Name: using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in drosophila larvae
Uploaded: 2014-02-07T14:00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation, (stipend nummer IOS-0842701 til CAC), og National Institute of Health (R00MH080599 til BY, R21 NS062313 til NC, og NS069844 til CAC). Vi ønsker å takke James Schutt, Emily Han, og Leni Truong for teknisk support, og Bloomington Stock senter for flueliner. Alle brikkene ble fabrikkert på Lurie Nanofabrication Facility ved University of Michigan.

En. Making the PDMS Chip For å gjøre en PDMS chip fra SU-8 mold, følg punkt 1.1 til 1.7. Hvis en brikke er på hånd, men må monteres for bruk, går du til trinn 1.8. <ol><li> Bland 45 g av PDMS base og 4,5 g herder (10:01 ratio) fra en PDMS kit i en liten engangs plastbeholder og bland dem godt med en plast røre pinne. </li><li> Plasser beholderen i en vakuumbeholder (for eksempel en eksikkator) i 10 minutter for å fjerne bobler. </li><li> Plasser SU-8 form på bunnen av en 150 mm i diameter plast fatet og langsomt helles PDMS blandingen i formen. Pass på ikke å generere bobler mens helle PDMS. </li><li> Kurere PDMS i en ovn (eller inkubator) ved 650 ° C i 4 timer. </li><li> Fjern kurert PDMS/SU-8 mold fra ovnen og la den avkjøles i noen minutter. </li><li> Ved hjelp av et barberblad, kutte kurert PDMS langs kanten av SU-8 mugg og løsne den fra SU-8 mold. </li><li> Fordel PDMS skivei individuelle PDMS chips med et barberblad. </li><li> Ved å bruke en 21 G nål dispensering, stikke et hull i vakuumport (vist i figur 1A) av PDMS-brikken. </li><li> Ta en 23 G utlevering nål og vri nålespissen fra sin base et par ganger for å bryte nålespissen av fra hub lås. </li><li> Sett 23 G nålespissen inn et lite stykke polyetylenrør, slik at slangen omfatter i det minste en millimeter av nålen. Deretter kan du bruke et barberblad for å kutte overskytende slange vekk fra nålen. Dette skaper en plastisk ring rundt en ende av nålen, noe som vil skape en tetning når de settes inn i vakuum inntaksporten. </li><li> For bruk med en invertert mikroskop (Tall 1B og 2A-B): Sett inn 23 G nålespissen inn i hullet på vakuumporten. For bruk sammen med en opprettstående mikroskop (figurene 1C og 2C-D): rote en andre åpning på siden av PDMS-brikken med en 21 G dispernsing nål; vil dette hullet gi tilgang til det første hullet fra siden. Deretter setter du inn 23 G nålespissen med slange ring inn side hullet. Legg et stykke dobbeltsidig tape over toppen av PDMS-brikken for å forsegle topphullet (figur 1C). </li><li> Ta et stykke polyetylenrør som er omtrent 20 cm i lengde. Koble den ene siden av røret til nålen spissen som er satt inn i vakuumporten. </li><li> Sett den andre siden av slangen til en av portene i en 3-veis ventil (se &#39;3-veis stoppekran &#39;i listen over materialer) </li><li> Fest en 20 ml sprøyte inn i en av to gjenværende porter. Den siste port er åpen til omgivelsene. </li></ol> 2. Bruke Larva Chip for Live Imaging <ol><li> Rengjør PDMS chip med gjennomsiktig tape. Fest et stykke av båndet på undersiden av brikken. Pass på at tapen berører hele PDMS overflaten, og deretter løsner båndet. </li><li> Gjenta ovenstående trinn 2-3x å sørge for at detikke er noen partikler eller olje (beholdt fra tidligere forsøk) på overflaten av PDMS-brikken. Siden PDMS chip er gjenbrukbare, er det svært viktig å fjerne oljerester som det kan påvirke vedheft av PDMS til glass og resultere i mangelfull tetting. </li><li> Overfør tidlig (dvs. beite) 3 rd stadiums larver til en petriskål som inneholder vann. (Den slåing 3. instar larver er i mat, i stedet for på siden av hetteglasset kultur). Bade larvene i vann for å fjerne kulturmediet. </li><li> Ta et rent glass dekkglass og plassere en liten dråpe Halocarbon 700 olje i midten. </li><li> Bruk pinsett, forsiktig plukke opp en ren, tidlig-iscenesatt 3. instar larve fra vannet (larven bør være ~ 3.5-4 mm i lengde). Plasser dyret kort på en lett tørke eller papir håndkle for å fjerne overflødig vann, og deretter plassere den på oljefallet. Dråpen bør være liten nok slik at luftrøret av larvene ikke er belagt. La larven stay på oljedråpen i 10 sek. </li><li> Fjern larven fra oljefallet og deretter plassere den på et rent glass dekkglass. </li><li> Overfør larven til en annen rent glass dekkglass. Dette trinnet fjerner overflødig olje. </li><li> Vær oppmerksom på larve orientering. For bildebehandling nevrale ledningen og segmentell nerver, bør den ventrale siden av larve sitte på dekkglass. Dens ryggsiden, preget av to langsgående trakealtubers, skal vende oppover. Merk: Dette er orienteringen larven foretrekker naturlig. </li><li> Påfør PDMS chip på toppen av larven. Larven bør være på linje til sentrum midt på mikrokammeret, med halen orientert mot vakuum port. Vær forsiktig slik at larven ikke berører kantene på kammeret. Dette er spesielt viktig for de fremre og bakre tracheal terminaler. Merk: Dette trinnet gjøres best under et stereomikroskop. </li><li> Skyv PDMS chip mot glass dekkglass for å oppnå en god tetning. Sørg for at larven er heltomsluttet av mikrokammeret når PDMS chip berører glass dekkglass. </li><li> Slå av 3-veisventilen, slik at sprøyten kan trekke luft fra PDMS mikrokammeret (gjennom produksjonsrøret) for å skape et vakuum. </li><li> Med den ene hånden, holder PDMS chip / glass dekkglass fast. Bruk den andre hånden til å trekke sprøytestempelet. Trekk 2-2,5 ml luft, til du kjenner motstand i håndtaket sprøyte, for å skape vakuum. Vakuumet produserer en tett forsegling mellom PDMS chip, olje, og dekk grensesnitt og begrenser mobiliteten av larven. </li><li> Slå ventilen slik at PDMS-brikken er isolert fra sprøyten og fra omgivelsene. Som et resultat, blir et relativt stabilt vakuumnivå opprettholdes i mikrokammeret uten behov for å holde sprøytestemplet. </li><li> Sjekk larven under stereoscope å sørge for at hele dyrekroppen er plassert inne i mikrokammeret, og at dyret er immobile. Luftrøret skal være synlig. Resten avPDMS chip skal være i kontakt med dekkglass. Merk: Se figur 2E og 2F for eksempler på dyr riktig immobilisert i brikken. Noen ukorrekte orientering er vist i figurene 2G og 2H. </li><li> Plasser larve chip (PDMS chip + glass dekkglass) på mikroskopet. Larven chip, slangen og sprøyten skal håndteres forsiktig for å unngå avløsning av PDMS chip fra dekkglass. For en oppreist mikroskop, fikse &quot;topp&quot; side av brikken til mikroskopet scenen med dobbeltsidig tape (figur 1C). </li><li> Bruk en høy forstørrelse objektiv (olje-nedsenking, 40-63X er anbefalt) å finne dyrets struktur (r) av interesse og utfører bildebehandling. I noen tilfeller kan et lavere forstørrelse være nødvendig for å identifisere det ønskede område for avbildning før den settes i høyere forstørrelse. </li><li> Ved avbildning er fullført, slipper vakuum ved å slå ventilen til stillingensom er åpen til omgivelsene. </li><li> Løsne PDMS chip fra dekkglass. Larven bør være umiddelbart motile. </li><li> Bruk pinsett til å fjerne larven fra mikrokammeret og påfør larve på en drue-juice agar plate for gjenoppretting. </li></ol> Tre. Indusere en Nerve Crush Skade Larve Segments Nerver <ol><li> Følg trinn 2.3 over for å isolere tidlig trinnvis 3. instar larver av den ønskede genotype. Som beskrevet i trinn 2.3 bade larvene i vann for å fjerne mat. </li><li> Bruk en standard fly CO 2 anesthetization stasjon, med CO 2 pad holdt under en disseksjon stereo, å undertrykke larvene. Larver bør bli immotile etter plassering på CO 2 pad for 1-2 min. </li><li> Nå plasserer en enkelt bedøvet larve på en drue juice agar plate under stereomikroskopet. Slå dyret ventral siden opp for å visualisere ventral nerve ledningen og segment nerver gjennom skjellaget ( <strong&gt; Figur 3). Sørg for at larven er helt immotile. </li><li> Bruke Dumostar nummer fem tang, klemme segmental nervene tett gjennom skjellaget i 5-10 sek. Når dette er gjort riktig, er fortsatt skjellaget intakt og kroppsveggen er ikke gjennomboret. Bemerk: Skaden kan bli utført ved forskjellige posisjoner langs de fremre-bakre kropps aksen, så lenge den ventrale nerveledning, spyttkjertler, og tarmene ikke skades. Den mest effektive skade plasseringen er mot slutten av 3. abdominal segment, som vist i Figur 3D. Skade på dette stedet skader flest nerver og er den enkleste å reprodusere uten å drepe dyret. </li><li> Etter skaden, slår dyret slik at ventral side ned på druen plate. Det bør være i stand til å bevege hodet og spise. Hvis skaden var vellykket, da den bakre halvdel av larven blir lammet. </li><li> Hold skadde dyr på druesaft agar plate på 25 &amp;176, C til den ønskede tid i henhold til den eksperimentelle målet. For motoneurons begynner proksimale stubben å spire innen 8-10 timers skade 14, og den distale stubben begynner å utarte innen 6-8 hr 15. For klasse IV da sensoriske nerveceller, begynner den proksimale stubben å spire i løpet av 4-6 timer, og den distale stubben start å utarte innen 3-4 timer etter skade. Merk: med passende Gal4 drivere og fluorescerende reportere, kan den spirende og degenerasjon observeres i larven chip (for eksempel, se figur 6). </li></ol>

