Name: nucleofection of rodent neuroblasts to study neuroblast migration in vitro
Uploaded: 2013-11-12T19:00:00
Duration: 11 min 32 s
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इस काम पीडी और जीएल के लिए सम्मानित किया वेलकम ट्रस्ट परियोजना अनुदान (089236/Z/09/Z) द्वारा वित्त पोषित किया गया. एसजी एक जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद पीएचडी छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित किया गया. हम Neuroblast nucleofection पर मूल्यवान सलाह के लिए shRNA वेक्टर और जेनिफर Shieh की तरह उपहार के लिए Matthieu Vermeren धन्यवाद.

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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

ओबी में अंतिम स्थान पर आरएमएस साथ neuroblasts के प्रवास प्रसवोत्तर neurogenesis में एक बुनियादी कदम है. हालांकि, इस जटिल प्रक्रिया को नियंत्रित करने के आणविक तंत्र अब तक पूरी तरह समझा जा रहा से कर रहे हैं. यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रिया विट्रो में Neuroblast प्रवास के अध्ययन की अनुमति देता है. हम जल्दी प्रसव के बाद माउस या चूहा 25 से आरएमएस neuroblasts अलग करने के लिए एक पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल ढाल लिया है. यह एक न्यूनतम करने के लिए विच्छेदन और nucleofection के बीच समय अंतराल रखने के लिए महत्वपूर्ण है के बाद से इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए यह, विच्छेदन कदम मास्टर करने के लिए महत्वपूर्ण है. Nucleofection के बाद, neuroblasts, reaggregated किया जा सकता है एक तीन आयामी मैट्रिक्स में एम्बेडेड और एक 24 घंटे की अवधि में विस्थापित करने के लिए छोड़ दिया है. वैकल्पिक रूप से, माइग्रेशन (जैसे immunofluorescence या पश्चिमी धब्बा विश्लेषण) के अलावा अन्य प्रयोजनों के लिए, कोशिकाओं तुरंत polyornithine/laminin- पर nucleofection के बाद चढ़ाया जा सकता हैवे 4-5 दिनों तक जीवित रहते हैं जहां लेपित coverslips,. माउस और चूहा neuroblasts एक समान हद तक Matrigel में विस्थापित, लेकिन चूहे की कोशिकाओं चूहे की कोशिकाओं से जंजीरों में माइग्रेट करने के लिए एक मजबूत प्रवृत्ति दिखाई देते हैं. अध्ययन का उद्देश्य पर निर्भर करता है, neuroblasts फ्लोरोसेंट प्रोटीन या ब्याज के जंगली प्रकार / उत्परिवर्ती प्रोटीन एन्कोडिंग अलग plasmids के साथ nucleofected किया जा सकता है. (सीएमवी बढ़ाने और β ग्लोबिन पाली एक पूंछ के साथ β-actin के प्रमोटर) एक सीएजी प्रमोटर के साथ इष्टतम प्रोटीन अभिव्यक्ति plasmids के लिए 26 अत्यधिक की सिफारिश कर रहे हैं. इसके अलावा, siRNA oligos या shRNA plasmids ब्याज का लक्ष्य पछाड़ना के nucleofected किया जा सकता है. प्रभावी प्रोटीन कमी immunofluorescence द्वारा या वेस्टर्न ब्लॉट (आमतौर पर मानक lysis बफर के 50 μl के साथ 1 चूहे पिल्ला से एम्बेडेड समुच्चय lysing) द्वारा देखे जा सकते हैं. Nucleofection, प्राथमिक neuroblasts transfect करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल विधि है छठे के लिए एक आसान और तेजी से विकल्प प्रदान करता हैRAL वेक्टर की मध्यस्थता अभिकर्मक, और उच्च (~ 70-80%) अभिकर्मक दक्षता हासिल कर सकते हैं. यह काफी सेल व्यवहार्यता कम कर देता है एक लंबे समय के लिए nucleofection समाधान में neuroblasts