Name: visualization of endoplasmic reticulum subdomains in cultured cells
Uploaded: 2014-02-18T13:45:00
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Les auteurs sont reconnaissants à Fondazione Filarète pour son aide et son appui à la publication de cet article. Nous tenons également à remercier Centro Europeo di Nanomedicina pour l&#39;utilisation du microscope électronique à transmission TECNAI G2.

Une. Plasmide, culture cellulaire, et transfection avec ER protéines fluorescentes <ol><li> Le plasmide utilisé dans cette étude est constitué d&#39;une version améliorée de la GFP fusionnée à son extrémité C-terminale de la région de la queue de l&#39;isoforme d&#39;ER de rat cytochrome b (5) (abrégé ici en tant que b (5)) par l&#39;intermédiaire d&#39;une séquence de liaison. La région de queue contient la séquence entière (Pro94-Asp134) qui reste associée à la membrane après le clivage par la t...

<ol>
	<li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum.">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li><li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+architecture:+structures+in+flux.">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li><li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum.">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).</li><li>Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-directional+protein+transport+between+the+ER+and.">Bi-directional protein transport between the ER and.</a> 20, 87-123 (2004).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).</li><li>Papiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restructured+endoplasmic+reticulum+generated+by+mutant+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+VAPB+is+cleared+by+the+proteasome.">Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome.</a> J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).</li><li>Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubic+membranes:+a+legend+beyond+the+Flatland*+of+cell+membrane+organization.">Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization.</a> J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).</li><li>Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+ER:+experimental+approaches+and+current+questions.">The dynamic ER: experimental approaches and current questions.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).</li><li>Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+1,4,5-trisphosphate+receptor+causes+formation+of+ER+cisternal+stacks+in+transfected+fibroblasts+and+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 12, 327-342 (1994).</li><li>Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+study+of+rat+liver+and+liver+neoplasms+after+long-term+treatment+with+phenobarbital.">Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital.</a> Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).</li><li>Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+reversible+restructuring+of+the+endoplasmic+reticulum+induced+by+PDMP+in+cultured+cells.">Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells.</a> J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13, 643-649 (2012).</li><li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres.">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease.">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li><li>Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+faces+of+protein+misfolding:+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases.">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li><li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways.">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP,+photoactivation,+photoconversion,+and+FLIP.">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li><li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats.">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li></ol>

Les protocoles et les méthodes d&#39;imagerie décrites dans le présent document ont été utilisées pour étudier la distribution et la mobilité des transfectées TA protéines fluorescentes résidents dans le RE de cellules vivantes. Nous avons également analysé l&#39;effet de l&#39;expression excessive de ces protéines sur l&#39;architecture de ce compartiment sous-cellulaire à l&#39;aide d&#39;analyses ultrastructurales. La combinaison de cellules vivantes imagerie confocale et l...