<ol>
	<li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons.">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li><li>Gunawardena, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila.">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li><li>Miller, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+demonstrates+that+Liprin-alpha+is+required+for+trafficking+of+synaptic+vesicles.">Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles.</a> Curr. Biol. 15, 684-689 (2005).</li><li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+a+synapse+grow:+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila.">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li><li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses.">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li><li>Schmid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+site-specific+changes+of+glutamate+receptor+composition+in+vivo.">Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo.</a> Nat. Neurosci. 11, 659-666 (2008).</li><li>Fuentes-Medel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+and+muscle+sculpt+neuromuscular+arbors+by+engulfing+destabilized+synaptic+boutons+and+shed+presynaptic+debris.">Glia and muscle sculpt neuromuscular arbors by engulfing destabilized synaptic boutons and shed presynaptic debris.</a> PLoS Biol. 7, (2009).</li><li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. , 476-480 (2012).</li><li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+reduces+excitability+of+Drosophila+larval+motoneurons+by+activating+a+hyperpolarizing+leak+conductance.">Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance.</a> Anesthesiology. 108, 434-446 (2008).</li><li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+depresses+glutamate+release+by+reducing+neuronal+excitability+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction.</a> J. Physiol. 558, 489-502 (2004).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo+neuronal+transport+in+genetic+model+organisms+using+microfluidic+devices.">Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices.</a> Traffic. 12, 372-385 (2011).</li><li>Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+in+vivo+imaging+of+cellular+responses+to+neural+injury+in+Drosophila+larvae.">Microfluidic chips for in vivo imaging of cellular responses to neural injury in Drosophila larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>Schmid, A., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neuromuscular+junctions:+histology+and+in+vivo+imaging.">Analysis of neuromuscular junctions: histology and in vivo imaging.</a> Methods Mol. Biol. 420, 239-251 (2008).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).</li><li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda/DLK+MAP+kinase+signaling+cascade.">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J. Neurosci. 32, 610-615 (2012).</li><li>Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Laser+Axotomy+in+C.+elegans.">In vivo Laser Axotomy in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li><li>Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+a+Low-budget+Laser+Axotomy+System+to+Study+Axon+Regeneration+in+C.+elegans.">Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (57), (2011).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2.</a> 2, 2024-2032 (2007).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).</li><li>Rao, S., Lang, C., Levitan, E. S., Deitcher, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+neuropeptide+expression,+transport,+and+exocytosis+in+Drosophila+melanogaster.">Visualization of neuropeptide expression, transport, and exocytosis in Drosophila melanogaster.</a> J. Neurobiol. 49, 159-172 (2001).</li><li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-skipped,+acting+as+a+repressor,+regulates+axonal+projections+in+Drosophila.">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130, 5385-5400 (2003).</li><li>Rietdorf, J., Steitz, A., Heidelberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+unmixing+macro+for+ImageJ.">Linear unmixing macro for ImageJ.</a> European Advanced Light Microscopy Network. , (2004).</li><li>Koon, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulatory+and+paracrine+control+of+synaptic+and+behavioral+plasticity+by+octopaminergic+signaling.">Autoregulatory and paracrine control of synaptic and behavioral plasticity by octopaminergic signaling.</a> Nat. Neurosci. 14, 190-199 (2011).</li><li>Yarali, A., Gerber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neurogenetic+Dissociation+between+Punishment-,+Reward-,+and+Relief-Learning+in+Drosophila.">A Neurogenetic Dissociation between Punishment-, Reward-, and Relief-Learning in Drosophila.</a> Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).</li><li>Kuo, C. T., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrite-specific+remodeling+of+Drosophila+sensory+neurons+requires+matrix+metalloproteases,+ubiquitin-proteasome,+and+ecdysone+signaling.">Dendrite-specific remodeling of Drosophila sensory neurons requires matrix metalloproteases, ubiquitin-proteasome, and ecdysone signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15230-15235 (2005).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Microfluidic+Devices+for+in+vivo+Imaging+of+C.