Name: using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in drosophila larvae
Uploaded: 2014-02-07T14:00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным научным фондом, (грант № IOS-0842701 на CAC), и Национального института здоровья (R00MH080599 чтобы BY, R21 NS062313 к NC, и NS069844 к CAC). Мы хотели бы выразить признательность Джеймс Schutt, Эмили Хан, и Лени Truong для технической поддержки, а также со-центр Блумингтон для мух линий. Все фишки были изготовлены на Лурье Nanofabrication фонда в университете штата Мичиган.

1. Создание PDMS Чип Чтобы сделать чип PDMS от SU-8 плесени, выполните шаги 1.1-1.7. Если чип под рукой, но нуждается в собранном для использования, перейдите к шагу 1.8. <ol><li> Смешайте 45 г PDMS базы и 4,5 г отвердителя (соотношение 10:1) из комплекта PDMS в небольшой пластиковый контейнер одноразового и смешивать их тщательно с помощью пластикового перемешать палочкой. </li><li> Поместите контейнер в вакуумном контейнере (например эксикаторе) в течение 10 мин, чтобы удалить пузырьки воздуха. </li><li> Поместите СУ-8 плесень в нижней части 150 мм в диаметре пластиковую чашку и медленно вылейте смесь PDMS на форме. Будьте осторожны, не для образования пузырьков в то время заливки PDMS. </li><li> Вылечить PDMS в духовке (или инкубатор) при 650 ° С в течение 4 часов. </li><li> Снимите вылечить PDMS/SU-8 формы из духовки и дайте ему остыть в течение нескольких минут. </li><li> Использование лезвие, вырезать вылечить PDMS вдоль края СУ-8 формы и отсоедините его от СУ-8 плесени. </li><li> Разделите PDMS плитув отдельных PDMS чипов с использованием лезвия бритвы. </li><li> Использование дозирования иглы 21 G, ткнуть отверстие в вакуумной порт (изображенный на рисунке 1а) чипа PDMS. </li><li> Возьмите дозирования иглу 23 G и крутить кончик иглы из своей базы несколько раз сломать иглу предупреждать от ступицы блокировки. </li><li> Вставьте кончик иглы 23 G в небольшой кусок полиэтиленовой трубкой, так что трубка охватывает по меньшей мере на миллиметр иглы. Затем используйте лезвие, чтобы сократить избыток трубки от иглы. Это создает пластиковое кольцо вокруг одного конца иглы, который будет создавать уплотнение, когда вставляется во впускной порт вакуум. </li><li> Для использования с инвертированным микроскопом (фиг.1В и 2A-B): вставить кончик иглы 23 G в отверстие вакуумного порта. Для использования с использованием вертикального микроскопа (рис. 1C и 2C-D): совать второе отверстие на боковой стороне чипа PDMS с 21 г dispensing иглу; это отверстие будет предоставлять доступ к первой лунке со стороны. Затем вставьте кончик иглы 23 G с трубки кольца в боковое отверстие. Место кусок двухсторонней ленты на верхней части чипа PDMS, чтобы запечатать верхнее отверстие (рис. 1в). </li><li> Возьмите кусок полиэтиленовой трубки, которая составляет примерно 20 см в длину. Подключение одну сторону трубки с наконечником, который вставляется в вакуумное отверстие иглы. </li><li> Подключите другую сторону трубки к одному из портов на 3-ходового клапана (см. &#39;3-ходовой кран &quot;в списке материалов) </li><li> Присоединить 20 мл шприц в одну из двух остальных портов. Последний порт открыт для окружающей среды. </li></ol> 2. Использование личинка Chip для живых изображений <ol><li> Очистите чип PDMS с прозрачным скотчем. Присоединить кусок ленты в нижней части чипа. Убедитесь, что лента трогает всю поверхность PDMS, а затем снимите пленку. </li><li> Повторить операцию 2-3x, чтобы убедиться,нет частиц или масло (нераспределенная из предыдущих экспериментов) на поверхности чипа PDMS. Поскольку чип PDMS можно использовать повторно, то очень важно, чтобы удалить остатки масла, поскольку это может повлиять на адгезию к стеклу PDMS и привести к недостаточной герметизации. </li><li> Трансфер рано (т.