La découverte de la protéine verte fluorescente (GFP) et ses variantes spectrales, et le développement parallèle de la microscopie à fluorescence, ont ouvert complètement nouvelles avenues pour la recherche sur le comportement des protéines dans les cellules. Des techniques telles que la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la perte de fluorescence dans photoblanchiment (FLIP), qui sont possibles en raison de la capacité intrinsèque de fluorophores à éteindre leur fluorescence sous éclairage intense, sont basées sur l&#39;imagerie des cellules vivantes confocale et l&#39;utilisation de transfectées des protéines de fusion fluorescente 3.1. Ils sont largement utilisés pour évaluer non seulement la localisation des protéines, mais aussi leur mobilité et le transport vésiculaire, qui peut révéler des indices importants concernant leur fonction 4. La caractéristique unique des cellules eucaryotes est la présence de compartiments intracellulaires qui ont des compositions lipidiques et protéiques spécifiques. Bien que les organites sont physiquement isolated, ils doivent communiquer entre eux et partager des composants moléculaires, afin de maintenir l&#39;homéostasie cellulaire. La voie de sécrétion garantit que les protéines et les lipides synthétisés dans le RE atteindre la destination finale correcte dans laquelle ils exercent leur fonction. Organites intracellulaires peuvent également être reliés par des sites de contact dynamiques qui permettent aux molécules (lipides) pour être directement échangés entre les compartiments. En outre, de nombreuses protéines ont de grands complexes assemblés dans hétéromériques ou associé avec des espèces lipidiques spécifiques (radeaux lipidiques / microdomaines) afin de devenir fonctionnellement active ou être transportés vers leur destination finale. Tous ces aspects biologiques influencent fortement les propriétés cinétiques des protéines, et peuvent donc être étudiés de façon appropriée au moyen des techniques décrites ci-dessous. Notre groupe a largement utilisé FRAP et FLIP combinée avec la microscopie électronique pour étudier l&#39;architecture de l&#39;urgence et de ses différents sousdomaines. L&#39;ER est la première station de la voie de sécrétion et joue un rôle clé dans les protéines et les lipides de tri 5. Il est un organite très dynamique dont les sous-domaines distincts refléter ses nombreuses fonctions différentes (c&#39;est à dire des protéines et des lipides de biosynthèse et de la traite, le repliement des protéines, Ca 2 + stockage et la libération, et le métabolisme des xénobiotiques). Cependant, même si elles sont morphologiquement, spatialement et fonctionnellement distinctes, ces domaines sont continus les uns avec les autres, et leur abondance relative peuvent être modifiées dans des cellules dans des conditions physiologiques et pathologiques. Les plus connus et les domaines généralement spatialement distincts de l&#39;ER sont l&#39;enveloppe nucléaire, et le RE lisse et rugueux, mais nous et d&#39;autres avons démontré qu&#39;il existe des structures ER avec une architecture plus élaborée et organisation tridimensionnelle dans divers types de cellules et les tissus dans des conditions physiologiques qui peuvent également être induites par les moyens de stimuli stressants tels que l&#39;hypoxie, la drogueadministration, ou la sur-expression de protéines transmembranaires 2,6 ER-résident (et les références qui y sont). Nous avons récemment démontré la présence de telles structures dans des modèles cellulaires de maladies humaines 1,7. Originaire de la citernes empilées de RE lisse, ils ont reçu le nom collectif de réticulum endoplasmique lisse organisé (OSER) en 2003 6, mais ils sont également connus comme karmellae, lamelles, et cristalloïde ER sur la base de leur architecture qui, comme leur taille, peut varier. Après que les cellules sont transfectées avec la GFP fusionnée à la région de la queue cytosolique ancrée (TA) des protéines ER-résident (d EGFP-RE), la tendance à la dimérisation de la GFP dans faiblement trans altère considérablement l&#39;organisation et de la structure de l&#39;ER. FRAP et FLIP expériences ont montré que d EGFP-ER est libre de se diffuser à l&#39;intérieur OSER, et le fait qu&#39;il se déplace de l&#39;ER réticulaire à la OSER et vice versa &lt;/ Em&gt; indique que les agrégats sont en continuité avec l&#39;ER réticulaire environnante. L&#39;analyse ultrastructurale nous a permis de corréler les données de fluorescence avec une description détaillée de l&#39;architecture OSER et l&#39;organisation au niveau de l&#39;échelle nanométrique: OSER sont toujours constitués d&#39;empilements de citernes paires de RE lisse mais peuvent avoir différentes formes d&#39;organisation spatiale, tels que disposés régulièrement sinusoïdale tableaux ou des spirales, ou des tableaux tubulaires &quot;cristalloïdes&quot; hexagonaux. Ces réarrangements conduisent à des morphologies cubes 8 qui, comme ils l&#39;ont été trouvés dans les cellules dans des conditions physiologiques 9 et contraintes suivants tels que l&#39;hypoxie 10, traitement de la toxicomanie 11, et le cancer 9, peuvent avoir un potentiel important en tant que marqueurs ultrastructuraux. Après cette première démonstration en utilisant des protéines de fusion GFP, nous avons utilisé des expériences d&#39;imagerie pour analyser la prolifération des domaines de l&#39;urgence en réponse aux traitements pharmacologiques 12, assess la tendance des protéines fluorescentes pour oligomériser dans des cellules 13, et d&#39;enquêter sur le rôle d&#39;un mutant, protéines TA SLA liés à la formation d&#39;agrégats intracellulaires d&#39;origine ER qui peuvent être pertinents à son 1,8 de pathogénicité. Il a été suggéré que la formation d&#39;agrégats intracellulaires (ce qui se produit dans de nombreuses maladies neurodégénératives 14) peut être un mécanisme de protection destinée à empêcher les interactions entre les protéines mutantes toxiques et les composants de la cellule autour de 15. Ce qui suit est une description d&#39;une combinaison de méthodes de microscopie optique et électronique pour enquêter sur des constructions dont les C-terminal domaines hydrophobes sont insérés dans la membrane du RE, et une analyse de leur comportement dynamique et les effets de leur surexpression sur le domaine de l&#39;urgence l&#39;architecture à des cellules en culture (voir la figure 1 pour un organigramme du protocole expérimental).