+elegans,+Drosophila.">Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+highwire+ubiquitin+ligase+promotes+axonal+degeneration+by+tuning+levels+of+nmnat+protein.">The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein.</a> PLoS Biol. 10, (2012).</li><li>Shin, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration.">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74, 1015-1022 (2012).</li><li>Watkins, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLK+initiates+a+transcriptional+program+that+couples+apoptotic+and+regenerative+responses+to+axonal+injury.">DLK initiates a transcriptional program that couples apoptotic and regenerative responses to axonal injury.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 4039-4044 (2013).</li><li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway.">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li><li>Guo, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies.">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), (2009).</li><li>Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+up-regulation+of+microtubule+dynamics+and+polarity+reversal+during+regeneration+of+an+axon+from+a+dendrite.">Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 767-777 (2010).</li><li>Miller, D. L., Ballard, S. L., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic+growth+and+function+in+Drosophila+with+an+extended+larval+stage.">Analysis of synaptic growth and function in Drosophila with an extended larval stage.</a> J. Neurosci. 32, 13776-13786 (2012).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Å gjøre eller skaffe larven chip: Larvene brikken består av en PDMS-blokken (kalt &quot;PDMS chip&quot;) festet til en glass dekkglass. Protokollen i trinn 1 beskriver fremgangsmåten for å lage og bruke larva chips, forutsatt en SU-8 mold er tilgjengelig. SU-8 mold er microfabricated av photolithographically mønster en 140 mikrometer tykt SU-8 fotoresistsjiktet på en silisiumskive (for detaljer se Ghannad-Rezaie et al. 12). Som microfabrication av SU-8 mold krever tilgang til spesialisert utstyr, anbefaler vi å bestille den fra en microfabrication anlegget (f.eks. LNF-anlegget ved University of Michigan 14), eller fra et støperi ved å sende dem chip design som er gitt som en tilleggsfilen. Dersom man ønsker å endre utformingen av PDMS-brikke (for eksempel for bruk med larver av forskjellige størrelser), et CAD-programvare som håndterer DXF filer (f.eks Autocad) kan brukes. En SU-8 mugg kan også gjøres i huset å følge instruksjonene i Mondal et al. 27 Mange lesere kan finne det praktisk å bare få en prøve PDMS chip for å prøve ut den teknikken før fabrikere sine egne brikker. Dette vil bli gjort fritt tilgjengelig på forespørsel. Bruk av microfluidic &#39;larve chip &quot;for direkte avbildning: Den immobiliserende metode i larven chip unngår bruk av bedøvelsesmidler, og i stedet innebærer trykk, via anvendelse av et vakuum, for å begrense dyrets bevegelser. Mens dyr kan overleve immobilisering i brikken for flere timer 12, en kortere immobilisering periode (5-15 min) er anbefalt. Dette er nok tid for imaging mange cellulære hendelser av interesse, inkludert endringer i intracellulært kalsium, eller rask aksonal transport. Dette er også tilstrekkelig tid til ønskede manipulasjoner i levende dyr, for eksempel laser baserte mikrokirurgi, fotobleking, og photoconverSion. For å studere arrangement i lengderetningen over lengre tidsrom i et enkelt dyr, kan dyrene bli plassert inn i brikken og avbildes flere ganger, separert ved hvileperioder. Drue juice agar plater er ideelle for hvile mellom bilde økter, som de gir en enkel matkilde og fuktighet. Flere bildebehandlings økter gjør påvirker larve overlevelse til en grad, ettersom hver økt bærer noen risiko for å skade dyret (se del 2 i feilsøking, nedenfor). Dyr kan rutinemessig avbildes&gt; 5 ganger i løpet av to dager med en større enn 50% overlevelsesrate. Siden dyrene ikke bedøves, de friske og motile umiddelbart etter frigjøring av vakuumet i brikken. Det er derfor ikke behov for utvinning tid mellom avbildnings sesjoner, slik at tidsavstanden mellom sesjoner er fleksibel og kan bli justert til målene for forsøket. Feilsøking: Den vanligste teknisk ersaksøker med larve chip og anbefalte løsninger er følgende: (1) Dyret beveger seg for mye. For mye mobilitet kan interferere med de bildedannende mål. De vanligste årsakene til dette i larven chip er a) dyret er for liten for chip, eller b) vakuumtrykket brukes under immobilisering trinnet er kompromittert. Larven chip beskrevet i denne protokollen er designet for tidlig iscenesatt 3 rd stadiums larver. Den optimale størrelse for dyret er 3,5-4 mm i lengde (langs anteroposteriøre akse). For å sikre at vakuumtrykket er tilstrekkelig, Trekk sprøyten 2-2,5 ml, eller til du kjenner motstand i håndtaket. En indikasjon på at vakuumet virker, er at små bobler i den ytre kanal kan ses å bevege seg langsomt mot vakuumkilden. En annen indikasjon på at dekk bør alltid ha med brikken når brikken er løftet fra toppen (og dette er den anbefalte metode for transport av kammeretnår larvene er posisjonert og vakuumet er på). Vakuumet kan bli svekket hvis det er sprekker i slangen, eller om det er olje i slangen. Dette kan enkelt løses ved å erstatte 23 G dispense nålespissen og polyetylen-50 