Name: autonomously bioluminescent mammalian cells for continuous and real-time monitoring of cytotoxicity
Uploaded: 2013-10-28T20:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity at JoVE.com

Disse forskningsinnsats ble støttet av National Science Foundation Division of Chemical, bioteknologi, miljø og transport (cbet) Systems henhold prisen tall cbet-0853780 og cbet-1159344 og National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) henhold award nummer 1R43ES022567-01, og National Cancer Institute, Cancer Imaging Program under award nummer CA127745-01. Den IVIS Lumina instrument som brukes i dette arbeidet ble hentet fra US Army Defense University Research Instrumentation Program.

En. Celleforberedelsen <ol><li> Gjenopprette en ampulle med bioluminescent HEK293 celler fra flytende nitrogen frosset lager og dyrke dem i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum, 0,01 mM ikke-essensielle aminosyrer, 1 x antibiotika-antimykotiske og 0,01 mM natrium-pyruvat i en T 75 vevskultur-kolbe ved 37 ° C og 5% CO2. Merk: Mediene og supplerende komponenter vil variere basert på cellelinjer og derfor bør velges deretter. </li><li> Refresh me...

<ol>
	<li>U.S. Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+really+FDA+approved?.">Is it really FDA approved?.</a> FDA Consumer Health Information. 2, (2009).</li><li>Hartung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicology+for+the+twenty-first+century.">Toxicology for the twenty-first century.</a> Nature. 460, 208-212 (2009).</li><li>Olson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concordance+of+the+toxicity+of+pharmaceuticals+in+humans+and+in+animals.">Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals.</a> Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).</li><li>Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+developments+in+cell+culture+technology.">Current developments in cell culture technology.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).</li><li>Li, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+human+ADME/Tox+drug+properties+in+drug+discovery.">Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).</li><li>Li, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+approaches+to+evaluate+ADMET+drug+properties.">In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties.</a> Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).</li><li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo.">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).</li><li>Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+cDNA+for+the+luciferase+from+the+marine+ostracod+Vargula+hilgendorfii.">Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).</li><li>Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+real+time+Metridia+luciferase+based+non-invasive+reporter+assay+of+mammalian+cell+viability+and+cytotoxicity+via+the+beta-actin+promoter+and+enhancer.">A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Meighen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+bacterial+bioluminescence.">Molecular biology of bacterial bioluminescence.</a> Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).</li><li>Close, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+bioluminescent+expression+of+the+bacterial+luciferase+gene+cassette+(lux)+in+a+mammalian+cell+line.">Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line.</a> PLoS ONE. 5, e12441 (2010).</li><li>Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+toxicant+bioavailability+using+a+constitutively+bioluminescent+human+cell+line.">Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line.</a> , 1-4 (2011).</li><li>Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+the+antibiotic+Zeocin+by+stable+expression+of+the+Sh+ble+gene+does+not+fully+suppress+Zeocin-induced+DNA+cleavage+in+human+cells.">Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells.</a> Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).</li><li>Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+detection+of+human+toxicants+in+real+time+using+a+human+optimized+bioluminescent+bacterial+luciferase+gene+cassette+bioreporter.">Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter.</a> Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).</li><li>Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+optimized+bacterial+luciferase,+firefly+luciferase,+and+green+fluorescent+protein+for+continuous+imaging+of+cell+culture+and+animal+models.">Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models.</a> J. Biomed. Opt. 16, e12441 (2011).</li></ol>

Denne metoden demonstrerer bruken av autonomt bioluminescent pattedyrceller som en in vitro-cytotoksisitet screening-analyse som tillater levende celler som skal overvåkes kontinuerlig over deres levetid. Denne protokollen er fleksibel og kan endres for å imøtekomme spesifikke eksperimentelle forhold som kreves. For eksempel presenteres eksperimentet her er egnet for sporing av akutte toksiske effekter, men kan tilpasses til å vurdere langsomt-virkende eller langsiktige effekter ved gjentatte ganger avbildn...

