Name: visualization of endoplasmic reticulum subdomains in cultured cells
Uploaded: 2014-02-18T13:45:00
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Gli autori sono grati alla Fondazione Filarete per il suo aiuto e il sostegno nella pubblicazione di questo articolo. Vorremmo anche ringraziare Centro Europeo di Nanomedicina per l&#39;uso del microscopio elettronico a trasmissione Tecnai G2.

1. Plasmide, coltura cellulare, e Transfezione con ER proteine ​​fluorescenti <ol><li> Il plasmide utilizzato in questo studio consiste di una versione migliorata del GFP fusa al suo C-terminale della regione di coda della isoforma di ER ratto citocromo b (5) (abbreviato qui come b (5)) tramite una sequenza linker. La regione coda contiene l&#39;intera sequenza (Pro94-Asp134) che rimane membrana associato dopo la scissione di tripsina nativo b (5), compreso il TMD 17 residui (dominio transmembrana), fiancheggiata ...

<ol>
	<li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum.">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li><li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+architecture:+structures+in+flux.">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li><li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum.">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).</li><li>Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-directional+protein+transport+between+the+ER+and.">Bi-directional protein transport between the ER and.</a> 20, 87-123 (2004).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).</li><li>Papiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restructured+endoplasmic+reticulum+generated+by+mutant+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+VAPB+is+cleared+by+the+proteasome.">Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome.</a> J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).</li><li>Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubic+membranes:+a+legend+beyond+the+Flatland*+of+cell+membrane+organization.">Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization.</a> J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).</li><li>Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+ER:+experimental+approaches+and+current+questions.">The dynamic ER: experimental approaches and current questions.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).</li><li>Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+1,4,5-trisphosphate+receptor+causes+formation+of+ER+cisternal+stacks+in+transfected+fibroblasts+and+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 12, 327-342 (1994).</li><li>Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+study+of+rat+liver+and+liver+neoplasms+after+long-term+treatment+with+phenobarbital.">Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital.</a> Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).</li><li>Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+reversible+restructuring+of+the+endoplasmic+reticulum+induced+by+PDMP+in+cultured+cells.">Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells.</a> J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13, 643-649 (2012).</li><li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres.">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease.">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li><li>Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+faces+of+protein+misfolding:+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases.">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li><li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways.">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP,+photoactivation,+photoconversion,+and+FLIP.">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li><li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats.">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li></ol>

I protocolli e approcci di imaging descritti in questo documento sono stati utilizzati per studiare la distribuzione e la mobilità delle proteine ​​fluorescenti TA trasfettate residenti nel ER di cellule viventi. Abbiamo anche analizzato l&#39;effetto dell&#39;espressione eccessiva di queste proteine ​​sull&#39;architettura di questo compartimento subcellulare mediante analisi ultrastrutturali. La combinazione di live-cell imaging confocale e microscopia elettronica rappresenta è u...