rør (fra trinn 01.06 til 01.14). (2) Dyret dør etter bildebehandling i brikken. Fremgangsmåten er beregnet til å forårsake minimal belastning på dyret, og dyr av villtype genotype har en&gt; 90% overlevelse, selv etter en time for immobilisering på brikken 12.. Siden enkelte genotyper kan være mindre motstandsdyktige mot stress av chip, først sjekke at vill type dyr (for eksempel, Canton S) overleve immobilisering teknikk. a) Den vanligste årsaken til dødelighet er korrekt posisjonering av larven (se figurene 2G-H). Dersom deler av hårstråene, hodet og luftrøret er ikke helt og holdent inne i kammeret, så de kan bli ødelagt i løpet av immobilisering, og enlarve som er for stor for chip (&gt; 4 mm) er mindre sannsynlighet for å overleve. b) En mindre vanlig årsak til dødelighet er bruken av for mye trykk eller vakuum ved lasting av brikken. Når den er riktig plassert i brikken, trykket som genereres av vakuum er godt tolerert. Men overdreven press, enten fra vakuum eller i den innledende fasen av posisjonering dyret kan være et problem. Det er best å lære graden av press som trengs empirisk ved forsøk med villtype larver av riktig størrelse. c) Hvis for mye Halocarbon olje dekker dyrets luftrøret dyret kan potensielt ha problemer med langsiktig overlevelse. Oljen spiller flere viktige roller i chip: er det viktig for etableringen av vakuum, optikken under bildebehandling, og det motvirker uttørking i brikken. Men overdreven olje bør unngås. (Dette kan også føre til at olje i røret og sprøyten, kompromittere vakuum). De foreslåtte protokoll strøk bare ventral side av larven med olje, deretter removes overflødig olje ved plassering av larven på en ren dekkglass før de overføres til den endelige dekkglass for bildebehandling. d) fototoksistet kan oppleves fra bildebehandlings økten. Som med alle levende bildebehandlingsprogrammet, er det ideelt å bruke korte eksponeringstider med lav intensitet laserlys, noe som er best oppnås ved hjelp av en svært følsom kamera eller detektor. Prøv å minimere belysning med UV-lys, inkludert bredspektret lys skapt av Hg lyskilder. Andre problemstillinger og fremtidige retninger: Siden denne metoden ikke utnytter bedøvelsesmidler, fortsetter dyrets hjerte å slå. Dette skaper noen uunngåelig mobilitet, noe som påvirker bilde enkelte steder mer enn andre. Eksemplene her viser at den ventrale nerve ledningen, segmental nerver, og kroppsveggen lett kan avbildes uten innblanding fra hjerterytme. I tilfeller der hjerterytme påvirker bildebehandling, kan de vanlige bevegelser noen ganger korrigeres for medi analyseprogramvare (for eksempel bildestabilisator plugin for ImageJ). Dette fungerer godt når enkelte objektene beveger seg på en rask tidsskala (for eksempel ~ 1 mikrometer / sek for rask aksonal transport) eller på en veldig langsom tidsskala (minutter til timer). Imidlertid, når det objekt (er) av interesse trekk med en rekke hastigheter og retninger, kan det være vanskeligere å korrigere for hjerterytme indusert bevegelser. En annen sak er liten variasjon i optikk fra dyr til dyr, eller mellom flere imaging økter av samme dyr i brikken. Jo dypere objektet av interesse er innen dyret, jo større denne variasjonen blir. Segment nerver og ventrale nerve ledningen er vanligvis altfor dypt inne så dyr til å bli fotografert på en vanlig mikroskop. Men det mildt press opplevd i larven chip skyver disse strukturene svært nær skjellaget og dekkglass. Den nøyaktige avstanden til disse strukturene fra dekk vil ha små variasjoner fra trIAL til rettssaken. Variasjonen for objekter lukke skjellaget, slik som celle likene av sensoriske nerveceller, er mindre. Det er derfor viktig, spesielt for å gjøre målinger av intensiteten til å utnytte et stort antall dyr og uavhengige forsøk for å redegjøre for variasjon i optikken. Mens de som vises her eksempler har fokusert på prosesser i nevroner, bør tilnærmingen være mottagelig for bildebehandling noen struktur i dyret som kan bringes i fokus dybden av mikroskop mål. Dette inkluderer skjellaget, kroppen veggen muskler, og deres NMJs. Trachea på den ventrale side av dyret og potensielt deler av fordøyelseskanalen kan også avbildes. Dyret kan også være plassert med sin dorsale side mot dekkglass for kortvarig avbildning av strukturer nær den dorsale overflate. Evnen til å bildestrukturer dypt inne i dyret er begrenset av arbeidsavstanden til mikroskopobjektiv anvendes. Strukturer som imVagina-plater er utilgjengelige for høy forstørrelse (f.eks 40X) mål. Larven chips som er beskrevet i denne protokollen er designet for larver tidlig i det 3. instar scenen (som varierer i størrelse 3,5 til 4 mm). Men mange interessante spørsmål krever bildebehandling på ulike larvestadier. Mindre brikker for å imøtekomme 2 nd stadiums larver, eller større chips å imøtekomme sene 3 rd instars kan enkelt utformet etter samme prinsipp. (Supplerende Figur 1 inneholder en lett modifiserbare DXF fil for å lage silisium muggsopp med endrede kammerstørrelser). Den enkle prinsippet for reversibel tetning kan også festes på andre organismer som for eksempel C. elegans eller sebrafisk, med hoved variant blir kammeret størrelse. En nyttig fremtidige retningen er å utforme en chip som kan immobilisere mange dyr på en gang, for å bruke for screening formål. Men for denne, vil utformingen må