е. нагула) 3-й стадии личинок в чашку Петри, содержащей воду. (Фуражировка 3-й возрастной стадии стадии личинки находятся в пище, а не на стороне флакона культура). Промыть личинок в воде для удаления культуральной среды. </li><li> Возьмите чистую стеклянную покровное и поместите небольшую каплю Галокарбоновое 700 нефти в его центре. </li><li> Использование щипцов, мягко забрать чистый, раннего поставил 3-й возрастной стадии личинки из воды (личинка должна быть ~ 3,5-4 мм в длину). Место животное кратко на легкий уничтожить или бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю воду, а затем поместить его на падение нефти. Падение должно быть достаточно малым, чтобы трахеи личинок не покрыты. Пусть личинка STAу на падение нефти в течение 10 сек. </li><li> Снимите личинку из выпадающего нефти, а затем поместить его на чистую покровного стекла. </li><li> Трансфер личинку в другую чистую стеклянную покровное. Этот шаг снимает излишки масла. </li><li> Обратите внимание на ориентации личинки. Для визуализации нейронных мозга и сегментарные нервы, брюшная сторона личинки должны сидеть на покровное. Его спинной стороны, характеризуется двумя продольными трахеи труб, должна быть обращена вверх. Примечание: это ориентация личинка предпочитает естественно. </li><li> Аккуратно поместите чип PDMS поверх личинки. Личинка должны быть приведены в соответствие центральной середине микрокамере, с его хвостом, ориентированной на вакуумной порт. Будьте осторожны, что личинка не прикасайтесь к краям камеры. Это особенно важно для передней и задней трахеи терминалов. Примечание: этот шаг лучше всего делать под стереомикроскопом. </li><li> Нажмите на чип PDMS против покровным стеклом, чтобы добиться хорошего уплотнения. Убедитесь, что личинка полностьюзаключены микрокамере когда чип PDMS соприкасается стеклянную покровное. </li><li> Переключите 3-ходовой клапан на такие, что шприц можно сделать воздух из микрокамере PDMS (через трубопровод), чтобы создать вакуум. </li><li> С одной стороны, провести чип PDMS / стекло покровное твердо. Используйте другую руку, чтобы вытащить поршень шприца. Вывод 2-2,5 мл воздуха, пока не почувствуете сопротивление в ручке шприца, чтобы создать вакуум. Вакуум создает герметичное уплотнение между чипом PDMS, нефти и покровное интерфейсов и ограничивает подвижность личинки. </li><li> Переключатель клапана с такой, что чип PDMS изолирован от шприца и от окружающей среды. В результате, относительно стабильный уровень вакуума поддерживается в микрокамеры без необходимости проведения поршень шприца. </li><li> Проверьте личинку под стереоскоп, чтобы убедиться, что все тело животного помещается внутри микрокамере, и что животное неподвижным. Трахеи должны быть видны. ОстальныеЧип PDMS должны быть в контакте с покровным. Примечание: см. рисунки 2E и 2F примеры животных правильно, иммобилизованных на чипе. Некоторые неправильные ориентации показаны на рисунках 2G и 2H. </li><li> Поместите личинка чип (чип PDMS + стекло покровное) на микроскопе. Чип личинка, насосно-компрессорные и шприц следует обращаться осторожно, чтобы избежать отряд чипа PDMS от покровного стекла. Для прямой микроскоп, исправить &quot;главного&quot; сторону чипа к столике микроскопа с двухсторонней ленты (рис. 1в). </li><li> Используйте с большим увеличением цель (масло-погружение, 40-63X рекомендуется), чтобы найти структуру (ы) животного интереса и выполнить визуализацию. В некоторых случаях более низком увеличении могут быть необходимы, чтобы определить нужную область для визуализации перед переключением на более высоком увеличении. </li><li> При визуализации завершена, отпустите вакуум путем переключения клапан в положение, которая открыта для окружающей среды. </li><li> Снять чип PDMS от покровного стекла. Личинка должны быть немедленно подвижны. </li><li> Используйте пинцет, чтобы удалить личинку от микрокамере и осторожно положите личинку на виноградных соков агаром для восстановления. </li></ol> 3. Склонение нерв раздавить повреждение личинок Сегментные Нервы <ol><li> Выполните шаг 2,3 выше, чтобы изолировать рано поставил 3-е стадии личинок нужного генотипа. Как описано в шаге 2,3 ванну личинок в воде, чтобы удалить пищу. </li><li> Используйте стандартный муха CO 2 обезболивания станции, с CO 2 колодки держать под рассечение стереомикроскопом, покорить личинок. Личинки должны стать неподвижны после размещения на CO 2 площадки для 1-2 мин. </li><li> Теперь поместите один наркозом личинку на виноградный сок агаром под стереомикроскопа. Поверните животных брюшной стороне до визуализации брюшной нервной и сегментарной нервы через кутикулу ( <strОнг&gt; рис. 