छोड़ने के बाद से, nucleofection प्रक्रिया के दौरान तेजी से काम करने के लिए महत्वपूर्ण है. आरएमएस विच्छेदन से औसत सेल उपज P7 चूहों की तुलना में (~ 5 x 10 5 कोशिकाओं / मस्तिष्क) P7 चूहों के लिए अपेक्षाकृत कम है (~ 1 x 10 6 कोशिकाओं / मस्तिष्क) और nucleofection के अनुसार कम से कम 3 x 10 6 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है 50% दक्षता ~ साथ अभिकर्मक प्राप्त करने के लिए. इसके अलावा, चूहे neuroblasts माउस neuroblasts की तुलना में nucleofection को बेहतर विरोध करने के लिए दिखाई देते हैं. इसलिए, जल्दी प्रसव के बाद (P6-P7) चूहे पिल्ले भी चूहा और माउस आरएमएस के संगठन उल्लेखनीय सिमी हैं, विचार है कि एक सुविधाजनक Neuroblast स्रोत का प्रतिनिधित्व हो सकताLAR 27 और कहा कि इन विट्रो में चूहा और माउस Neuroblast प्रवास की हद तक भी तुलनीय है. यह सेल आकारिकी और माइग्रेशन (हमारे अप्रकाशित टिप्पणियों) पर असामान्य प्रभाव से बचने के लिए 48 घंटे से अधिक समय के लिए निलंबन में nucleofected neuroblasts के reaggregated समूहों रखने के लिए उचित नहीं है. यहाँ वर्णित 3D परख मैट्रिक्स (जैसे. 24 घंटे) में एम्बेड करने के बाद एक निश्चित समय बिंदु पर Neuroblast प्रवास यों इस्तेमाल किया जा सकता है. समुच्चय के आकार और प्रवास दूरी (हमारे अप्रकाशित टिप्पणियों) के बीच कोई महत्वपूर्ण संबंध के बाद से वहाँ विभिन्न आकार के समुच्चय, विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा सकता है. कल्पना और आगे Neuroblast प्रवास की गतिशीलता की जांच, समय चूक इमेजिंग का इस्तेमाल किया जा सकता है. यह neuroblasts की गति काफी लंबे समय के अंक में (हमारे अप्रकाशित टिप्पणियों) में कमी करने के लिए प्रकट होता है के बाद से, एम्बेड करने के बाद एक 24 घंटे के अंतराल के भीतर माइग्रेशन विश्लेषण से बाहर ले जाने की सिफारिश की है. &lt;/ P&gt; इस प्रोटोकॉल के लिए कुछ सीमाएं हैं. वायरल वैक्टर के साथ संक्रमण वयस्क neuroblasts 28 के लिए सबसे कुशल अभिकर्मक विधि बनी हुई है, जबकि पहले, nucleofection अब तक, जल्दी प्रसव के बाद कृंतक neuroblasts के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दूसरा, इन विट्रो प्रवास परख पूरी तरह vivo में मनाया आरएमएस की जटिल वास्तुकला पुन: पेश नहीं करता है. दरअसल, neuroblasts वे ऐसे भी उनकी गतिशीलता 9,29 को विनियमित करने के लिए जो योगदान astrocytes और रक्त वाहिकाओं के रूप में अन्य आरएमएस घटकों के साथ बातचीत की कमी यहां वर्णित प्रयोगात्मक सेटअप में, उनके vivo समकक्षों के लिए एक समान तरीके से विस्थापित करने की क्षमता बनाए रखने के लिए हालांकि, 30. यह समस्या तीन आयामी coculture मॉडल प्रणाली के अनुकूलन द्वारा भविष्य में संबोधित किया जा सकता है. अंत में, एक 3 डी प्रवास परख के साथ nucleofection संयोजन बेहतर अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता हैNeuroblast प्रवास. इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया आगे vivo में प्रसव के बाद electroporation और मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों के समय चूक इमेजिंग जैसे अन्य तरीकों से मान्य किया जा सकता है, जो Neuroblast प्रवास के उम्मीदवार नियामकों की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए एक, प्रारंभिक तेजी से और अपेक्षाकृत सरल तरीका प्रदान करता है 28,31,32 .

