Name: using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in drosophila larvae
Uploaded: 2014-02-07T14:00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע, (מספר מענק IOS-0,842,701 לCAC), והמכון הלאומי לבריאות (R00MH080599 לBY, R21 NS062313 לNC, וNS069844 לCAC). ברצוננו להודות ג&#39;יימס Schutt, אמילי האן, והלנים Truong לתמיכה טכנית, ומרכז מלאי Bloomington לקווים לטוס. כל השבבים היו מפוברק במתקן לוריא Nanofabrication באוניברסיטת מישיגן.

1. מה שהופך את שבב PDMS כדי להפוך את שבב PDMS מן העובש SU-8, בצע את שלבי 1.1-1.7. אם שבב הוא ביד, אבל צריך התאסף לשימוש, דלג לשלב 1.8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 45 גרם של בסיס PDMS ו4.5 גרם של סוכן ריפוי (10:01 יחס) מערכת PDMS במכל פלסטיק חד פעמי קטן ומערבבים אותם באמצעות מקל פלסטיק ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המכל במכל ואקום (למשל ייבוש) עבור 10 דקות כדי להסיר כל בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התבנית בSU-8 בתחתית 150 מ&quot;מ בצלחת פלסטיק בקוטר ויוצקים באיטיות את תערובת PDMS על העובש. יש להיזהר שלא ליצור בועות תוך לשפוך PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cure PDMS בתנור (או חממה) ב-C ° 650 במשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את עובש PDMS/SU-8 נרפא מהתנור ולתת לו להתקרר במשך כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין גילוח, לחתוך את PDMS נרפא לאורך הקצה של עובש SU-8 ולנתק אותו מSU-8 עובש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את לוח PDMSלתוך שבבי PDMS בודדים באמצעות סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט מחלק 21 G, לתקוע חור ביציאת הוואקום (מתואר באיור 1 א) של שבב PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את המחט מחלק 23 G ולסובב את קצה המחט מבסיסו כמה פעמים כדי לשבור את המחט להטות את מהרכזת המנעול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קצה מחט 23 G לתוך חתיכה קטנה של צינורות פוליאתילן, כך שהצינורות מכסה לפחות מילימטר של המחט. לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את צינורות העודפים מהמחט. זה יוצר טבעת פלסטיק סביב קצה אחד של המחט, אשר תיצור חותם כאשר מוכנס לתוך נמל צריכת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשימוש עם מיקרוסקופ הפוכה (איורים 1B ו 2A-B): הכנס את קצה מחט 23 G לתוך החור של נמל החלל הריק. לשימוש עם מיקרוסקופ זקוף (1C דמויות ו2C-D): לתקוע חור שני בצד של שבב PDMS עם dispe 21 Gnsing מחט; החור הזה יספק גישה לחור הראשון מהצד. לאחר מכן הכנס את קצה מחט 23 G עם טבעת צינור לתוך החור בצד. מניחים נייר דבק דו צדדי על גבי שבב PDMS לאטום את החור העליון (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח פיסת צינורות פוליאתילן שהוא כ 20 סנטימטר באורך. חבר צד אחד של הצינור לקצה המחט שמוחדר ליציאת הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר הצד השני של צינורות האחרים לאחת מהיציאות של שסתום 3 כיוונים (ראה ברזלים &#39;3-דרך &#39;ברשימה של חומרים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מזרק 20 מ&quot;ל לאחת משתי יציאות הנותרות. הנמל האחרון הוא פתוח לסביבה. </li></ol> 2. באמצעות שבב הזחל עבור הדמית חיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את שבב PDMS עם נייר דבק שקוף. צרף חתיכת הסרט לעומקו של שבב. ודא הקלטת נוגעת במשטח PDMS כולו, ולאחר מכן לקלף את הקלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב מעל 2-3x כדי לוודא שישאין חלקיקים או שמן (עודפים מניסויים קודמים) על פני השטח של שבב PDMS. מאז שבב PDMS הוא לשימוש חוזר, זה מאוד חשוב להסיר שאריות שמן כפי שהוא יכול להשפיע על ההידבקות של PDMS לזכוכית ולגרום לאיטום לקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר (ליקוט כלומר) מוקדם זחלי instar 3 rd לצלחת פטרי המכילה מים. (זחלי שלב הליקוט 3 rd instar נמצאים במזון, ולא בצד של בקבוקון התרבות). לרחוץ את הזחלים במים כדי להסיר את המדיום לתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח coverslip זכוכית נקי ומקום טיפה קטנה של Halocarbon 700 שמן במרכזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, בעדינות להרים נקי, מוקדם מבוים זחל instar 3 rd מהמים (הזחל צריך להיות ~ 3.5-4 מ&quot;מ אורך). מניחים את החיה בקצרה על מגבת לנגב או נייר קלה להסרת עודפי מים, ולאחר מכן למקם אותו בטיפת השמן. הירידה צריכה להיות קטנה מספיק כך שקנה ​​הנשימה של הזחלים אינן מצופים. בואו STA הזחלy בטיפת השמן ל10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הזחל מטיפת השמן ולאחר מכן הנח אותו על coverslip זכוכית נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הזחל למשנה coverslip זכוכית הנקי. צעד זה מסיר את עודפי שמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לנטיית זחל. הדמיה עצבי חוט ומגזרי העצביים, בצד