Name: autonomously bioluminescent mammalian cells for continuous and real-time monitoring of cytotoxicity
Uploaded: 2013-10-28T20:00:00
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これらの研究活動は、化学、バイオ、環境、受賞番号CBET-0853780とCBET-1159344と国立衛生研究所、国立環境健康科学研究所（NIEHS）の下で輸送（CBET）システムの国立科学財団部門によってサポートされていました下の賞番号1R43ES022567-01、国立がん研究所、がんイメージングプログラム賞番号CA127745-01アンダー。本研究で使用IVISルミナ機器は米軍国防大学研究計測プログラムから得られた。

1。細胞調製<ol><li>液体窒素凍結ストックから生物発光HEK293細胞のバイアルを回収し、10％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、抗生物質、抗真菌1×0.01 mMの非必​​須アミノ酸、およびT、0.01 mMのピルビン酸ナトリウムでそれらを成長させる37℃、5％CO 2で75組織培養フラスコ。 注：メディアと補足コンポーネントが細胞株によって異なりますの?...

<ol>
	<li>U.S. Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+really+FDA+approved?.">Is it really FDA approved?.</a> FDA Consumer Health Information. 2, (2009).</li><li>Hartung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicology+for+the+twenty-first+century.">Toxicology for the twenty-first century.</a> Nature. 460, 208-212 (2009).</li><li>Olson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concordance+of+the+toxicity+of+pharmaceuticals+in+humans+and+in+animals.">Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals.</a> Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).</li><li>Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+developments+in+cell+culture+technology.">Current developments in cell culture technology.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).</li><li>Li, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+human+ADME/Tox+drug+properties+in+drug+discovery.">Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).</li><li>Li, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+approaches+to+evaluate+ADMET+drug+properties.">In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties.</a> Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).</li><li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo.">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).</li><li>Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+cDNA+for+the+luciferase+from+the+marine+ostracod+Vargula+hilgendorfii.">Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).</li><li>Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+real+time+Metridia+luciferase+based+non-invasive+reporter+assay+of+mammalian+cell+viability+and+cytotoxicity+via+the+beta-actin+promoter+and+enhancer.">A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Meighen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+bacterial+bioluminescence.">Molecular biology of bacterial bioluminescence.</a> Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).</li><li>Close, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+bioluminescent+expression+of+the+bacterial+luciferase+gene+cassette+(lux)+in+a+mammalian+cell+line.">Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line.</a> PLoS ONE. 5, e12441 (2010).</li><li>Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+toxicant+bioavailability+using+a+constitutively+bioluminescent+human+cell+line.">Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line.</a> , 1-4 (2011).</li><li>Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+the+antibiotic+Zeocin+by+stable+expression+of+the+Sh+ble+gene+does+not+fully+suppress+Zeocin-induced+DNA+cleavage+in+human+cells.">Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells.</a> Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).</li><li>Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+detection+of+human+toxicants+in+real+time+using+a+human+optimized+bioluminescent+bacterial+luciferase+gene+cassette+bioreporter.">Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter.</a> Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).</li><li>Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+optimized+bacterial+luciferase,+firefly+luciferase,+and+green+fluorescent+protein+for+continuous+imaging+of+cell+culture+and+animal+models.">Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models.</a> J. Biomed. Opt. 16, e12441 (2011).</li></ol>

この方法は、生きた細胞が継続的に生涯にわたって監視することができインビトロ細胞毒性スクリーニングアッセイとして自律的に生物発光哺乳類細胞の使用方法を示します。このプロトコルは柔軟性があり、必要に応じて具体的な実験条件に適応するように変更することができる。例えば、ここに示された実験は、急性毒性を追跡するのに適しているが、増加した時間間隔（ ...