नए न्यूरॉन्स (न्यूरोजेनेसिस) की प्रसव के बाद स्तनधारी मस्तिष्क, पीढ़ी में जीवन भर होता है और दो ​​तंत्रिकाजन्य आलों तक ही सीमित है: पार्श्व ventricles के subventricular क्षेत्र (SVZ) और हिप्पोकैम्पस 1 की दांतेदार गाइरस के subgranular क्षेत्र. हाल ही में कई अध्ययनों से सीखने और स्मृति कार्यों 2,3 सुविधाजनक बनाने में वयस्क neurogenesis की महत्वपूर्ण भूमिका से पता चला है. इसके अलावा, मस्तिष्क की चोट 4-7 निम्नलिखित तंत्रिका progenitors के प्रसार और भर्ती के सबूत तंत्रिका मरम्मत में neurogenesis के औषधीय सक्रियण की संभावना को जन्म देती है. प्रसव के बाद न्यूरोजेनेसिस सख्ती से तंत्रिका पूर्वज प्रसार, प्रवास, भेदभाव, अस्तित्व, और नए पैदा हुए न्यूरॉन्स 8 के अंतिम synaptic एकीकरण में शामिल हैं जो अपने सभी चरणों में नियंत्रित किया जाता है. SVZ में स्टेम सेल से प्राप्त तंत्रिका progenitors (neuroblasts) विजय - स्तम्भ प्रवासी के माध्यम से एक महान दूरी पर विस्थापितवे कार्यात्मक न्यूरॉन्स 9 में परिपक्व जहां घ्राण बल्ब (ओ) की ओर धारा (आरएमएस). प्रवासी neuroblasts एक एकल अग्रणी प्रक्रिया का विस्तार एक लम्बी सेल शरीर के साथ, मुख्य रूप से एकध्रुवीय हैं. इन कोशिकाओं को एक दूसरे पर 10 स्लाइडिंग, एक सामूहिक तरीके से जंजीरों में चलते हैं. प्रवासन कार्यात्मक न्यूरॉन्स 11 में SVZ व्युत्पन्न progenitors के बाद परिपक्वता के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है और सहित कई कारकों और मार्गदर्शन के अणुओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है: polysialylated तंत्रिका कोशिका आसंजन अणु (पीएसए NCAM) 12, Ephrins 13, 14 integrins, slits 15, विकास 16 कारकों और 17 न्यूरोट्रांसमीटर, हालांकि इस प्रक्रिया अंतर्निहित आणविक तंत्र पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं. Neuroblast प्रवास को विनियमित intracellular संकेत दे रास्ते की जांच कर वयस्क neurogenesis की एक बेहतर समझ प्रदान करेगा न केवल, लेकिन यह भी नए चिकित्सकीय के विकास के लिए योगदान देगामस्तिष्क की मरम्मत को बढ़ावा देने के दृष्टिकोण. इस पांडुलिपि nucleofection और एक 3 डी प्रवास परख का उपयोग इन विट्रो में Neuroblast प्रवास के उम्मीदवार नियामकों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. Nucleofection electroporation के एक उन्नत विधि पर आधारित एक सेल अभिकर्मक तकनीक है. सेल प्रकार विशिष्ट बिजली के वर्तमान और nucleofection समाधान की अनुमति सीधे सेल नाभिक और धीरे से विभाजित या mitotically भ्रूण और स्तनधारी न्यूरॉन्स 18 की तरह निष्क्रिय कोशिकाओं का परमिट अभिकर्मक में इस तरह के डीएनए और shRNA वैक्टर और siRNA oligonucleotides के रूप में polyanionic अणुओं का हस्तांतरण. इस विधि, तेजी से प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान और प्राथमिक neuroblasts और न्यूरॉन्स 19-21 सहित सेल प्रकार की एक विस्तृत रेंज का अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अभिकर्मक में परिणाम है. आरएमएस ऊतक की हदबंदी सफलतापूर्वक डीएनए / SHR साथ nucleofected किया जा सकता है जो प्रवासी neuroblasts के अलगाव की अनुमति देता हैएनए वैक्टर या siRNA oligos ब्याज की जीन को लक्षित. Nucleofection के बाद, neuroblasts बूँदें फांसी में reaggregated कर रहे हैं और बाद में एक तीन आयामी Matrigel मैट्रिक्स में एम्बेडेड. ये स्थितियां इस प्रकार Neuroblast प्रवास में शामिल संकेत दे रास्ते की जांच करने के लिए और इन कोशिकाओं की गतिशीलता पर औषधीय उपचार के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक शानदार मॉडल प्रणाली प्रदान करने, neuroblasts vivo में मनाया प्रवास मोड recapitulating सेल समुच्चय से बाहर पलायन करने की अनुमति.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:255px;">14175129</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">HEPES</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">2.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>store 200 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">DNAse I Vial (D2)</td>
			<td style="width:339px;">Worthington</td>
			<td style="width:255px;">LK003170</td>
			<td>&#8805;1,000 units per vial; store 50 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td style="width:255px;">11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:339px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH3007902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td style="width:255px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">D-(+)-Glucose solution (45%)</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-free, 10 ml, LDEV-Free</td>
			<td style="width:339px;">BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>prepare 120 &#181;l aliquots at 4 &#176;C, then store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">PFA</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">441242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Sucrose</td>
			<td style="width:339px;">BDH</td>
			<td style="width:255px;">102745C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Goat serum</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">69023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:339px;">VWR International Ltd.</td>
			<td style="width:255px;">306324N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">BSA</td>
			<td style="width:339px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:255px;">BPE9701-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Dako fluorescence mounting medium</td>
			<td style="width:339px;">Dako</td>
			<td style="width:255px;">S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Rat neuron nucleofection kit</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;">VPG-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Mouse neuron nucleofection kit</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;">VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Microsurgical knife</td>
			<td style="width:339px;">Angiotech</td>
			<td style="width:255px;">7516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:339px;">The Mickle Laboratory Engineering Company</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Nucleofector II</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleofection of rodent neuroblasts to study neuroblast migration in vitro