I USA, legemidler og andre produkter beregnet på konsum krever omfattende vurdering før de er godkjent for privat bruk av Food and Drug Administration. Den økonomiske byrden for å utføre denne testingen er plassert på en utbygger, som vesentlig øker kostnadene for nye sammensatte utvikling og derfor oversettes til en økt kostnad for forbrukerne. Mens tradisjonelt mye av dette screening har benyttet dyr fag til å opptre som fullmektig for menneskelige verter, har dette vist seg å være en stor økonomisk byrde, med en anslått $ 2.8 milliarder brukt årlig på ADME / Tox (adsorpsjon, distribusjon, metabolisme, utskillelse og giftighet ) screening alene 2 og montering bevis som tyder på at dyremodeller ikke med sikkerhet kan forutsi menneskelige toksikologiske reaksjoner tre. Derfor har in vitro human cellekultur-basert testing vunnet popularitet de siste to tiårene på grunn av sin relativt laveremåltid, høyere gjennomstrømning, og bedre representasjon av human biotilgjengelighet og toksikologi 4.. Gjeldende cellekultur-baserte toksisitet screeningsmetoder benytter ulike endepunkter, for eksempel ved måling av ATP-nivåer, screening aktiviteten av endogent tilgjengelige cytoplasmatiske enzymer, sondering integriteten til den cellulære membran, eller sporing av nivået av mitokondriell aktivitet, for å evaluere cellulær levedyktighet 5 , 6. Imidlertid, uavhengig av endepunkt valgt, alle disse metodene krever ødeleggelse av prøven før målinger kan bli tatt, således bare produsere data på en eneste gang punkt. Som et resultat av et stort antall prøver må man fremstilt og behandlet parallelt for grunnleggende kinetikk toksikologiske studier, igjen å legge til kostnaden og arbeidskraft som kreves for ny sammensatt utvikling. Alternativt analyser ved hjelp skilles luciferase som Gaussia 7 luciferase, Vargula luciferase 8, og Metridia luciferase 9har blitt utviklet som eliminerer behovet for cellelyse og krever en brøkdel av media for endepunktet måling, men disse fortsatt begrenset til prøvetaking ved forutbestemte tidspunkter og også kreve tilsetning av eksogene lys-aktiverende substrater. For å unngå skade for nødvendig prøven ødeleggelse, så vel som for å eliminere kostnadene for substrater, har en human cellelinje blitt konstruert som uttrykker den fulle bakteriell bioluminescens (lux) genet kassett (luxCDABEfrp) for å tillate kontinuerlig overvåking av levende celler som ligner til fluorescerende fargestoff basert live-cell imaging, men uten de ekstra foton-aktiverende og mikroskopisk undersøkelse prosedyrer. Denne cellelinje er i stand til konstitutivt å produsere et optisk signal for et kontinuerlig og direkte deteksjon uten behov for ytre stimulering, slik at man unngår ødeleggelse av prøven. Mechanistically, bioluminescent signal genereres fra disse cellene føres når den luxAB-formet enzymet luciferase katalyserer oksydasjonen av en langkjedet fettsyre aldehyd (syntetisert og regenereres av luxCDE genprodukter ved hjelp av endogene substrater) i nærvær av redusert riboflavin fosfat (2 FMNH, som resirkuleres fra FMN av FRP gen produkt) og molekylært oksygen 10. Ekspresjon av den lux kassetten i vertscellen blir dermed mulig for lys å bli produsert og detektert uten cellulær ødeleggelse eller eksogent substrat tilsetningen. Likeledes sikrer samspill mellom de lux gener og endogent tilgjengelig FMN, og O 2 cosubstrates, og at kravet til vedlikehold av et miljø som kan støtte konvertering av FMN til FMNH 2, at den resulterende bioluminescent signalet kan bare oppdages ved å leve , metabolsk aktive celler. Disse kravene har tidligere blitt utnyttet for å vise at lux-based bioluminescent utgang korrelerer sterkt med mobilnettet befolkningen størrelse 11 og at giftig stoff eksponering svekker autobioluminescent produksjon i et dose-respons-fashion 12. Her bruker vi en tidligere preget autobioluminescent humane embryonale nyre (HEK293) cellelinje 11 for å demonstrere den automatiserte toksikologisk screening av et antibiotikum av bleomycin familie med kjent DNA ødeleggende aktivitet som et representativt eksempel å validere bruk av autobioluminescent mammalieceller for toksisitet testing.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging 2.0</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Newer updates of this software is available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 cell culture treated flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture-treated plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662174</td>
			<td>96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), phenol red-free</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3091003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids, 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic, 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate, 100mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin, 100 mg/ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R25001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripsin, 0.05%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autonomously bioluminescent mammalian cells for continuous and real-time monitoring of cytotoxicity