הגחוני של זחל צריך לשבת על coverslip. צידו הגבי, המתאפיין בשני צינורות לקנה הנשימה אורך, צריך לפנות מעלה. הערה: זה הוא הנטייה הזחל מעדיף באופן טבעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות את שבב PDMS על גבי הזחל. הזחל צריך להיות מיושר לאמצע מרכז microchamber, עם הזנב שלה מכוון ליציאת הוואקום. היזהר שהזחל לא נוגע בקצוות של החדר. זה חשוב במיוחד למסופים הקדמי וקנו נשימה אחורית. הערה: צעד זה נעשה הכי טוב תחת סטראו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף את שבב PDMS נגד coverslip הזכוכית כדי להשיג חותם טוב. ודא שהזחל הוא לגמרימוקף microchamber כאשר שבב PDMS נוגע coverslip הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את שסתום 3 כיוונים על כך שהמזרק יכול לצייר אוויר מmicrochamber PDMS (באמצעות הצינור) כדי ליצור ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביד אחת, החזק את coverslip שבב PDMS / כוס בחוזקה. השתמש ביד השנייה כדי למשוך את בוכנת המזרק. לסגת 2-2.5 מיליליטר של אוויר, עד שההתנגדות מורגשת בידית המזרק, כדי ליצור ואקום. הוואקום מייצר חותם חזק בין שבב PDMS, שמן, וממשקי coverslip ומגביל את הניידות של הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את השסתום מכך ששבב PDMS הוא מבודד מהמזרק ומן הסביבה. כתוצאה מכך, רמת ואקום יציבה יחסית נשמר בmicrochamber ללא הצורך להחזיק את בוכנת המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הזחל תחת stereoscope לוודא כי הגוף של בעלי החיים כולו ממוקם בתוך microchamber, וכי בעל החיים הוא נייח. קנה הנשימה צריכה להיות גלויה. שארשבב PDMS צריך להיות במגע עם coverslip. הערה: ראה 2E דמויות ו2F לדוגמאות של בעלי חיים משותקים בצורה נכונה בשבב. כמה אוריינטציות שגויות מוצגות איורים 2G ו 2H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את שבב הזחל (שבב PDMS + coverslip זכוכית) על המיקרוסקופ. שבב הזחל, צינורות ואת המזרק צריך להיות מטופל בזהירות כדי להימנע מניתוק של שבב PDMS מן coverslip. למיקרוסקופ זקוף, לתקן את הצד &#39;העליון&#39; של השבב לבמה מיקרוסקופ עם קלטת דו צדדית (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מטרת ההגדלה גבוהה (נפט טבילה, 40-63X מומלץ) כדי לאתר המבנה של בעל החיים (ים) של עניין ולבצע את ההדמיה. במקרים מסוימים, ייתכן שתהיה הצורך בהגדלה נמוכה כדי לזהות את האזור הרצוי להדמיה לפני שעברתי להגדלה גבוהה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשהשלימה הדמיה, לשחרר את הוואקום על ידי מיתוג את השסתום לתפקידכי הוא פתוח לסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק שבב PDMS מן coverslip. הזחל צריך להיות מייד ניע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים כדי להסיר את הזחל מmicrochamber ומניח בעדינות את הזחל על צלחת אגר מיץ ענבים להתאוששות. </li></ol> 3. גרימת פציעה למחוץ עצב לעצבי הזחל מגזרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלב 2.3 לעיל כדי לבודד מוקדמים מבוים 3 זחלי instar rd של הגנוטיפ הרצוי. כמתואר בשלב 2.3 לרחוץ את הזחלים במים כדי להסיר את האוכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתחנת הרדמה סטנדרטית זבוב CO 2, עם CO 2 כרית נשמרת תחת סטראו לנתיחה, כדי להכניע את הזחלים. זחלים צריכים להיות immotile לאחר מיקום על CO 2 כרית ל1-2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת הנח את זחל הרדים יחיד על צלחת אגר מיץ ענבים תחת סטראו. הפעל את הצד הגחוני בעלי החיים עד כדי להמחיש את חוט עצב הגחון ומגזרי עצבים דרך ציפורן ( <strאונג&gt; איור 3). ודא שהזחל הוא immotile לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במספר-5 מלקחיים Dumostar, לצבוט את העצבים מגזרי בחוזקה באמצעות הציפורן ל5-10 שניות. כאשר זה נעשה בצורה נכונה, לציפורן נותרה בשלמותה ואת קיר הגוף אינו מנוקב. הערה: הפגיעה יכולה להתנהל בעמדות שונות לאורך ציר הגוף הקדמי, אחורי, כל עוד חוט עצב הגחון, בלוטות רוק, ומעיים אינן פגומות. מיקום הפגיעה היעיל ביותר הוא לקראת סוף קטע בטן 3 rd, כפי שמוצג באיור 3D. פגיעה בניזקי מיקום זה רוב העצבים, והוא הקל ביותר להתרבות בלי להרוג את בעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפציעה, להפוך את בעלי החיים כדי שהצד למטה על צלחת ענבי גחונה. זה צריך להיות מסוגל להזיז את ראשו ולאכול. אם הפגיעה הייתה מוצלחת, אז במחצית האחורית של הזחל תהיה משותקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על בעלי החיים נפגעו בצלחת אגר מיץ ענבים ב25 &amp;# 176; C לזמן הרצוי בהתאם למטרת הניסוי. לmotoneurons, את הגדם הפרוקסימלי מתחיל לנבוט בתוך 8-10 שעות של פציעה 14, וגדם דיסטלי מתחיל להתנוון בתוך 6-8 שעות 15. לעצב סנסורי דה IV כיתה, את הגדם הפרוקסימלי מתחיל לנבוט בתוך 4-6 שעות, ואת התחלת הגדם הדיסטלי להידרדר בתוך 3-4 שעות לאחר פציעה. הערה: עם נהגי Gal4 מתאימים וכתבי ניאון, צמיחה והניוון ניתן לצפות בשבב הזחל (לדוגמא, ראו איור 6). </li></ol>