पार्श्व निलय की पार्श्व दीवार में स्थित subventricular क्षेत्र (SVZ) वयस्क neurogenesis में एक मौलिक भूमिका निभाता है. मस्तिष्क के इस प्रतिबंधित क्षेत्र में, तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को पैदा करना और लगातार घ्राण बल्ब (ओ) तक पहुँचने के लिए विजय - स्तम्भ प्रवासी धारा (आरएमएस) के साथ जंजीरों में tangentially विस्थापित कि neuroblasts उत्पन्न करते हैं. एक बार ओबी में, neuroblasts रेडियल प्रवास करने के लिए स्विच और फिर पहले से मौजूद neuronal नेटवर्क में शामिल करने में सक्षम परिपक्व न्यूरॉन्स में अंतर. उचित Neuroblast प्रवास नवजात न्यूरॉन्स की सही कार्यात्मक परिपक्वता सुनिश्चित करने, neurogenesis में एक बुनियादी कदम है. उनकी गतिशीलता अंतर्निहित intracellular तंत्र की जांच, मस्तिष्क में घायल क्षेत्रों को लक्षित करने के SVZ व्युत्पन्न neuroblasts की क्षमता को देखते हुए neurogenesis की समझ में वृद्धि होगी ही नहीं बल्कि neuroregenerative रणनीतियों के विकास को बढ़ावा देने सकता है. इस पांडुलिपि एक विस्तृत वर्णन किया गया हैप्राथमिक कृंतक की अभिकर्मक के लिए प्रोटोकॉल प्रसव के बाद neuroblasts और vivo में मनाया प्रवास के अपने मोड recapitulating एक 3 डी में इन विट्रो प्रवास परख का उपयोग उनके गतिशीलता का विश्लेषण RMS. दोनों चूहा और माउस neuroblasts प्लास्मिड डीएनए, छोटे बाल के लिये कांटा (एसएच) शाही सेना या शाही सेना कम oligos ब्याज की जीन को लक्षित (एसआई) हस्तक्षेप के साथ या तो nucleofection के माध्यम से जल्दी से और कुशलता से ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता. प्रवास का विश्लेषण करने के लिए, nucleofected कोशिकाओं &#39;फांसी बूँदें&#39; में reaggregated और बाद में एक तीन आयामी मैट्रिक्स में एम्बेडेड रहे हैं. Nucleofection प्रतिशत से काफी neuroblasts के प्रवास ख़राब नहीं करता है. Nucleofected और reaggregated neuroblasts के औषधीय उपचार भी Neuroblast प्रवास में शामिल रास्ते संकेतन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है.