彼らは食品医薬品局（FDA）によって、消費者の使用が承認される前に米国では、人間の消費のために意図された医薬品やその他の製品は、広範な評価を必要とする。このテストを実行するための負担は、実質的に新規化合物の開発コストを増加させ、したがって、消費者にとってコストの上昇につながり現像剤1上に配置されている。伝統的にずっとこのスクリーニングのが人間のホストのプロキシとして機能するように、動物の科目を利用しているが、これはADME / Toxの（吸着、分布、代謝、排泄、および毒性に毎年費やさ推定28億ドルで、大規模な財政負担であることが証明された）2のみをスクリーニングし、動物モデルは確実に人間の毒性応答3を予測できないことを示唆している証拠。したがって、in vitroでのヒト細胞培養ベースのテストでは 、その相対的に低いの過去20年間の人気を得ているコスト、高スループット、および人間の生物学的利用能及び毒物学4のより良い表現。現在、細胞培養系毒性スクリーニング法は、細胞生存5を評価するために、細胞膜の完全性をプロービング、内因的に利用可能な細胞質酵素の活性のスクリーニング、またはミトコンドリアの活性のレベルを追跡し、そのようなATPレベルを測定するなどの様々なエンドポイントを採用、6。測定は、従って、単​​一の時点でデータを生成し、取り出すことができる前に、しかし、関係なく選択されたエンドポイント、これらの方法は、すべてのサンプルの破壊を必要とする。結果として、多数の試料を調製し、基本的な毒物学的動態研究のため、並列に処理し、再度新たな化合物の開発に要するコストと労力を添加する必要がある。また、使用したアッセイは、そのようなガウルシフェラーゼ7、 ウミホタル属ルシフェラーゼ8、 型Metridiaルシフェラーゼ9としてルシフェラーゼ分泌細胞溶解の必要性を排除し、エンドポイント測定用媒体の一部を必要とするが開発されてきたが、これらは依然として所定の時点でのサンプリングに限定されるものではなく外因性の光活性化基質の添加を必要としている。 基材のコストを排除するだけでなく、必要なサンプル破壊の不利益を回避するために、ヒト細胞株は同様である生きた細胞の連続的な監視を可能にするために完全な細菌の生物発光（ ルクス ）遺伝子カセット（luxCDABEfrp）を発現する遺伝子操作されている蛍光染料ベースのライブセルイメージングに、追加光子活性化と微視的調査手続きなし。この細胞株は、このように試料の破壊を回避し、構成的に外部刺激を必要とせずに連続的な、直接検出するための光信号を生成することができる。機構的に、これらの細胞から発生する生物発光シグナルが発生S luxAB形成されたルシフェラーゼ酵素が減少リボフラビンリン酸塩の存在（FRP遺伝子によってFMNからリサイクルさFMNH 2、中長鎖脂肪酸アルデヒド（内在性基質を用いたluxCDE遺伝子産物によって合成され、再生）の酸化を触媒するとき製品）と酸素分子10。宿主細胞中での発現カセットルクスしたがって、細胞破壊又は外因性基質を添加せずに製造され、検出される光が可能となる。同様に、 ルクス遺伝子および内因的に利用できるFMNとの間の相互作用、およびO 2補基質、及びFMNH 2〜FMNの変換をサポートすることができる環境を維持するための要件は、得られた生物発光信号のみが生きているから検出できることを保証、代謝的に活性な細胞。 これらの要件は、以前にそのルクス -BASを実証するために利用されていますED生物発光出力は、携帯人口規模11とその毒性化合物の曝露用量反応ファッション12 autobioluminescent生産を損なうと強く相関している。ここでは、毒性試験のためのautobioluminescent哺乳類細胞のアプリケーションを検証する代表例として知られているDNA損傷活性ブレオマイシンファミリーの抗生物質の自動毒性スクリーニングを実証するために以前に特徴付けautobioluminescentヒト胎児腎臓（HEK293）細胞ライン11を使用しています。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging 2.0</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Newer updates of this software is available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture treated flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture-treated plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662174</td>
			<td>96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), phenol red-free</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3091003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids, 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic, 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate, 100mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin, 100 mg/ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R25001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripsin, 0.05%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autonomously bioluminescent mammalian cells for continuous and real-time monitoring of cytotoxicity

哺乳動物細胞ベースのインビトロアッセイは、広く毒性試験のための動物実験の代替として用いられているが、原因ホタルルシフェラーゼに基づくスクリーニング法の破壊的な性質のために必要とされる並列の試料調製の高い金銭的および時間コストに限定されている。このビデオは、目的の化合物の細胞毒性効果を監視するための安価で容易な方法としては、ルシフェリン基質の破壊的な添加を必要としない自律的に生物発光哺乳動物細胞の利用が記載されている。安定的に完全な細菌の生物発光（luxCDABEfrp）遺伝子カセットを発現する哺乳動物細胞は、自律的に高価であり、おそらくは干渉ルシフェリン基板と、外部エネルギー源による励起、又は伝統的である試料の破壊を添加せずにピークが490nmでその光信号を生成する光学イメージング手順の間に行われるS。外部刺激からのこの独立性は結果の信号のみをアクティブ代謝中に検出されていることを意味し、もっぱら細胞上の生物発光反応を維持するための負担を配置します。生物生産の変化は細胞の成長と代謝に悪影響を示すものであるので、この特徴は、 ルクス発現細胞株細胞毒性に対するbiosentinelとして使用するための優れた候補になります。同様に、必要なサンプル破壊の自律的な性質や不足が毒物曝露の期間を通じて、リアルタイムで同じサンプルを繰り返しイメージングを可能にし、自動化された方法で、既存の画像処理装置を使用して複数のサンプル間で実行することができます。

本研究では、autobioluminescent HEK293細胞の動態を、抗生物質露光（ 図1）に応答して24時間かけて連続的にモニターした。に結合し、DNA 13を切断することにより、生きた細胞を殺すことが知られているブレオマイシンファミリーのメンバーであり、この抗生物質の毒性効果は、擬似カラー画像から直接可視化することができる未処理の細胞と比較して生物生産の減少を介して?...

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Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

細菌性生物発光遺伝子カセットを発現する哺乳動物細胞（<em&gt;ルクス</em&gt;）自律的に光を生成する。化学露光により得られた生物力学を容易に高スループット自動化に適合させることができる安価な、連続的なリアルタイム毒性スクリーニングツールこれらの細胞を作り、細胞の成長および代謝に対する治療効果を反映することが実証されている。

細胞毒性の継続とリアルタイム監視のための自律的に生物発光哺乳類細胞

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

哺乳動物細胞をトリプシン処理し、継代培養

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哺乳動物細胞におけるRNAiスクリーニングのためのミッションesiRNA

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We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

定量リアルタイムPCR（定量PCR）アレイを用いたプレマイクロRNAとマイクロRNAのプロファイリング

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Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

蛍光共鳴エネルギー移動によるリガンド - 受容体相互作用のリアルタイム監視

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

単分子バイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための顕微鏡のFRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡法による、複数世代にわたってライブ哺乳類細胞におけるプラスミドの複製を監視

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

哺乳動物細胞におけるヘム合成レベルの測定

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

プローブベースのリアルタイムPCRは、マイクロRNAの定量的測定のためのアプローチ

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

細菌、酵母、ヒト細胞における一過性形成分子シャペロンアセンブリのモニタリング

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...