Pattedyrcellelinje-basert in vitro analyser har vært mye brukt som alternativer til dyreforsøk for toksikologiske studier, men har blitt begrenset på grunn av de høye penge-og tidskostnader av parallell prøveopparbeidelse som er nødvendiggjort på grunn av den destruktive natur firefly luciferase-baserte screening metoder . Denne filmen beskriver anvendelse av autonomt bioluminescent pattedyrceller, som ikke krever den destruktive tilsetning av luciferin en substrat, slik som en billig og anvendelige metoden for overvåking av den cytotoksiske effekten av en forbindelse av interesse. Pattedyrceller stabilt uttrykker den fulle bakteriell bioluminescens (luxCDABEfrp) genet kassett autonomt produserer et optisk signal som topper ved 490 nm uten tillegg av en kostbar og muligens forstyrre luciferin substrat, eksitasjon av en ekstern energikilde, eller ødeleggelse av prøven som er tradisjonelt utføres i løpet av optisk imaging prosedyres. Denne uavhengighet av ytre stimulering legger byrde for å opprettholde bioluminescent reaksjon utelukkende på cellen, noe som betyr at det resulterende signal blir detektert bare i løpet av aktiv metabolisme. Denne egenskapen gjør lux-uttrykke cellelinje en utmerket kandidat for bruk som en biosentinel mot cytotoksiske effekter fordi endringer i selvlysende produksjon er tegn på negative effekter på cellevekst og metabolisme. På samme måte tillater den autonome natur og mangel på nødvendig prøven ødeleggelse gjentatt avbildning av den samme prøve i sanntid gjennom hele perioden av toksikanten eksponering, og kan bli utført på tvers av flere prøver ved hjelp av eksisterende utstyr avbildning på en automatisert måte.

I denne studien ble dynamikken i autobioluminescent HEK293 celler måles kontinuerlig over en 24 timers periode i respons til antibiotikum eksponering (figur 1). De toksiske effektene av dette antibiotikum, som er et medlem av familien bleomycin kjent for å drepe levende celler ved å binde til DNA og spalte 13, ble demonstrert gjennom en nedgang i bioluminescent produksjon sammenlignet med ubehandlede celler, som kan være direkte visualisert gjennom PseudoColor bildene (Figur 2).</...

Watch this Scientific Journal Video about Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity at JoVE.com

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Pattedyrceller som uttrykker bakteriell Bioluminescens genet kassett (<em&gt; Lux</em&gt;) Produsere lys selvstendig. De resulterende selvlysende dynamikk ved kjemisk eksponering har vist seg å reflektere effekten av behandlingen på cellevekst og metabolisme, noe som gjør disse cellene en billig, kontinuerlig, real-time toksisitet screening verktøy som lett kan tilpasses for høy gjennomstrømming automatisering.

Autonomt Bioluminescent mammalieceller for Kontinuerlig og sanntids overvåking av Cytotoksisitet

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Real-time overvåkning av Ligand-reseptor interaksjoner med Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET Mikroskopi for sanntids overvåking av signalanlegg hendelser i levende celler Bruke Unimolecular biosensorer

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Overvåking plasmidreplikasjon i Live pattedyrceller over flere generasjoner av fluorescensmikropskopi

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Måling av Heme Synthesis Levels i pattedyrceller

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-baserte Real-time PCR tilnærminger for kvantitativ måling av microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

In situ overvåking av midlertidig dannet Molecular Anstandsdame forsamlinger i bakterier, gjær, og menneskelige celler

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...