Name: retrograde labeling of retinal ganglion cells in adult zebrafish with fluorescent dyes
Uploaded: 2014-05-03T14:00:00
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This is supported by 973 MOST grant (Grant No. 2011CB504402, 2012CB947602), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91132724, U1332136) and the 'Hundred Talents Project' of Chinese Academy of Science. The protocol was approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the USTC (Permit Number: USTCACUC1103013).

1. 수술기구를 구축 참고 :시 및 작업, 드립 마취 솔루션 에틸 3 - 아미노 벤조 에이트 메탄 (MS-222, 또는 Tricaine) 물고기의 입을 통해 1 방울 / sec의 속도로 반 농도 (0.015 %)에서 후 물고기가 살아 남아 있도록하려면 그림 1 및 자작 물방울 시스템을 사용. <ol><li> 도 1a에 도시 된 바와 같이 상자 만들기 (길이 폭 높이 5 cm의 10 cm의 28 cm입니다), 중간 (길이 폭...

<ol>
	<li>Wyatt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+astray/robo2+zebrafish+mutant+reveals+that+degenerating+tracts+do+not+provide+strong+guidance+cues+for+regenerating+optic+axons.">Analysis of the astray/robo2 zebrafish mutant reveals that degenerating tracts do not provide strong guidance cues for regenerating optic axons.</a> J Neurosci. 30, 13838-13849 (2010).</li><li>Grieshaber, P., Lagreze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+fluorogold-prelabeled+retinal+ganglion+cells+with+calcein-AM:+A+new+method+for+assessing+cell+vitality.">Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality.</a> J Neurosci Methods. 192, 233-239 (2010).</li><li>Schwalb, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+factors+secreted+by+the+goldfish+optic+nerve+induce+retinal+ganglion+cells+to+regenerate+axons+in+culture.">Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture.</a> J Neurosci. 15, 5514-5525 (1995).</li><li>Watanabe, M., Inukai, N., Fukuda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+retinal+ganglion+cells+after+transection+of+the+optic+nerve+in+adult+cats:+a+quantitative+study+within+two+weeks.">Survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats: a quantitative study within two weeks.</a> Vis Neurosci. 18, 137-145 (2001).</li><li>Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+by+application+of+fluoro-gold+on+the+surface+of+superior+colliculus.">Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Bakken, T. E., Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+system+scaling+in+teleost+fish.">Visual system scaling in teleost fish.</a> J Comp Neurol. 520, 142-153 (2012).</li><li>Zhou, L. X., Wang, Z. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+number+and+distribution+of+retinal+ganglion+cells+after+optic+nerve+crush+in+zebrafish.">Changes in number and distribution of retinal ganglion cells after optic nerve crush in zebrafish.</a> Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 159-162 (2002).</li><li>Sherpa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganglion+cell+regeneration+following+whole-retina+destruction+in+zebrafish.">Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish.</a> Dev Neurobiol. 68, 166-181 (2008).</li><li>Zou, S., Tian, C., Ge, S., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+of+retinal+ganglion+cells+is+not+essential+to+visual+functional+recovery+after+optic+nerve+injury+in+adult+zebrafish.">Neurogenesis of retinal ganglion cells is not essential to visual functional recovery after optic nerve injury in adult zebrafish.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Choi, D., Li, D., Raisman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+retrograde+neuronal+tracers+that+label+the+rat+facial+nucleus:+a+comparison+of+Fast+Blue,+Fluoro-ruby,+Fluoro-emerald,+Fluoro-Gold+and+DiI.">Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: a comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI.</a> J Neurosci Methods. 117, 167-172 (2002).</li><li>Zou, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+optokinetic+response+to+study+visual+function+of+zebrafish.">Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Tokuoka, H., Yoshida, T., Matsuda, N., Mishina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+glycogen+synthase+kinase-3beta+of+the+arborization+field+and+maturation+of+retinotectal+projection+in+zebrafish.">Regulation by glycogen synthase kinase-3beta of the arborization field and maturation of retinotectal projection in zebrafish.</a> J Neurosci. 22, 10324-10332 (2002).</li><li>Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GFP-based+genetic+screen+reveals+mutations+that+disrupt+the+architecture+of+the+zebrafish+retinotectal+projection.">A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection.</a> Development. 132, 2955-2967 (2005).</li><li>Li, L., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+olfactoretinal+centrifugal+pathway+may+relate+to+the+visual+system+defect+in+night+blindness+b+mutant+zebrafish.">Disruption of the olfactoretinal centrifugal pathway may relate to the visual system defect in night blindness b mutant zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 20, 1883-1892 (2000).</li><li>Kassing, V., Engelmann, J., Kurtz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Single-Cell+Responses+in+the+Optic+Tectum+of+Adult+Zebrafish+with+Dextran-Coupled+Calcium+Dyes+Delivered+via+Local+Electroporation.">Monitoring of Single-Cell Responses in the Optic Tectum of Adult Zebrafish with Dextran-Coupled Calcium Dyes Delivered via Local Electroporation.</a> PLoS One. 8, (2013).</li></ol>

망막 신경절의 역행 라벨은 포유류 동물의 망막 신경절의 생존을 연구하는 것이 중요하지만, 제브라 피쉬에서 사용되지 않았습니다. 다른 방법은, 그가 7 염색 및 항체 염색 (8), 망막 신경절의 수를 계산 골드 표준, 표시된 모든 망막 신경절과 유전자 변형 라인하지 않는 것은 아직 12, 13을 구성되지 않았습니다. 이 비디오에서는, 우리는 성인 zebrafish의 망막에 라벨 망막 신...