La scoperta della proteina fluorescente verde (GFP) e le sue varianti spettrali, e lo sviluppo parallelo di microscopia a fluorescenza, hanno aperto completamente nuove strade per lo studio del comportamento delle proteine ​​nelle cellule. Tecniche come recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) e perdita di fluorescenza in photobleaching (FLIP), che sono possibili per la capacità intrinseca di fluorofori per estinguere la loro fluorescenza sotto illuminazione intensa, si basano su confocale live-cell imaging e l&#39;uso di trasfettati proteine ​​di fusione fluorescenti 1-3. Essi sono ampiamente utilizzati per valutare non solo la localizzazione delle proteine, ma anche la loro mobilità e del trasporto vescicolare, che può rivelare indizi importanti riguardanti la loro funzione 4. La caratteristica unica di cellule eucariotiche è la presenza di compartimenti intracellulari con specifici composizioni lipidiche e proteiche. Anche se organelli sono fisicamente isolatEd, hanno bisogno di comunicare tra loro e condividere componenti molecolari al fine di mantenere l&#39;omeostasi cellulare. La via secretoria garantisce che le proteine ​​e lipidi sintetizzati in ER raggiungere la destinazione finale corretto in cui esercitano la loro funzione. Organelli intracellulari possono anche essere collegati da siti di contatto dinamici che permettono molecole (lipidi) da scambiare direttamente tra compartimenti. Inoltre, molte proteine ​​devono assemblati in grandi complessi eteromerici o associati a determinate specie di lipidi (zattere lipidiche / microdomini) per diventare funzionalmente attivo o ad essere trasportati alla loro destinazione finale. Tutti questi aspetti biologici influenzare fortemente le proprietà cinetiche di proteine, e possono quindi essere opportunamente studiato mediante tecniche di seguito descritte. Il nostro gruppo ha ampiamente utilizzato FRAP e FLIP combinato con microscopia elettronica per studiare l&#39;architettura del ER e la sua diversa subdomini. La ER è la prima stazione della via secretoria e svolge un ruolo chiave nel proteine ​​e lipidi ordinamento 5. Si tratta di un organello altamente dinamica la cui sottodomini distinti riflettere le sue diverse funzioni (ad esempio proteine ​​e lipidi biosintesi e il traffico, proteine ​​pieghevoli, Ca 2 + stoccaggio e il rilascio, e il metabolismo xenobiotici). Tuttavia, anche se sono morfologicamente, spazialmente e funzionalmente distinte, questi domini sono continue tra loro, e la loro numerosità possono essere cambiate in cellule in condizioni fisiologiche e patologiche. Il più conosciuto e domini di solito spazialmente separate della ER sono la membrana nucleare, e la ER liscio e ruvido, tuttavia, noi ed altri abbiamo dimostrato che non ci sono strutture ER con un&#39;architettura più elaborata e l&#39;organizzazione tridimensionale in vari tipi di cellule e tessuti in condizioni fisiologiche che può anche essere indotta mediante stimoli stressanti quali ipossia, farmacoamministrazione, o l&#39;over-espressione di ER-residente proteine ​​transmembrana 2,6 (e riferimenti). Abbiamo recentemente dimostrato la presenza di tali strutture in modelli cellulari di malattie umane 1,7. Provenienti dalla cisterne pila di ER liscio, sono stati dati il nome collettivo di reticolo endoplasmatico liscio organizzata (OSER) nel 2003 6, anche se sono noti anche come karmellae, lamelle, e cristalloide ER sulla base della loro architettura che, come loro dimensione, può variare. Dopo che le cellule sono trasfettate con GFP fusa alla regione citosolica di coda ancorata (TA) proteine ​​ER-residente (d EGFP-ER), la tendenza debolmente dimerizing di GFP in trans altera drasticamente l&#39;organizzazione e la struttura del ER. FRAP e FLIP esperimenti hanno mostrato che d EGFP-ER è libero di diffondere all&#39;interno OSERs, e il fatto che si muove dal ER reticolare alla OSER e viceversa &lt;/ Em&gt; indica che gli aggregati sono continui con il reticolare circostante ER. Analisi ultrastrutturale ha permesso di correlare i dati di fluorescenza con una descrizione dettagliata di architettura OSER e di organizzazione a livello di nanoscala: OSERs sono sempre costituito da pile di cisterne abbinato di ER liscia, ma possono avere diverse forme di organizzazione spaziale, come regolarmente organizzato sinusoidale matrici o spirali, o esagonali &quot;cristalloidi&quot; matrici tubolari. Questi riarrangiamenti portano a morfologie cubi 8 che, così come sono stati trovati in cellule in condizioni fisiologiche 9 e seguenti sollecitazioni quali ipossia 10, il trattamento farmacologico 11, e cancro 9, possono avere un potenziale significativo come marcatori ultrastrutturali. Dopo questa prima dimostrazione utilizzando proteine ​​di fusione GFP, abbiamo usato esperimenti di imaging per analizzare la proliferazione di domini ER in risposta a trattamenti farmacologici 12, assess la tendenza delle proteine ​​fluorescenti a oligomerise in celle 13, e per studiare il ruolo di un mutante proteina TA ALS-linked nella formazione di aggregati intracellulari di origine ER che possono essere rilevanti per la sua 1,8 patogenicità. È stato suggerito che la formazione di aggregati intracellulari (che si verifica in molte malattie neurodegenerative 14) può essere un meccanismo protettivo progettato per prevenire le interazioni tra proteine ​​mutanti tossiche e le componenti cellulari circostanti 15. Quello che segue è una descrizione di una combinazione di metodi di microscopia ottica ed elettronica per lo studio costrutti cui C-terminale domini idrofobici sono inseriti nella membrana del ER, e l&#39;analisi del loro comportamento dinamico e gli effetti della loro iper-espressione di dominio ER architettura in cellule in coltura (vedere la Figura 1 per un diagramma di flusso del protocollo sperimentale).

