ADMET+drug+properties.">In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties.</a> Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).</li><li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo.">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).</li><li>Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+cDNA+for+the+luciferase+from+the+marine+ostracod+Vargula+hilgendorfii.">Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).</li><li>Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+real+time+Metridia+luciferase+based+non-invasive+reporter+assay+of+mammalian+cell+viability+and+cytotoxicity+via+the+beta-actin+promoter+and+enhancer.">A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Meighen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+bacterial+bioluminescence.">Molecular biology of bacterial bioluminescence.</a> Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).</li><li>Close, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+bioluminescent+expression+of+the+bacterial+luciferase+gene+cassette+(lux)+in+a+mammalian+cell+line.">Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line.</a> PLoS ONE. 5, e12441 (2010).</li><li>Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+toxicant+bioavailability+using+a+constitutively+bioluminescent+human+cell+line.">Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line.</a> , 1-4 (2011).</li><li>Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+the+antibiotic+Zeocin+by+stable+expression+of+the+Sh+ble+gene+does+not+fully+suppress+Zeocin-induced+DNA+cleavage+in+human+cells.">Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells.</a> Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).</li><li>Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+detection+of+human+toxicants+in+real+time+using+a+human+optimized+bioluminescent+bacterial+luciferase+gene+cassette+bioreporter.">Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter.</a> Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).</li><li>Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+optimized+bacterial+luciferase,+firefly+luciferase,+and+green+fluorescent+protein+for+continuous+imaging+of+cell+culture+and+animal+models.">Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models.</a> J. Biomed. Opt. 16, e12441 (2011).</li></ol>

Denne metode demonstrerer brugen af autonomt bioluminescerende pattedyrceller som en in vitro cytotoksicitet screeningsassay, der tillader levende celler, der skal overvåges kontinuerligt i løbet af deres levetid. Denne protokol er fleksibel og kan modificeres til at rumme særlige eksperimentelle betingelser som krævet. For eksempel præsenterede eksperimentet her er egnet til sporing akutte toksiske effekter, men kan tilpasses til at vurdere langsomt virkende eller langtidsvirkninger ved gentagne billeddan...

I USA kræver lægemidler og andre produkter til konsum omfattende vurdering, før de er godkendt til privat brug af Food and Drug Administration. Den finansielle byrde for at udføre denne test er placeret på udvikleren 1, som i væsentlig grad forøger omkostningerne til nye sammensatte udvikling og derfor udslag i en øget omkostning for forbrugerne. Mens traditionelt meget af denne screening har udnyttet dyreindivider at fungere som stedfortrædere for menneskelige værter, har det vist sig at være en stor økonomisk byrde, med en anslået 2800 millioner dollars bruges årligt på ADME / Tox (adsorption, distribution, metabolisme, udskillelse, og giftighed ) screening alene 2 og montering tyder på, at dyremodeller ikke pålideligt kan forudsige humantoksikologiske reaktioner 3.. Derfor har in vitro human cellekultur-baseret testning vundet popularitet i de seneste to årtier på grund af dens relativt lavereomkostninger, højere gennemløb og bedre repræsentation af menneskelig biotilgængelighed og toksikologi 4.. Aktuelle celle kultur-baserede toksicitet screeningsmetoder anvender forskellige endepunkter, såsom målingen af ATP-niveauer, screening aktiviteten af endogent tilgængelige cytoplasmiske enzymer, sondering integritet af cellemembranen, eller sporing niveauet af mitokondrie aktivitet at vurdere cellulær levedygtighed 5 , 6.. Men uanset den valgte slutpunkt, disse metoder kræver alle destruktion af prøven før målinger kan foretages, således kun producerer data på et enkelt tidspunkt. Som et resultat, skal et stort antal prøver til at være forberedt og behandles parallelt for basale toksikologiske kinetiske undersøgelser, igen tilføje til omkostninger og arbejdskraft er nødvendig for nye stof udvikling. Alternativt assays under anvendelse udskilles luciferase såsom Gaussia luciferase 7, Vargula luciferase 8, og Metridia luciferase 9er blevet udviklet, at eliminere behovet for cellelyse og kræver en brøkdel af medierne til endepunktsmåling, dog er disse stadig begrænset til prøveudtagning på forudbestemte tidspunkter og også kræver tilsætning af exogene lys-aktiverende substrater. For at undgå skade for nødvendige prøve ødelæggelse samt at undgå omkostningerne til substrater, har en human cellelinie blevet manipuleret der udtrykker fuld bakterielle bioluminescens (lux)-gen kassette (luxCDABEfrp) for at muliggøre kontinuerlig overvågning af levende celler, der ligner for fluorescerende-dye-baseret live-cell imaging, men uden de ekstra foton-aktiverende og mikroskopiske undersøgelsesprocedurer. Denne cellelinie er i stand til konstitutivt at producere et optisk signal til kontinuerlig, direkte påvisning uden behov for ekstern stimulering, hvorved man undgår ødelæggelse af prøven. Mekanistisk bioluminescerende signal, der genereres fra disse celler resulteres, når luxAB dannede luciferaseenzymet katalyserer oxidationen af en lang kæde fedtsyrer aldehyd (syntetiseret og regenereres ved luxCDE genprodukter anvender endogene substrater) i nærværelse af reduceret riboflavinphosphat (FMNH 2, som recirkuleres fra FMN ved FRP-genet produkt) og molekylært oxygen 10. Ekspression af lux kassetten i værtscellen gør det derfor muligt let at blive produceret og detekteres uden cellulær destruktion eller exogen substrat tilsætning. Tilsvarende samspillet mellem de lux gener og endogent tilgængelige FMN, og O 2 cosubstrater, og kravet om opretholdelse af et miljø, der kan understøtte omdannelsen af FMN til FMNH 2, sikrer, at den resulterende bioluminiscerende signal kun kan opdages fra levende , metabolsk aktive celler. Disse krav er tidligere blevet udnyttet til at påvise, at lux-based bioluminescerende output korrelerer stærkt med cellulære befolkningens størrelse 11, og at toksisk forbindelse eksponering svækker autobioluminescent produktion på en dosis-respons fashion 12. Her bruger vi en hidtil karakteriseret autobioluminescent humane embryonale nyre (HEK293) cellelinje 11 at demonstrere automatiserede toksikologiske screening af et antibiotikum af bleomycin familie med kendte DNA-ødelæggende aktivitet som et repræsentativt eksempel at validere anvendelsen af autobioluminescent pattedyrceller til toksicitetstestning.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging 2.0</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Newer updates of this software is available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture treated flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture-treated plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662174</td>
			<td>96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), phenol red-free</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3091003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids, 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic, 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate, 100mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin, 100 mg/ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R25001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripsin, 0.05%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autonomously bioluminescent mammalian cells for continuous and real-time monitoring of cytotoxicity