3). Убедитесь, что личинка полностью неподвижны. </li><li> Использование Dumostar число-5 щипцов, щепотку сегментарные нервы плотно через кутикулу в течение 5-10 сек. Когда это будет сделано правильно, кутикула остается неизменным, и стена тело не пронзили. Примечание: травма можно проводить при различных положениях вдоль передне-задней оси тела, пока брюшной нервной, слюнных желез и кишечника, не повреждены. Наиболее эффективным расположение травма в конце 3-го сегмента в животе, как показано на рисунке 3D. Травмы в этом месте повреждений большинство нервов и является самым простым, чтобы воспроизвести, не убивая животных. </li><li> После травмы, поверните животное так, чтобы его брюшная сторона вниз на виноградной пластины. Он должен быть в состоянии двигать головой и съесть. Если травма была успешной, то задняя половина личинки будет парализована. </li><li> Держите раненых животных на виноградного сока агаром при 25 &amp;# 176; C в течение интервала времени в соответствии с экспериментальной целью. Для мотонейронов, ближний пень начинает прорастать в пределах 8-10 часов травмы 14, а дальний пень начинает вырождаться в пределах 6-8 часов 15. Для класса IV-да-сенсорных нейронов, ближний пень начинает прорастать в пределах 4-6 ч и дистальной начала пень вырождаться в 3-4 ч после травмы. Примечание: с соответствующими драйверами Gal4 и флуоресцентных журналистами, прорастание и вырождения можно наблюдать в чипе личинки (например, см. рисунок 6). </li></ol>

<ol>
	<li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons.">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li><li>Gunawardena, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila.">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li><li>Miller, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+demonstrates+that+Liprin-alpha+is+required+for+trafficking+of+synaptic+vesicles.">Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles.</a> Curr. Biol. 15, 684-689 (2005).</li><li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+a+synapse+grow:+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila.">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li><li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses.">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li><li>Schmid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+site-specific+changes+of+glutamate+receptor+composition+in+vivo.">Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo.</a> Nat. Neurosci. 11, 659-666 (2008).</li><li>Fuentes-Medel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+and+muscle+sculpt+neuromuscular+arbors+by+engulfing+destabilized+synaptic+boutons+and+shed+presynaptic+debris.">Glia and muscle sculpt neuromuscular arbors by engulfing destabilized synaptic boutons and shed presynaptic debris.</a> PLoS Biol. 7, (2009).</li><li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. , 476-480 (2012).</li><li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+reduces+excitability+of+Drosophila+larval+motoneurons+by+activating+a+hyperpolarizing+leak+conductance.">Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance.</a> Anesthesiology. 108, 434-446 (2008).</li><li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+depresses+glutamate+release+by+reducing+neuronal+excitability+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction.</a> J. Physiol. 558, 489-502 (2004).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo+neuronal+transport+in+genetic+model+organisms+using+microfluidic+devices.">Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices.</a> Traffic. 12, 372-385 (2011).</li><li>Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+in+vivo+imaging+of+cellular+responses+to+neural+injury+in+Drosophila+larvae.">Microfluidic chips for in vivo imaging of cellular responses to neural injury in Drosophila larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>Schmid, A., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neuromuscular+junctions:+histology+and+in+vivo+imaging.">Analysis of neuromuscular junctions: histology and in vivo imaging.</a> Methods Mol. Biol. 420, 239-251 (2008).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).