Name: visualization of endoplasmic reticulum subdomains in cultured cells
Uploaded: 2014-02-18T13:45:00
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著者らは、この記事の出版物でのヘルプとサポートのための伊Filareteに感謝しています。またTECNAI G2、透過型電子顕微鏡を使用するためのセントロEuropeoのディNanomedicinaに感謝したいと思います。

1。 ER蛍光タンパク質を用いて、プラスミド、細胞培養、およびトランスフェクション<ol><li>この研究で使用したプラスミドは、ラットシトクロムbのERアイソフォームのテール領域へのC-末端で融合GFPの拡張バージョンで構成され（5）リンカー配列を介して（bと（5）ここでは略す）。テール領域（5）は、アップストリームおよびダウンストリームの極性配列が隣接する17残基のTMD（膜貫通?...

<ol>
	<li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum.">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li><li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+architecture:+structures+in+flux.">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li><li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum.">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).</li><li>Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-directional+protein+transport+between+the+ER+and.">Bi-directional protein transport between the ER and.</a> 20, 87-123 (2004).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).</li><li>Papiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restructured+endoplasmic+reticulum+generated+by+mutant+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+VAPB+is+cleared+by+the+proteasome.">Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome.</a> J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).</li><li>Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubic+membranes:+a+legend+beyond+the+Flatland*+of+cell+membrane+organization.">Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization.</a> J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).</li><li>Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+ER:+experimental+approaches+and+current+questions.">The dynamic ER: experimental approaches and current questions.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).</li><li>Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+1,4,5-trisphosphate+receptor+causes+formation+of+ER+cisternal+stacks+in+transfected+fibroblasts+and+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 12, 327-342 (1994).</li><li>Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+study+of+rat+liver+and+liver+neoplasms+after+long-term+treatment+with+phenobarbital.">Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital.</a> Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).</li><li>Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+reversible+restructuring+of+the+endoplasmic+reticulum+induced+by+PDMP+in+cultured+cells.">Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells.</a> J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13, 643-649 (2012).</li><li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres.">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease.">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li><li>Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+faces+of+protein+misfolding:+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases.">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li><li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways.">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP,+photoactivation,+photoconversion,+and+FLIP.">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li><li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats.">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li></ol>

このホワイトペーパーで説明プロトコルおよびイメージングのアプローチは、生細胞の小胞体内に常駐トランスフェクションしたTAの蛍光タンパク質の分布や移動性を調査するために使用されてきた。我々はまた、超微細構造解析により、この細胞内区画のアーキテクチャにこれらのタンパク質の過剰発現の効果を分析した。 生細胞の共焦点イメージングおよび電子顕微...

緑色蛍光タンパク質（GFP）およびそのスペクトル変異体、および蛍光顕微鏡の並行開発の発見は、細胞におけるタンパク質の挙動の調査のための完全に新しい道を開いた。なぜなら強烈な照明の下での蛍光を消火する蛍光体の本質的な能力のために可能であるような（FRAP）を光退色後蛍光回復と（フリップ）の光退色の蛍光損失などの技術は、共焦点生細胞イメージングトランスフェクトの使用に基づいている蛍光融合タンパク質1-3。彼らは広く、その機能4に関する重要な手がかりを明らかにすることができ、タンパク質の局在だけでなく、彼らの機動性と小胞輸送だけでなく、を評価するために使用されています。 真核細胞のユニークな特徴は、特定の脂質およびタンパク質の組成物を有する細胞内コンパートメントの存在である。細胞小器官は、物理的に絶縁のあるですがオピニオン、それらは互いに通信し、細胞の恒常性を維持するために、分子成分を共有する必要がある。分泌経路は、ERで合成されたタンパク質や脂質は、彼らがその機能を発揮する正しい最終目的地に到達することが保証されます。細胞内小器官はまた、分子（脂質）が直接コンパートメントとの間で交換することを可能にする動的接触部位に接続することができる。さらに、多くのタンパク質は大きなヘテロ複合体で組み立てまたは機能的に活性になるか、その最終的な目的地に輸送されるために特定の脂質種（脂質ラフト/マイクロドメイン）に関連している。これらの生物学的局面の全てが大きく、タンパク質の動力学的特性に影響を与えるため、適宜、以下に記載される技術を用いて調べることができる。 我々のグループは、ERのアーキテクチャとその異なるサブを研究するために、電子顕微鏡と組み合わせ広く使われているFRAPやFLIPを持ってドメイン。 ER、分泌経路の最初のステーションであり、タンパク質および脂質5選別において重要な役割を果たしている。それは、その個別のサブドメイン（ すなわち 、タンパク質および脂質生合成および輸送、タンパク質の折り畳み、Ca 2 +の貯蔵と放出、および異物代謝）その多くの異なる機能を反映して非常にダイナミックな細胞小器官である。それらは形態学的に、空間的、および機能的に別個であるものの、これらのドメインは、互いに連続しており、それらの相対存在量は、生理学的および病理学的条件下で、細胞内で改変することができる。最もよく知られ、ERの通常空間的に分離されたドメインは、核膜、および平滑、粗ERであるが、我々及び他のER構造は、種々の細胞型におけるより精巧なアーキテクチャおよび三次元の組織に存在することが実証されているまた、低酸素症、薬物などのストレス刺激により誘導することができる、生理学的条件下での組織投与、またはERに存在する膜貫通タンパク質2,6の過剰発現（およびその中の参考文献）。 また、最近、ヒト疾患1,7の細胞モデルにおいて、このような構造の存在が実証されている。彼らはまた、彼らのような彼らのアーキテクチャに基づいてkarmellae、ラメラ 、及び晶質ERとして知られているが、滑らかなERの積み重ね嚢から発信さが、それらは、2003年6で編成滑面小胞体（OSER）の集合的な名前を与えられたサイズは、変えることができる。細胞が尾アンカー（TA）ERに存在するタンパク質（Dの EGFP-ER）の細胞質ゾル領域に融合GFPをトランスフェクトされた後、 トランスでGFPの弱い二量化傾向が劇的にERの組織や構造を変更します。 FRAPやFLIPの実験は、D EGFP-ERはOSERs内に拡散して自由であることを示した、それが&lt;OSERに網状ERから移動し、 その逆もあるという事実/ em&gt;は凝集体が周囲の網状のERと連続していることを示しています。超微細構造解析は、私たちは、ナノスケールレベルでのOSERアーキテクチャと組織の詳細な説明と蛍光データを相関させることができました。OSERsは、常に滑らかなERの対になった嚢のスタックで構成されていますが、このような規則的に正弦波に配置などの空間組織のさまざまな形態を有することができる配列や渦巻き、または六角形の「クリスタ」管状の配列。これらの再配列は、それらが生理学的条件下9および10低酸素症、薬物治療11、および癌9として以下の応力下で細胞中に見出されているように、超微細構造のマーカーとして大きな可能性を有していてもよい立方晶の形態8に導く。 GFP融合タンパク質を使用して、この最初の実証の後、我々は薬理学的治療12、ASSEに応答してERドメインの増殖を分析するためにイメージング実験を用いカテゴリーセル13にオリゴマー化するため、およびその病原1,8に関連し得るER由来の細胞内凝集体の形成における変異、ALS TA-結合タンパク質の役割を調べるために蛍光タンパク質の傾向。これは、（多くの神経変性疾患において生じる14）は、細胞内凝集物の形成が毒性変異体タンパク質及び周辺セル構成要素15との間の相互作用を防止するように設計された保護メカニズムであり得ることが示唆されている。 以下は、そのC末端疎水性ドメインはERの膜に挿入され、それらの動的挙動の解析およびERドメインに対するそれらの過剰発現の効果を調査するための構築物の光学および電子顕微鏡法の組合せの説明である培養細胞におけるアーキテクチャ（実験プロトコルのフローについては図1を参照）。