Mammalian cellebaserede in vitro assays er blevet bredt anvendt som alternativer til dyreforsøg for toksikologiske undersøgelser, men har været begrænset på grund af de høje monetære og tid omkostninger til parallelle prøveforberedelse, som er nødvendiggjort som følge af den destruktive karakter af ildflueluciferase-baserede screeningsmetoder . Denne video beskriver anvendelsen af ​​autonomt bioluminescerende pattedyrceller, som ikke kræver den destruktive tilsætning af et luciferin substrat, som en billig og facile fremgangsmåde til overvågning af de cytotoksiske virkninger af en forbindelse af interesse. Pattedyrsceller stabilt udtrykker det fulde bakterielle bioluminescens (luxCDABEfrp) genkassette autonomt frembringe et optisk signal, som topper ved 490 nm uden tilsætning af et dyrt og potentielt interfererende luciferin substrat, magnetisering af en ekstern energikilde, eller destruktion af prøven, der er traditionelt udføres under optisk imagografiprocedurens. Denne uafhængighed af ekstern stimulation lægger byrden for at opretholde bioluminescensreaktion udelukkende på den celle, hvilket betyder, at den resulterende signal kun registreres under aktiv metabolisme. Denne egenskab gør lux-udtrykkende cellelinie en glimrende kandidat til anvendelse som et biosentinel mod cytotoksiske virkninger, fordi ændringer i bioluminescerende produktion er tegn på skadelige virkninger på cellulær vækst og metabolisme. Ligeledes den autonome karakter og mangel på nødvendige prøve ødelæggelse tillader gentagne billeddannelse af den samme prøve i realtid i hele giftstoffet eksponering og kan udføres på tværs af flere prøver ved anvendelse af eksisterende imaging udstyr på en automatiseret måde.

I denne undersøgelse blev dynamikken i autobioluminescent HEK293 celler overvåges kontinuerligt over en 24 timers periode som reaktion på antibiotika eksponering (figur 1). De toksiske virkninger af dette antibiotikum, som er et medlem af bleomycin familien kendt for at dræbe levende celler ved at binde til og spaltning af DNA 13 blev påvist via en nedsættelse bioluminescerende produktion i forhold til ubehandlede celler, der kan være direkte visualiseres gennem pseudo billeder <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity at JoVE.com

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Pattedyrceller udtrykker bakterielle bioluminescens genkassette (<em&gt; Lux</em&gt;) Producere lys selvstændigt. De resulterende bioluminescerende dynamik upon kemiske eksponering har vist sig at afspejle effekten af ​​behandlingen på cellulær vækst og metabolisme, hvilket gør disse celler en billig, vedvarende, real-time toksicitet screeningsværktøj, der nemt kan tilpasses til high-throughput automatisering.

Autonomt Bioluminescent pattedvrceller for vedvarende og Real-time overvågning af cytotoksicitet

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Real-time overvågning af ligand-receptor interaktioner med Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET mikroskopi af Real-time overvågning af signalering begivenheder i levende celler Brug unimolekylær Biosensorer

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Overvågning plasmidreplikation Live pattedvrceller over flere generationer ved fluorescensmikroskopi

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Måling af hæmoglobinsyntese Niveauer i pattedyrceller

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-baseret real-time PCR metoder til kvantitativ måling af microRNA

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

In situ-monitorering af transitivt dannede molekylære Chaperone-samlinger i bakterier, gær og humane celler

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...