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM) w/o phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31053028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>jetPEI</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>PP10110</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OxyFluor</td>
			<td>Oxyrase Inc.</td>
			<td>OF-0005</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde Grade I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Osmium Tetroxide 4% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Uranyl Acetate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>73943</td>
			<td>slightly radioactive</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propylene Oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82320</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EPON embedding medium kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45359-1EA-F</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lead Citrate </td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>17800</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bench top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectral Confocal Microscope </td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CO2 Microscope Cage Incubation System </td>
			<td>OkoLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ultramicrotome </td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Diamond knife </td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 45 &deg;</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Transmission Electron Microscope </td>
			<td>FEI</td>
			<td>Tecnai G2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad Software, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>steel culture cell chamber for 24 mm coverslip</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>CSC-25</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Electron Microscopy grids</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>G300Cu</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

visualization of endoplasmic reticulum subdomains in cultured cells

I lipidi e proteine ​​in cellule eucariotiche sono continuamente scambiati tra compartimenti cellulari, anche se questi mantengono la loro composizione distintivo e funzioni nonostante il traffico intenso interorganelle molecolare. Le tecniche descritte in questo documento sono potenti mezzi di studiare proteine ​​e lipidi mobilità e il traffico in vivo e nel loro ambiente fisiologico. Recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) e perdita di fluorescenza in photobleaching (FLIP) sono ampiamente utilizzati tecniche di live-cell imaging per studiare traffico intracellulare attraverso la via eso-endocitosi, la continuità tra organelli o sottocompartimenti, la formazione di complessi proteici, proteine ​​e localizzazione in microdomini lipidici, ognuno dei quali può essere osservato in condizioni fisiologiche e patologiche. I limiti di questi approcci sono principalmente dovute all&#39;uso di proteine ​​di fusione fluorescenti, e loro potenziali svantaggi includono artefatta over-esprimonoione nelle cellule e la possibilità di differenze nella piegatura e localizzazione delle proteine ​​marcate e native. Infine, come il limite di risoluzione della microscopia ottica (200 nm) non consente di indagine della struttura fine del ER o le sottocompartimenti specifici che possono provenire cellule sotto stress (cioè ipossia, la somministrazione del farmaco, l&#39;espressione eccessiva di transmembrana proteine ​​ER residenti) o in condizioni patologiche, uniamo live-cell imaging di cellule trasfettate coltivate con ultrastrutturali analisi sulla base di microscopia elettronica a trasmissione.

La Figura 2 mostra un esempio di studio FRAP mobilità proteina. La mobilità dei d proteina EGFP-ER è dimostrata dal rapido recupero di fluorescenza dopo photobleaching in OSERs sbiancato. Per l&#39;analisi quantitativa, il primo tempo e la frazione cellulare risultano dai dati misurati sperimentalmente inserendo la seguente equazione monoesponenziale: F (t) = F postale + (F rec-F post) (1-e-t / τ) <p class="jove_cont...

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Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Descriviamo gli approcci di imaging usiamo per indagare la distribuzione e la mobilità delle proteine ​​fluorescenti trasfettate residenti nel reticolo endoplasmatico (ER) mediante la microscopia confocale di cellule viventi. Abbiamo anche ultrastrutturalmente di analizzare l&#39;effetto della loro espressione sulla architettura di questo comparto subcellulare.

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