<ol>
	<li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons.">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li><li>Gunawardena, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila.">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li><li>Miller, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+demonstrates+that+Liprin-alpha+is+required+for+trafficking+of+synaptic+vesicles.">Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles.</a> Curr. Biol. 15, 684-689 (2005).</li><li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+a+synapse+grow:+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila.">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li><li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses.">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li><li>Schmid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+site-specific+changes+of+glutamate+receptor+composition+in+vivo.">Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo.</a> Nat. Neurosci. 11, 659-666 (2008).</li><li>Fuentes-Medel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+and+muscle+sculpt+neuromuscular+arbors+by+engulfing+destabilized+synaptic+boutons+and+shed+presynaptic+debris.">Glia and muscle sculpt neuromuscular arbors by engulfing destabilized synaptic boutons and shed presynaptic debris.</a> PLoS Biol. 7, (2009).</li><li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. , 476-480 (2012).</li><li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+reduces+excitability+of+Drosophila+larval+motoneurons+by+activating+a+hyperpolarizing+leak+conductance.">Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance.</a> Anesthesiology. 108, 434-446 (2008).</li><li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+depresses+glutamate+release+by+reducing+neuronal+excitability+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction.</a> J. Physiol. 558, 489-502 (2004).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo+neuronal+transport+in+genetic+model+organisms+using+microfluidic+devices.">Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices.</a> Traffic. 12, 372-385 (2011).</li><li>Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+in+vivo+imaging+of+cellular+responses+to+neural+injury+in+Drosophila+larvae.">Microfluidic chips for in vivo imaging of cellular responses to neural injury in Drosophila larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>Schmid, A., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neuromuscular+junctions:+histology+and+in+vivo+imaging.">Analysis of neuromuscular junctions: histology and in vivo imaging.</a> Methods Mol. Biol. 420, 239-251 (2008).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).</li><li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda/DLK+MAP+kinase+signaling+cascade.">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J. Neurosci. 32, 610-615 (2012).</li><li>Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Laser+Axotomy+in+C.+elegans.">In vivo Laser Axotomy in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li><li>Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+a+Low-budget+Laser+Axotomy+System+to+Study+Axon+Regeneration+in+C.+elegans.">Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (57), (2011).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2.</a> 2, 2024-2032 (2007).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).</li><li>Rao, S., Lang, C., Levitan, E. S., Deitcher, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+neuropeptide+expression,+transport,+and+exocytosis+in+Drosophila+melanogaster.">Visualization of neuropeptide expression, transport, and exocytosis in Drosophila melanogaster.</a> J. Neurobiol. 49, 159-172 (2001).</li><li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-skipped,+acting+as+a+repressor,+regulates+axonal+projections+in+Drosophila.">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130, 5385-5400 (2003).</li><li>Rietdorf, J., Steitz, A., Heidelberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+unmixing+macro+for+ImageJ.">Linear unmixing macro for ImageJ.</a> European Advanced Light Microscopy Network. , (2004).</li><li>Koon, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulatory+and+paracrine+control+of+synaptic+and+behavioral+plasticity+by+octopaminergic+signaling.">Autoregulatory and paracrine control of synaptic and behavioral plasticity by octopaminergic signaling.</a> Nat. Neurosci. 14, 190-199 (2011).</li><li>Yarali, A., Gerber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neurogenetic+Dissociation+between+Punishment-,+Reward-,+and+Relief-Learning+in+Drosophila.">A Neurogenetic Dissociation between Punishment-, Reward-, and Relief-Learning in Drosophila.</a> Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).</li><li>Kuo, C. T., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrite-specific+remodeling+of+Drosophila+sensory+neurons+requires+matrix+metalloproteases,+ubiquitin-proteasome,+and+ecdysone+signaling.">Dendrite-specific remodeling of Drosophila sensory neurons requires matrix metalloproteases, ubiquitin-proteasome, and ecdysone signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15230-15235 (2005).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Microfluidic+Devices+for+in+vivo+Imaging+of+C.+elegans,+Drosophila.">Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+highwire+ubiquitin+ligase+promotes+axonal+degeneration+by+tuning+levels+of+nmnat+protein.">The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein.</a> PLoS Biol. 10, (2012).</li><li>Shin, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration.">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74, 1015-1022 (2012).</li><li>Watkins, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLK+initiates+a+transcriptional+program+that+couples+apoptotic+and+regenerative+responses+to+axonal+injury.">DLK initiates a transcriptional program that couples apoptotic and regenerative responses to axonal injury.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 4039-4044 (2013).</li><li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway.">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li><li>Guo, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies.">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), (2009).