성인 제브라 피쉬가 계산하는 시신경 손상 1 일 이후 축삭을 재생 할 수있는 강력한 능력, 적절한 방법이으로 전체 망막 신경절은 망막 신경절의 생존과 재생 2을 평가하는 것이 필수적입니다. 포유 동물과 금붕어 3 역행 라벨 망막 신경절의 방법에 따라 - 5, 우리는 성인 제브라 피쉬의 tectum에서 망막 신경절 레이블을하는 방법을 건설했다. 성인 제브라 피쉬의 경우, 두 가지 중요한 기술적 인 문제는 주목해야한다 : 성인 제브라 피쉬의 두개골에는 6 개의 아주 작은; 그들은 물 환경에서 살고있다. 여기, 우리는 5 시추와 관련된 위험을 최소화 에칭액 두개골을 취급합니다. 다음, 우리는 수술 후 동물의 생존을 향상 광중합 결합으로 구멍을 밀봉. 이전에는 몇 가지 다른 기술은 간접 방법으로 망막 신경절의 수를 계산하기 위해 채택되었다. HE가 망막 부분에서 염색하면 RGCL 7 세포의 모든 종류의 라벨. 전체 R 항체 라벨링이러한 섬-1과 etina는 또한 무 축삭 세포 8 레이블을 지정할 수 있습니다. 시신경의 그루터기에서 역행 레이블이 망막에있는 망막 신경절 라벨을 할 수 있지만 그것은 시신경에 추가 부상의 원인이되기 때문에, 그것은 호감 모델에 채택 할 수 없습니다. tectum에서 역행 라벨을 활용, 우리는 시신경의 호감에서 망막 신경절의 생존과 재생을 연구했다. 결과는 거의 모든 망막 신경절이 살아 망막 신경절의 90 % 이상이 호감 모델 9의 첫 번째 주에 tectum에 재생 보여줍니다. 모두 성공적으로 망막 신경절 레이블을하기 위해, DII 페이스트는 여러 가지 다른 상업용 염료 (10)와 비교 후 선택되었다. 첫째, 특히 생체 조직 라벨링을 위해 설계되었습니다. 둘째, 물을 확산 할 수있는 친 유성 염료이다. 또한,이 형광은 망막 신경절 생존 연구를위한 훌륭한 후보하게 오랫동안 지속 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<tbody>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:152px;">MS222</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">E10521</td>
			<td style="width:152px;">USA</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:152px;">DiI</td>
			<td style="width:152px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">N22880</td>
			<td style="width:152px;">USA</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:152px;">lightcuring bond</td>
			<td style="width:152px;">Heraeus Kulzer&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Durafill bond</td>
			<td style="width:152px;">Germany</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:152px;">Gluma Etch</td>
			<td style="width:152px;">Heraeus Kulzer&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Gluma Etch 35 Gel</td>
			<td style="width:152px;">Germany</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:152px;">Blue LED</td>
			<td style="width:152px;">Shenruo Medical Equipment Co.</td>
			<td style="width:152px;">Power Blue Light Curing Unit</td>
			<td style="width:152px;">China</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde labeling of retinal ganglion cells in adult zebrafish with fluorescent dyes

로 역행 라벨 망막 신경절 세포 (망막 신경절)이 사이트를 죽음에서 망막 신경절의 인 somata를 분리 할 수​​ 있습니다, 그것은 망막 신경절의 생존과 재생 실험에서 망막 신경절을 계산위한 황금 표준이되었습니다. 많은 연구 시신경 손상 후 망막 신경절 생존 조회 포유류 동물에서 수행되었다. 몇 가지 다른 방법은 망막 신경절 세포 레이어 (RGCL)의 세포 수를 셀 수 있지만 그러나, 성인 zebrafish에있는 망막 신경절의 역행 라벨은 아직보고되지 않았습니다. 성인 zebrafish의 두개골의 작은 크기와 두개골에 드릴링 후에 사망 고위험 감안하면 산 - 에칭에 도움으로 두개골을 열고 크게 생존율을 향상시킬 수있는 광 경화성 본드로 구멍을 밀봉. 5 일 동안 염료를 흡수 한 후, 거의 모든 망막 신경절이 표시되어 있습니다. 이 방법은 시신경을 절개 할 필요가 없다, 그것은 성인 zebrafish에있는 시신경의 호감 후 망막 신경절 생존의 연구에 바꾸어 놓을 수없는 것입니다. 여기, 우리는 소개이 방법을 단계별로하고 대표적인 결과를 제공합니다.

도 4B-D 쇼 같이, DII + 세포의 수는 RGCL 소재 DAPI + 세포의 3 분의 2이다. 정상적인 망막에서 전체 망막 (그림 4E)의 몽타주 이미지 DII + 망막 신경절이 중앙 지역에있는 망막 신경절이 그들의 목표에 다시 생성되지 않은으로 전체 망막에 있지만, 재생 된 망막 (그림 4 층)에 분포되어 있음을 보여줍니다 첫 주에, 그들은 표시 할 수 없습니다....

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Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

형광 염료와 성인 Zebrafish의 망막 신경절 세포의 퇴행성 라벨링

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

연구

신경과학

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

전압에 민감한 염료와 크랩 Stomatogastric 신경절에서 뉴런의 광학 이미징

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

신경, 책자, 그리고 형광 염료와 척수 뿌리 역행로드

Retrograde labeling of neurons is a standard anatomical method1,2 that has also been used to load calcium and voltage-sensitive dyes into neurons3-6. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

마우스 망막 신경절 세포의 시냅스와 인공 컨덕턴스와 동적 클램프 구현

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

성인 Zebrafish의 망막 재생 연구에있는 사용을위한 비발 한 가벼운 손상 패러다임

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...