Neuroblasts सफलतापूर्वक dissected आरएमएस ऊतक (चित्रा 1 ए) से अलग किया और एक तीन आयामी मैट्रिक्स में एम्बेडेड जा सकता है. चूहा या माउस प्रसव के बाद आरएमएस से या तो अलग कक्षों ऐसे doublecortin (DCX), βIII ट्यूबिलिन या पीएसए NCAM (आंकड़े 1 बी सी) के रूप में प्रवासी Neuroblast मार्करों, के लिए immunopositive हैं. अलग neuroblasts कुशलता से डीएनए के साथ nucleofected जा सकता है (उदाहरण के लिए. एक GFP एन्कोडिंग प्लाज्मिड, चित्रा 2) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, जो प्रोटीन कमी को प्राप्त करने या shRNA plasmids (चित्रा 4), चित्रा (4 बी) या immunofluorescence () नहीं दिखाया . GFP एन्कोडिंग plasmids के साथ nucleofected प्रकोष्ठों reaggregated Neuroblast समूहों (चित्रा 3) बाहर त्रिज्यात विस्थापित. (3B चित्रा) को एम्बेड रिश्तेदार माइग्रेट दूरी 24 घंटे बाद की मात्रा GFP-मंज़ूर बीच प्रवास में कोई अंतर से पता चलता है<html> nucleofection से प्रति प्रवास को बाधित नहीं करता है यह दर्शाता है कि कोशिकाओं और GFP नकारात्मक, nonnucleofected कोशिकाओं (चित्रा -3 सी) ive. सीधे आरएमएस explants (नहीं दिखाया डेटा) से बाहर पलायन nucleofected neuroblasts और neuroblasts के बीच माइग्रेशन की हद में कोई महत्वपूर्ण अंतर भी है. <img alt="चित्रा 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig1.jpg" width="500px" /> चित्रा 1. आरएमएस neuroblasts के विच्छेदन. आरएमएस Neuroblast विच्छेदन की (ए) योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. विस्तृत विवरण के लिए पाठ देखें. (बी) पृथक चूहा आरएमएस कोशिकाओं प्रवासी Neuroblast निर्माताओं DCX और βlll ट्यूबिलिन के लिए immunopositive हैं. माउस आरएमएस explants के बाहर पलायन बार, 20 माइक्रोन. (सी) कक्ष प्रवासी Neuroblast DCX और पीएसए NCAM मार्करों व्यक्त. बार, 20 माइक्रोन.0989/50989fig1highres.jpg &quot;लक्ष्य =&quot; _blank &quot;&gt; बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें. <img alt="चित्रा 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig2.jpg" width="500px" /> चित्रा 2. माउस Neuroblast nucleofection. Dissociated माउस आरएमएस neuroblasts, Pmax-GFP के साथ nucleofected reaggregated, एक तीन आयामी मैट्रिक्स में एम्बेडेड और 6 घंटे के लिए विस्थापित करने की अनुमति दी गई. एक reaggregated सेल क्लस्टर से बाहर पलायन neuroblasts (ऊपर, चरण विपरीत चित्रों) उच्च अभिकर्मक दक्षता (नीचे, GFP चैनल चित्र) दिखा. सही स्तंभ पैनल बाएँ स्तंभ पैनल में डाला insets को इसी उच्च बढ़ाई तस्वीरें दिखा. बार्स, 20 माइक्रोन. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig2highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें</a> . <img alt="चित्रा 3" fo:c<html> ontent चौड़ाई = &quot;6in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig3.jpg&quot; चौड़ाई = &quot;500px&quot; /&gt; चित्रा 3. 3 डी प्रवासन परख. (ए) चूहा neuroblasts Pmax-GFP (GFP) या pCAG-IRES-EGFP reaggregated 22 (ईवी), मैट्रिक्स में एम्बेडेड और 24 घंटे के लिए विस्थापित करने के लिए छोड़ दिया साथ nucleofected गया. कोशिकाओं तो तय और GFP (हरा) और βIII ट्यूबिलिन (लाल) के लिए immunostained गया. बार, 50 माइक्रोन. (बी) ImageJ का उपयोग प्रवास दूरी मापने. reaggregated सेल क्लस्टर 6 बराबर सेक्टरों में बांटा गया है. क्लस्टर (बिंदीदार रेखा) और दूर चले गए सेल के किनारे के बीच की दूरी प्रत्येक क्षेत्र के लिए मापा जाता है. सापेक्ष दूरी (सी) मात्रा nucleofected कोशिकाओं से माइग्रेट (GFP पॉजिटिव) और नियंत्रण, nonnucleofected कोशिकाओं (GFP नकारात्मक) . <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig3highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें</a> . <img alt="&lt;/ HTML">के लिए &quot;चित्रा 4&quot;: सामग्री चौड़ाई = src = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg&quot; चौड़ाई &quot;6in&quot; = &quot;500px&quot; /&gt; चित्रा 4. ShRNA nucleofection के बाद Neuroblast प्रवास निगरानी. (ए) चूहा neuroblasts (भी EGFP 23 व्यक्त करता है जो पीसीए-B-EGFPm5 रवशामक 3) एक नियंत्रण shRNA वेक्टर या एक shRNA fascin को लक्षित, एक actin-bundling प्रोटीन 24 से युक्त एक ही वेक्टर साथ nucleofected गया. सेल, 48 घंटा से अधिक reaggregated मैट्रिक्स में एम्बेडेड और 24 घंटे के लिए विस्थापित करने के लिए छोड़ दिया गया. समुच्चय फिर तय की और GFP (हरा) और βIII ट्यूबिलिन (लाल) के लिए immunostained गया. बार, 50 माइक्रोन. (बी) प्रभावी fascin कमी पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा shRNA nucleofection के बाद 50 घंटे से पता लगाया जा सकता है. Actin एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में यहाँ दिखाया गया है (सी) fascin कमी काफी Neuroblast प्रवास impairs दिखा रहा है कि रिश्तेदार प्रवास दूरी के मात्रात्मक विश्लेषण. (± SEM मतलब है, ** पी &lt;0.01, n = 3 स्वतंत्र प्रयोगों). <ahref = &quot;http://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig4highres.jpg&quot; लक्ष्य = &quot;_blank&quot;&gt; बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast प्रवास प्रसवोत्तर neurogenesis में एक महत्वपूर्ण कदम है. प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित डीएनए / छोटे बाल के लिये कांटा शाही सेना (shRNA) nucleofection और कृंतक प्रसव के बाद विजय - स्तम्भ प्रवासी धारा से अलग neuroblasts के साथ एक 3 डी प्रवास परख रोजगार से Neuroblast प्रवास के उम्मीदवार नियामकों की भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