</li><li>Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+up-regulation+of+microtubule+dynamics+and+polarity+reversal+during+regeneration+of+an+axon+from+a+dendrite.">Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 767-777 (2010).</li><li>Miller, D. L., Ballard, S. L., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic+growth+and+function+in+Drosophila+with+an+extended+larval+stage.">Analysis of synaptic growth and function in Drosophila with an extended larval stage.</a> J. Neurosci. 32, 13776-13786 (2012).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, נוצל כאורגניזם מודל במשך 100 שנים, והוכיח סייע בהגדרת איתות בסיסית ומסלולים התפתחותיים הנשמרים מחסרי חוליות לאדם. ההדמיה חיה היא גישה חשובה ללימוד מנגנונים תאיים, ותכנית הגוף הפשוטה וציפורן שקופה של זחל דרוזופילה הופכת אותו למערכת אטרקטיבית להדמית חיה, במיוחד שכן יש כלים גנטיים רבים זמינים לביטוי חלבונים מתויגים fluorescently בסוגי תאים ספציפיים. אתגר חשוב עבור טכניקות הדמיה חיה הוא לשתק noninvasively ולמקם את בעלי חיים למיקרוסקופ. גישות קיבוע קונבנציונליות כוללות נתיחה 1,2 או שימוש בכלורופורם, אשר שניהם להרוג את בעלי החיים. ההרדמה אתר 4 וisofluorane 5-8 היו בשימוש גם. בעוד הרדמה מספקת יתרונות רבים, הם גם מעכבים את הפעילות עצבית ופיזיולוגיה חשובה (כולל פעימות הלב) 9-11, ולכן יכול להשפיע על התהליך למד וליצור לחץ על בעלי החיים. ישנם גם חששות בטיחות אדם לעבודה עם אתר וisofluorane. אנחנו פיתחנו שיטה ללא שימוש בסמים כדי לשתק זחלי דרוזופילה במכשיר אחד PDMS microfluidic השכבה, שאנו מכנים &#39;שבב הזחל&#39; 12. פרוטוקול זה יתאר כיצד להשיג או לעשות שבב הזחל, ואיך לנצל אותו להדמיה לחיות בתחילת מבוימת זחלי instar 3 rd. השבב מורכב מmicrochamber דוקים, אשר, על פי בקשה של ואקום באמצעות מזרק, שמגביל את בעל החיים באמצעות כוח מכאני עדין. שיטת הקיבוע מביאה מבני הגחון כגון חוט העצב, עצבים מגזרי, וקיר שרירי גוף, בתוך בסמיכות לcoverslip זכוכית. זה מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של מבנים כאלה עם aper המספרי גבוהture יעדים (ההגדלה גבוהה). יתרונות של שבב הזחל על פני שיטות קונבנציונליות אחרות כוללים את הפעולות הבאות: (i) שימוש בשבב הזחל מחליף את השימוש בכימיקלים, המאפשר הדמיה vivo של חיות unanesthetized. (Ii) זחלים להתאושש מייד לאחר שחרורו מהשבב (בניגוד לתקופת החלמה 2 שעות עבור 8,13 isofluorane). זה מאפשר הדמיה על סולמות זמן רחבים, החל מאלפיות שניים לדקות, שעות וימים. (Iii) השימוש של PDMS, שהוא חומר חדיר גז, מאפשר לדיפוזיה מתמדת של חמצן / אוויר מהסביבה אל תוך גוף הזחל. (Iv) השבב הוא קל ובטוח לשימוש, ו( v) זה לשימוש חוזר, ויכול להיות מיוצר בעלות מינימאלית. בנוסף להוראות לשימוש בשבב הזחל, פרוטוקול זה יספק כמה דוגמאות של השימוש בו כדי ללמוד אירועים עצביים ב3 זחלי instar rd. אלה כוללים הדמיה חיה של axonaתחבורת ליטר, תגובות סידן לפציעה, ומחקרי הזמן לשגות של הסחר של חלבוני תמונה להמרה על פני מרחקים ארוכים וסולמות זמן. יישום נוסף של השבב הוא ללמוד את תגובות עצביות לפגיעה באקסון. לשם כך הליך נוסף מתואר (בחלק 3) לפציעתם אקסונים בתוך עצבים היקפיים על ידי למחוץ עצב מגזרי. assay הפשוט זה יכול להתבצע גם במהירות וreproducibly תחת סטראו לנתיחה סטנדרטי, המאפשר לבעלי חיים רבים להיות מעובד באותו הזמן. תגובות תאיות לפציעה ניתן ללמוד על ידי הדמיה לחיות בשבב הזחל.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1170">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:259px;">0.5 mm Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">14-170-11B</td>
			<td style="width:449px;">Polyethylene tubing, I.D. = 0.023&#8217;&#8217;, O.D. = 0.038&#8217;&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1 mm Polyurethane tubing</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">BB521-63</td>
			<td style="width:449px;">Polyurethane tubing, I.D. = 0.063&#8217;&#8217;,&#160; O.D. = 0.125&#8217;&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">barb to barb connector</td>
			<td style="width:171px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:291px;">732-8300</td>
			<td style="width:449px;">0.8 mm barb to barb connector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">3-way stopcock valve</td>
			<td style="width:171px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:291px;">732-8104</td>
			<td style="width:449px;">Screw on valve for the syringe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Syringe (20 ml)</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">14-817-33</td>
			<td style="width:449px;">Screw on 20 ml syringe for&#160; generating vacuum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">Dispensing needles, 23 G (.4mm I.D., .6mm O.D.)</td>
			<td style="width:171px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:291px;">75165A684</td>
			<td style="width:449px;">Needle for outlet connection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">Dispensing needles, 21 G, (.6mm I.D.,&#160; .8mm O.D.)</td>
			<td style="width:171px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:291px;"><a href="http://www.mcmaster.com/#75165A679" title="Close">75165A679</a></td>
			<td style="width:449px;">Needle for outlet connection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Halocarbon oil</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:291px;">H8898</td>
			<td style="width:449px;">Halocarbon oil 700</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dumostar Number 5 Forceps</td>
			<td style="width:171px;">Roboz</td>
			<td style="width:291px;">RS-498</td>
			<td style="width:449px;">For nerve crush</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">PDMS Kit (Base and curing agent)</td>
			<td style="width:171px;">Ellsworth</td>
			<td style="width:291px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td style="width:449px;">Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Glass Coverslips</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">12-544-C</td>
			<td style="width:449px;">24 x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Disposable Plastic Cup (9 oz.)</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Plastic coffee stirrer stick</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Grape juice agar plates</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"><a href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925">See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in drosophila larvae