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM) w/o phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31053028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>jetPEI</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>PP10110</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OxyFluor</td>
			<td>Oxyrase Inc.</td>
			<td>OF-0005</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde Grade I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Osmium Tetroxide 4% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Uranyl Acetate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>73943</td>
			<td>slightly radioactive</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propylene Oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82320</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EPON embedding medium kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45359-1EA-F</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lead Citrate </td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>17800</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bench top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectral Confocal Microscope </td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CO2 Microscope Cage Incubation System </td>
			<td>OkoLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ultramicrotome </td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Diamond knife </td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 45 &deg;</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Transmission Electron Microscope </td>
			<td>FEI</td>
			<td>Tecnai G2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad Software, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>steel culture cell chamber for 24 mm coverslip</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>CSC-25</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Electron Microscopy grids</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>G300Cu</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

visualization of endoplasmic reticulum subdomains in cultured cells

これらは強烈interorganelle分子のトラフィックにもかかわらず、彼らの独特の構成と機能を保持しているが、真核細胞での脂質とタンパク質が連続的に、細胞区画間で交換される。このホワイトペーパーに記載されている技術は、 生体内とその生理的な環境で、タンパク質や脂質の移動と人身売買を研究する強力な手段である。 （FLIP）の光退色で（FRAP）の光退色後の蛍光回復および蛍光損失が広くエキソ - エンドサイトーシス経路、オルガネラまたはサブコンパートメント間の連続性、タンパク質複合体の形成、およびタンパク質局在化を介して細胞内輸送を研究するための生細胞イメージング技術を用いている脂質ミクロドメインに、それらの全ては生理学的および病理学的条件下で観察することができる。これらのアプローチの限界は、主に蛍光性融合タンパク質の使用によるものであり、それらの潜在的な欠点は、過剰発現アーチファクトを含む細胞内のイオンと、タグ付きおよび天然のタンパク質のフォールディングおよびローカリゼーションの違いの可能性。最後に、光学顕微鏡（約200nm）の解像度の限界としてストレス下の細胞に由来することができERまたは特定のサブコンパートメントの微細構造の調査を許可していない（ すなわち低酸素症、薬物投与、膜貫通の過剰発現ER常在性タンパク質）または病理学的条件の下で、我々は超微細で培養されたトランスフェクトされた細胞の生細胞イメージングを組み合わせることは、透過型電子顕微鏡法に基づいて解析する。

図2は、タンパク質の移動の例FRAP研究を示しています。 dは EGFP-ERタンパク質の移動度は、漂白OSERsに光退色後蛍光回復急速によって実証される。定量分析のために、半分の時間、モバイル画分は、以下の単一指数の式を当てはめることによって実験的に測定されたデータから導出された。 F（T）= F ポスト +（F REC-Fポスト ）（1-E...

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Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

私たちは、生きた細胞の共焦点イメージングにより、小胞体（ER）に常駐トランスフェクションし、蛍光タンパク質の分布や移動性を調査するために使用して画像化のアプローチについて説明します。また、超微細構造、この細胞内区画のアーキテクチャにその発現の効果を分析する。

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