कृंतक neuroblasts की nucleofection Neuroblast प्रवास का अध्ययन करने के लिए<em&gt; इन विट्रो</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection और भ्रूण माउस hippocampal और cortical न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृति

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

कृंतक मस्तिष्क स्लाइसें से न्यूरॉन्स की Vibrodissociation Synaptic पारेषण और छवि presynaptic टर्मिनल अध्ययन करने के लिए

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

भ्रूणीय ventral midbrain के Organotypic स्लाइस संस्कृति: एक डोपामिनर्जिक neuronal विकास अध्ययन प्रणाली इन विट्रो में</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

वयस्क माउस अग्रमस्तिष्क के तीव्र स्लाइस में समय चूक Neuroblast प्रवासन की इमेजिंग

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

कृंतक केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए ड्रग्स का प्रत्यक्ष intraventricular डिलिवरी

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

माउस तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में Neuroblast प्रवासन के विवो प्रसव के बाद electroporation में और समय चूक इमेजिंग

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स की आनुवंशिक हेरफेर<em&gt; इन विट्रो</em&gt; और<em&gt; में Vivo</em&gt; Neuronal आकृति विज्ञान और प्रवास का अध्ययन करने के लिए

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

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दौरान Neuroblast cytokinesis Visualizing<em&gt; सी. एलिगेंस</em&gt; Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

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माउस पश्चमस्तिष्क<em&gt; पूर्व vivo</em&gt; संस्कृति चेहरे Branchiomotor न्यूरॉन प्रवास का अध्ययन करने के लिए

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

के रहते इमेजिंग<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; लारवल neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...