være vesentlig forskjelligfra dagens enhet, der spørsmål om plassering av dyr i brikken må behandles med for hvert dyr uavhengig. Den nerve knuse analysen for å studere skade responser i larve perifere nerver: Den nerve knuse analysen beskrevet her for larve segmentell nerver er en enkel metode for å innføre en skade i perifere axoner i Drosophila. Fordelene ved denne fremgangsmåte omfatter: a) det er lett å gjennomføre med standard verktøy som finnes i et Drosophila lab (et stereomikroskop CO to source-og tang), b) den kan gjennomføres raskt for mange dyr, slik biokjemisk analyse av nerveledning etter skade gjennomfør 14, c) de molekylære og cellulære responser til denne skaden er svært reproduserbare 14,15,28 og kan brukes til å oppdage prosesser som også er viktige i virveldyr nevroner 29,30. Alternative metoder for å skade nerveceller er å focusa høyeffekts laser, for eksempel en pulset-UV eller femtosecond laser, for å bryte en axon via laser mikro 17,31-33. Larvene brikken er en ideell metode for posisjonering av dyr for en slik mikrokirurgi. Imidlertid, på grunn av små forskjeller i optikken mellom studier diskutert ovenfor, kan laserbasert metode være vanskeligere å reprodusere i larver, spesielt i larve segmentell nerver. Også laserbasert aksonal skade krever mer tid for å plassere hvert dyr, og derfor er vanskeligere å utføre i stor målestokk (med et stort antall dyr). Feilsøking: Den hyppigst påtruffet teknisk problem fra nerve forelskelsen er død av skader på indre organer. Når du driver trengselen, er det viktig ikke å klemme den ventrale nerve ledningen, spyttkjertlene, eller tarmen. Det er også viktig ikke å punktere skjellaget. Disse problemene er best unngås ved å bringe pinsett i en 45 ° vinkel til skjellaget surface (se figur 3). Kvaliteten på tang har en stor innvirkning på effektiviteten av knuse-og overlevelses etterpå. Vi anbefaler Dumostar nummer fem tang. For å beholde sin skarphet, må pinsett håndteres med forsiktighet, ikke brukes til andre formål, og erstattet når de blir sløve eller bøyd. Størrelsen av dyret kan også påvirke effektiviteten av knuse. Små dyr (mindre enn 3 mm i lengde) er mye mindre sannsynlighet for å overleve skaden. Med store dyr, (vandrende 3 rd instars), er det vanskeligere å finne de nervene og unngå skade på de større spyttkjertlene og tarmer, og det er mindre tid til å studere skade svar før forpupping. Denne nerve knuse blir mest effektivt utført i begynnelsen 3. instar larver (som er ~ 3 til 4,5 mm i lengde langs anteroposteriøre aksen). Den matkilde at dyret er hevet over kan påvirkestyrken på skjellaget og overlevelse etter trengselen. Det anbefales å heve dyr i mat laget av en standard gjær-glukose oppskrift. Den beste metoden for å lære hvordan du gjør knuse effektivt er å øve på mange dyr, først med det primære målet om å oppnå overlevelse (og ikke pupation) 24 timer etter trengselen. Nybegynnere har normalt en lav overlevelse (f.eks 10%), men når teknikken er lært, kan overlevelsen nå ~ 90%. Andre problemstillinger og fremtidige retninger: Den knuse analysen gir en kraftig metode for å studere spirende av axon proksimale til skade området og degenerasjon av axoner og synapser distalt for skaden området. Selv om utbredelsen av degenerasjon variere mellom ulike typer nevroner, er de svært reproduserbare innenfor et gitt neuron-type, som gir bevis på reproduserbarheten av skaden assay. I kontrast til den &quot;regenerative&quot; sproutingrespons observert i proksimale axons er mer utfordrende å studere. Alle aksoner i segmental nerve initiere omfattende spirende nærheten av skadestedet (for eksempel, se figur 6 og figur 3). Men graden av spirende kan variere fra nervecelle til neuron, og det er vanskelig å kvantifisere. En tilsvarende grad og variasjon i spirende kan observeres etter flere fokale lesjoner av single motoneurons i segmental nerver introdusert ved hjelp av en UV Pulsed dye laser. Vi tolker at nondiscriminate retningen på den spirende skyldes fravær av veiledning pekepinner i segmentell nerver. I kontrast, sensoriske nervecellen axons skadet av laser i nærheten av sine celle organer gjennomgå ny aksonal vekst i samme retning som den tapte axon 34. Axoner i denne regionen av dyret er trolig utsatt for mer spesifikk posisjonsinformasjon for veiledning av de regenererende axoner. Miljøet innen segmental nervene er usannsynlig å ha mye resemblance til miljøet som axons opprinnelig navigert under deres veiledning i embryoet, dermed ikke forventes å ha opplysninger å veilede regenererende axons. En annen begrensning for å studere regenerering bruke den segmental nerve knuse analysen er at skadde sensoriske og motoneuron axons fortsatt ha en betydelig avstand til å dekke (0.25-1 mm) for å nå sine mål, og en begrenset tidsramme (&lt;3 dager) før dyret gjennomgår pupation. En fersk studie har identifisert en genetisk manipulering av prothoraciotropic hormon reseptor som tredobler varigheten av 3. instar larvestadiet 35. Dette manipulasjon vil forlenge tidsrammen for å studere utvinning og degenerasjon av nerveceller etter skade betydelig, til ni i stedet for tre dager. Dette kan være lang nok til å observere nye hendelser, som for eksempel ny tilkobling av en skadet akson med sin postsynaptiske mål, spesielt hvis skaden er forårsaket nær den synaptiske ending.