</li><li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda/DLK+MAP+kinase+signaling+cascade.">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J. Neurosci. 32, 610-615 (2012).</li><li>Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Laser+Axotomy+in+C.+elegans.">In vivo Laser Axotomy in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li><li>Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+a+Low-budget+Laser+Axotomy+System+to+Study+Axon+Regeneration+in+C.+elegans.">Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (57), (2011).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2.</a> 2, 2024-2032 (2007).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).</li><li>Rao, S., Lang, C., Levitan, E. S., Deitcher, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+neuropeptide+expression,+transport,+and+exocytosis+in+Drosophila+melanogaster.">Visualization of neuropeptide expression, transport, and exocytosis in Drosophila melanogaster.</a> J. Neurobiol. 49, 159-172 (2001).</li><li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-skipped,+acting+as+a+repressor,+regulates+axonal+projections+in+Drosophila.">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130, 5385-5400 (2003).</li><li>Rietdorf, J., Steitz, A., Heidelberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+unmixing+macro+for+ImageJ.">Linear unmixing macro for ImageJ.</a> European Advanced Light Microscopy Network. , (2004).</li><li>Koon, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulatory+and+paracrine+control+of+synaptic+and+behavioral+plasticity+by+octopaminergic+signaling.">Autoregulatory and paracrine control of synaptic and behavioral plasticity by octopaminergic signaling.</a> Nat. Neurosci. 14, 190-199 (2011).</li><li>Yarali, A., Gerber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neurogenetic+Dissociation+between+Punishment-,+Reward-,+and+Relief-Learning+in+Drosophila.">A Neurogenetic Dissociation between Punishment-, Reward-, and Relief-Learning in Drosophila.</a> Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).</li><li>Kuo, C. T., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrite-specific+remodeling+of+Drosophila+sensory+neurons+requires+matrix+metalloproteases,+ubiquitin-proteasome,+and+ecdysone+signaling.">Dendrite-specific remodeling of Drosophila sensory neurons requires matrix metalloproteases, ubiquitin-proteasome, and ecdysone signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15230-15235 (2005).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Microfluidic+Devices+for+in+vivo+Imaging+of+C.+elegans,+Drosophila.">Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+highwire+ubiquitin+ligase+promotes+axonal+degeneration+by+tuning+levels+of+nmnat+protein.">The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein.</a> PLoS Biol. 10, (2012).</li><li>Shin, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration.">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74, 1015-1022 (2012).</li><li>Watkins, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLK+initiates+a+transcriptional+program+that+couples+apoptotic+and+regenerative+responses+to+axonal+injury.">DLK initiates a transcriptional program that couples apoptotic and regenerative responses to axonal injury.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 4039-4044 (2013).</li><li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway.">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li><li>Guo, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies.">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), (2009).</li><li>Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+up-regulation+of+microtubule+dynamics+and+polarity+reversal+during+regeneration+of+an+axon+from+a+dendrite.">Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 767-777 (2010).</li><li>Miller, D. L., Ballard, S. L., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic+growth+and+function+in+Drosophila+with+an+extended+larval+stage.">Analysis of synaptic growth and function in Drosophila with an extended larval stage.</a> J. Neurosci. 32, 13776-13786 (2012).</li></ol>

Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.