הדמיה חיה היא טכניקה חשובה לחקר תהליכים ביולוגיים של תא, אולם זה יכול להיות מאתגר בבעלי חיים. הציפורן השקופה של זחל דרוזופילה עושה את זה אורגניזם מודל אטרקטיבי למחקרי הדמיה לחיות. עם זאת, אתגר חשוב עבור טכניקות הדמיה חיה הוא לשתק noninvasively ולמקם את בעלי חיים במיקרוסקופ. פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה וקלה לשימוש עבור לשתק והדמית זחלי דרוזופילה על polydimethylsiloxane (PDMS) מכשיר microfluidic, שאנו מכנים &#39;שבב הזחל&#39;. שבב הזחל מורכב מmicrochamber PDMS דוקים שמצורף לcoverslip זכוכית דק, אשר, על פי בקשה של ואקום באמצעות מזרק, שמגביל את בעל החיים ומביא מבני הגחון כגון חוט העצב, עצבים מגזרי, וגוף קיר שרירים, בתוך בסמיכות לcoverslip. זה מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה, וחשוב מכך, ימנע את השימוש של anesthetics וכימיקלים, המאפשר הלימוד של מגוון רחב של תהליכים פיסיולוגיים. מאז זחלים להתאושש בקלות מהקיבוע, הם יכולים להיות חשופים בקלות לפגישות הדמיה מרובות. זה מאפשר למחקרים ארוכי טווח על קורסי זמן שנעו בין שעות עד ימים. פרוטוקול זה מתאר צעד אחר הצעד כיצד להכין את השבב וכיצד לנצל את השבבים עבור הדמיה חיה של אירועים עצביים ב3 זחלי instar rd. אירועים אלה כוללים את ההובלה המהירה של האברונים באקסונים, תגובות סידן לפציעה, ומחקרי הזמן לשגות של הסחר של חלבוני תמונה להמרה על פני מרחקים ארוכים וסולמות זמן. יישום נוסף של השבב הוא ללמוד משובי ותגובות ניווניות לפגיעה באקסון, ולכן החלק השני של פרוטוקול זה מתאר נוהל חדש ופשוט לפציעתם של האקסונים בעצבים היקפיים על ידי למחוץ עצב מגזרי.

Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae at JoVE.com

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

זחלי דרוזופילה הם מערכת מודל אטרקטיבית עבור הדמיה חיה בשל הציפורן השקופה שלהם וגנטיקה חזקה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לנצל את מכשיר PDMS שכבה אחת, שנקרא &#39;שבב הזחל&#39; עבור הדמיה חיה של תהליכים תאיים בתוך הנוירונים של 3 זחלי דרוזופילה instar rd.

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue EHT

פליטת אור הדמיה עבור הערכת התגובה החיסונית לאחר השתלת רקמת לב הנדסי (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or ...

Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

Pressurization אימפולסיבית של תאים עצביים לחקר פגיעה מוחית טראומטי

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate blast-induced traumatic brain injury (TBI). ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

התקני microfluidic פשוטים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt;,<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ודג זברה

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

מיקרופלואידיקה Endothelialized לחקר אינטראקציות כלי הדם במחלות המטולוגיות

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

הדפסה השקועה של תאים על גבי משטח שונה באמצעות זרימת Microspotter רציפה

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis מחקרים של תאי סרטן ריאות באמצעות רב-ערוצי דו-חשמלי-שדה שבב microfluidic

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

ססגוניות קרינת איתור עבור מיקרופלואידיקה אגל באמצעות סיבים אופטיים

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Training Persons with Spinal Cord Injury to Ambulate Using a Powered Exoskeleton

הכשרת אנשים עם פגיעה בחוט השדרה כדי ambulate שימוש שלד חיצוני פועל

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

להמיס Electrospinning הכתיבה של פיגומים Poly(ε-caprolactone) תלת מימדי עם מורפולוגיות לשליטה עבור יישומי הנדסת רקמות

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...