Bananflue, Drosophila melanogaster, har vært benyttet som modellorganisme i over 100 år, og har vist seg instrumental i å definere grunnleggende signal-og utviklingsveier som er bevart fra virvelløse dyr til menneske. Live-avbildning er en viktig tilnærming til å studere cellulære mekanismer, og den enkle kroppen plan og gjennomskinnelig cuticle av Drosophila larven gjør det til et attraktivt system for sanntidsavbildning, spesielt siden det er mange genetiske verktøy tilgjengelig for å uttrykke fluorescently merket proteiner i bestemte celletyper. En viktig utfordring for live bildeteknikker er å invasivt immobilisere og plassere et dyr for mikroskopi. Konvensjonelle metoder omfatter immobilisering disseksjon 1,2 eller bruk av kloroform, som begge avlive dyret. De anestetika ether 4 og isofluorane 5-8 har også blitt brukt. Mens bedøvelse gir mange fordeler, De også hemmer nevral aktivitet og viktig fysiologi (inkludert hjerteslag) 9-11, dermed kan påvirke prosessen studert og skape stress på dyret. Det er også menneskelig sikkerhet bekymringer for å jobbe med eter og isofluorane. Vi har utviklet et stoff-fri metode for å immobilisere Drosophila larver i et enkelt lag PDMS microfluidic enhet, som vi kaller den &quot;larve chip &#39;12. Denne protokollen vil beskrive hvordan få tak i eller lage larven chip, og hvordan du kan utnytte det for live bildebehandling i tidlig-iscenesatt 3 rd stadiums larver. Brikken består av en tettsittende mikrokammeret, som ved påføring av et vakuum via en sprøyte, immobiliserer dyret via skånsom mekanisk kraft. Immobilisering metoden bringer ventral strukturer som nerve ledningen, segmental nerver, og kroppen veggen muskler, med nærhet til et glass dekkglass. Dette gir høy oppløsning avbildning av slike strukturer med høy numerisk aperTure (høy forstørrelse) siktemål. Fordeler med larve-brikken fremfor andre konvensjonelle teknikker, omfatter følgende: (i) Anvendelse av larven chip erstatter bruk av kjemikalier, noe som åpner for in vivo avbildning av unanesthetized dyr. (Ii) Larver komme umiddelbart etter frigjøring fra brikken (i motsetning til en 2 timers restitusjonsperiode for isofluorane 8,13). Dette gjør det mulig for bildebehandling enn brede tidsskalaer, fra millisekunder til minutter, til timer og dager. (Iii) Anvendelse av PDMS, som er en gass-permeable materiale, gjør det mulig for kontinuerlig diffusjon av oksygen / luft fra omgivelsene inn i den larve kroppen. (Iv) Brikken er enkel og trygg å bruke, og (v) den er gjenbrukbar, og kan fremstilles til en rimelig pris. I tillegg til instruksjoner for bruk larven chip, vil denne protokollen gir flere eksempler på bruken for å studere nevrale hendelser i 3. stadiums larver. Disse inkluderer direkte avbildning av axonal transport, kalsium svar til skade, og time-lapse undersøkelser om smugling av foto-konvertible proteiner over lange avstander og tidsskalaer. En annen anvendelse av brikken er å studere neuronal respons på aksonal skade. For dette en ekstra prosedyre er beskrevet (i del 3) for å ha skadet axons innenfor perifere nerver ved en sekvensiell nerve knuse. Denne enkle analysen kan utføres både hurtig og reproduserbart under en standard disseksjon stereomikroskop, som gjør det mulig for mange dyr som skal behandles på samme tid. Cellulære reaksjoner på skaden kan studeres av levende avbildning i larven chip.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1170">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:259px;">0.5 mm Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">14-170-11B</td>
			<td style="width:449px;">Polyethylene tubing, I.D. = 0.023&#8217;&#8217;, O.D. = 0.038&#8217;&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1 mm Polyurethane tubing</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">BB521-63</td>
			<td style="width:449px;">Polyurethane tubing, I.D. = 0.063&#8217;&#8217;,&#160; O.D. = 0.125&#8217;&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">barb to barb connector</td>
			<td style="width:171px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:291px;">732-8300</td>
			<td style="width:449px;">0.8 mm barb to barb connector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">3-way stopcock valve</td>
			<td style="width:171px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:291px;">732-8104</td>
			<td style="width:449px;">Screw on valve for the syringe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Syringe (20 ml)</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">14-817-33</td>
			<td style="width:449px;">Screw on 20 ml syringe for&#160; generating vacuum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">Dispensing needles, 23 G (.4mm I.D., .6mm O.D.)</td>
			<td style="width:171px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:291px;">75165A684</td>
			<td style="width:449px;">Needle for outlet connection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">Dispensing needles, 21 G, (.6mm I.D.,&#160; .8mm O.D.)</td>
			<td style="width:171px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:291px;"><a href="http://www.mcmaster.com/#75165A679" title="Close">75165A679</a></td>
			<td style="width:449px;">Needle for outlet connection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Halocarbon oil</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:291px;">H8898</td>
			<td style="width:449px;">Halocarbon oil 700</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dumostar Number 5 Forceps</td>
			<td style="width:171px;">Roboz</td>
			<td style="width:291px;">RS-498</td>
			<td style="width:449px;">For nerve crush</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">PDMS Kit (Base and curing agent)</td>
			<td style="width:171px;">Ellsworth</td>
			<td style="width:291px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td style="width:449px;">Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Glass Coverslips</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">12-544-C</td>
			<td style="width:449px;">24 x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Disposable Plastic Cup (9 oz.)</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Plastic coffee stirrer stick</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Grape juice agar plates</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"><a href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925">See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in drosophila larvae