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM) w/o phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31053028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>jetPEI</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>PP10110</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OxyFluor</td>
			<td>Oxyrase Inc.</td>
			<td>OF-0005</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde Grade I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Osmium Tetroxide 4% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Uranyl Acetate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>73943</td>
			<td>slightly radioactive</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propylene Oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82320</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EPON embedding medium kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45359-1EA-F</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lead Citrate </td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>17800</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bench top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectral Confocal Microscope </td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CO2 Microscope Cage Incubation System </td>
			<td>OkoLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ultramicrotome </td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Diamond knife </td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 45 &deg;</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Transmission Electron Microscope </td>
			<td>FEI</td>
			<td>Tecnai G2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad Software, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>steel culture cell chamber for 24 mm coverslip</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>CSC-25</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Electron Microscopy grids</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>G300Cu</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

visualization of endoplasmic reticulum subdomains in cultured cells

Les lipides et des protéines dans les cellules eucaryotes sont continuellement échangés entre compartiments cellulaires, bien que ceux-ci conservent leur composition et les fonctions distinctif malgré le trafic interorganelle moléculaire intense. Les techniques décrites dans le présent document sont des moyens puissants de l&#39;étude des protéines et de la mobilité des lipides et le trafic in vivo et dans leur environnement physiologique. récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la perte de la fluorescence dans photoblanchiment (FLIP) sont largement utilisés techniques d&#39;imagerie des cellules vivantes pour étudier le trafic intracellulaire par l&#39;intermédiaire de la voie de l&#39;exo-endocytose, la continuité entre les organelles ou des sous-compartiments, la formation de complexes protéiques, et la localisation des protéines en microdomaines lipidiques, qui peut être observée dans des conditions physiologiques et pathologiques. Les limites de ces approches sont principalement dues à l&#39;utilisation de protéines de fusion fluorescente, et leurs inconvénients potentiels comprennent un artefact sur-expression dans les cellules et la possibilité de différences dans le repliement et la localisation des protéines marquées et natives. Enfin, comme la limite de résolution de la microscopie optique (environ 200 nm) ne permet pas d&#39;enquête de la structure fine de l&#39;ER ou les sous-compartiments spécifiques qui peuvent provenir de cellules en situation de stress (c&#39;est à dire l&#39;hypoxie, l&#39;administration du médicament, l&#39;expression trop de transmembranaire protéines ER résidents) ou dans des conditions pathologiques, nous combinons l&#39;imagerie des cellules vivantes des cellules transfectées cultivées avec ultrastructurale analyse basée sur la microscopie électronique à transmission.

La figure 2 montre une étude d&#39;FRAP d&#39;exemple de la mobilité de la protéine. La mobilité de la protéine EGFP d-ER est démontrée par la récupération rapide de la fluorescence après photoblanchiment dans OSER blanchies. Pour l&#39;analyse quantitative, la mi-temps et fraction mobile ont été calculées à partir des données mesurées expérimentalement par ajustement de l&#39;équation monoexponentielle suivante: F (t) = F + poste (poste</...

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Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Nous décrivons des méthodes d&#39;imagerie nous utilisons pour étudier la distribution et la mobilité des protéines fluorescentes transfectées résidant dans le réticulum endoplasmique (RE) par l&#39;intermédiaire de l&#39;imagerie confocale de cellules vivantes. Nous analysons également ultrastructuralement l&#39;effet de leur expression sur l&#39;architecture de ce compartiment subcellulaire.

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