Live-avbildning er en viktig teknikk for å studere cellebiologiske prosesser, men dette kan være utfordrende i levende dyr. Den gjennomsiktige cuticle av Drosophila larven gjør det til et attraktivt modellorganisme for live imaging studier. Men, er en viktig utfordring for live imaging teknikker for å invasivt immobilisere og plassere et dyr på mikroskopet. Denne protokollen presenterer en enkel og lett å bruke metoden for å immobilisere og bildebehandling Drosophila larver på en polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic enhet, som vi kaller den &quot;larve chip&quot;. Larvene brikken består av en tettsittende PDMS mikrokammeret som er festet til en tynn glass dekkglass, som ved påføring av et vakuum via en sprøyte, immobiliserer dyret og bringer ventrale strukturer som for eksempel nerveledning, segmental nerver, og kropps veggen muskler, i umiddelbar nærhet til dekkglass. Dette gjør det mulig for bildebehandling med høy oppløsning, og viktigere, unngår bruk av anesthetics og kjemikalier, noe som letter studiet av en rekke fysiologiske prosesser. Siden larver gjenopprette lett fra immobilisering, kan de lett utsettes for flere imaging sesjoner. Dette gjør det mulig for longitudinelle studier over tid kurs som spenner fra timer til dager. Denne protokollen beskriver steg-for-steg hvordan du forberede chip og hvordan du kan utnytte brikken for live avbildning av nevrale hendelser i 3. stadiums larver. Disse hendelsene inkluderer rask transport av organeller i aksoner, kalsium svar til skade, og time-lapse undersøkelser om smugling av foto-konvertible proteiner over lange avstander og tidsskalaer. En annen anvendelse av brikken er å studere regenerativ og degenerative responser til aksonal skade, slik at den andre delen av denne protokoll beskriver en ny og enkel fremgangsmåte for å skade aksoner i perifere nerver av en segmental nerve knuse.

Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae at JoVE.com

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larver er et attraktivt modellsystem for levende avbildning på grunn av deres gjennomskinnelig skjellaget og kraftige genetikk. Denne protokollen beskriver hvordan du kan utnytte en single-layer PDMS enhet, kalt &#39;larve chip &quot;for levende avbildning av cellulære prosesser i nevroner av 3 rd instar Drosophila larver.

Bruke Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue EHT

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or ...

Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate blast-induced traumatic brain injury (TBI). ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Enkle Microfluidic enheter for<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Og Sebrafisk

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

Den Submerged Utskrift av celler på en modifisert overflate ved hjelp av en kontinuerlig strømnings Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Ved hjelp av Cell-substrat Impedans og Live Cell Imaging å måle sanntid Endringer i Cellular Grep og De-adhesjon indusert av Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studier av lungekreft celler ved hjelp av en Multichannel Dual-elektrisk-felt microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Bruke optiske fibre

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Training Persons with Spinal Cord Injury to Ambulate Using a Powered Exoskeleton

Trening Personer med ryggmargsskade å ambulerer Ved hjelp av en motorisert Exoskeleton

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Smelt Electrospinning skriving av tredimensjonale Poly(ε-caprolactone) stillaser med kontrollerbar Morphologies for Tissue Engineering programmer

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...