Плодовая муха, дрозофилы, была использована в качестве модельного организма для более чем 100 лет, и доказал важную роль в определении фундаментальной сигнализации и путей развития, которые являются консервативными от беспозвоночных к человеку. Онлайн изображений является важным подход к изучению клеточных механизмов, а также простой план тело и полупрозрачные кутикула личинки дрозофилы делает его привлекательным система для живого изображения, особенно, так как есть много генетических инструментов, доступных для выражения дневно с тегом белков в специфические типы клеток. Важной задачей для живых методов визуализации является неинвазивным иммобилизации и позиционировать животное для микроскопии. Традиционные подходы включают иммобилизации рассечение 1,2 или использование хлороформа, оба из которых убить животное. В анестетики эфир 4 и изофлуораном 5-8 также использовались. В то время как анестетики имеют много преимуществ, Они также тормозят нервную деятельность и важную физиологию (включая сердцебиение) 9-11, следовательно, может повлиять на процесс изучал и создать нагрузку на животных. Есть также проблемы безопасности человека для работы с эфиром и изофлуораном. Мы разработали метод, свободного от наркотиков, чтобы обездвижить личинок дрозофилы в один слой PDMS микрожидкостных устройств, который мы называем «личинка чип &#39;12. Этот протокол описывает, как получить или сделать чип личинка, и как использовать его для живого изображения в ранней постановке 3-м возрастной стадии личинок. Чип состоит из плотного облегающие микрокамеры, который при приложении вакуума с помощью шприца, удерживающую животное через нежной механической силы. Метод иммобилизации приносит брюшной структуры, такие как нервной цепочки, сегментных нервов и тела стены мышц, в непосредственной близости от покровным стеклом. Это позволяет высоким разрешением таких структур с высокой числовой апертурыамплитуды (большом увеличении) цели. Преимущества чип личинки над другими традиционными методами, включают следующее: (я) использование чипа личинки заменяет использование химических веществ, что позволяет в естественных изображений наркозу животных. (II) Личинки восстановить сразу после освобождения из чипа (в отличие от периода восстановления с 2 часами для изофлуораном 8,13). Это позволяет для работы с изображениями с широким охватом временных масштабах, начиная от миллисекунд до нескольких минут, до нескольких часов и дней. (III) Использование PDMS, который представляет собой проницаемый материал газа, дает возможность для непрерывного диффузии кислорода / воздуха из окружающей среды в организм личинки. (IV) чип просто и удобно в использовании, и (V) его можно использовать повторно, и может быть изготовлен при минимальных затратах. В дополнение к инструкции по использованию чипа личинка, этот протокол приведу несколько примеров ее использования для изучения нейронных событий в 3-й возрастной стадии личинок. К ним относятся Живая съемка Axonaл транспорт, ответы кальция травмы, а покадровой исследования торговле фото-кабриолет белков на большие расстояния и временных масштабах. Другое применение чипа является изучение нейронных ответов на аксонов травмы. Для этого дополнительный процедура описана (в части 3) за причинение вреда аксоны в пределах периферических нервов с помощью сегментной нерва давки. Этот простой анализ может выполняться как быстро и воспроизводимо при стандартной диссекции стереомикроскопа, что позволяет в течение многих животных, чтобы быть обработаны одновременно. Сотовые ответы на травмы могут быть изучены живого изображения в чипе личинки.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1170">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:259px;">0.5 mm Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">14-170-11B</td>
			<td style="width:449px;">Polyethylene tubing, I.D. = 0.023&#8217;&#8217;, O.D. = 0.038&#8217;&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1 mm Polyurethane tubing</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">BB521-63</td>
			<td style="width:449px;">Polyurethane tubing, I.D. = 0.063&#8217;&#8217;,&#160; O.D. = 0.125&#8217;&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">barb to barb connector</td>
			<td style="width:171px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:291px;">732-8300</td>
			<td style="width:449px;">0.8 mm barb to barb connector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">3-way stopcock valve</td>
			<td style="width:171px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:291px;">732-8104</td>
			<td style="width:449px;">Screw on valve for the syringe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Syringe (20 ml)</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">14-817-33</td>
			<td style="width:449px;">Screw on 20 ml syringe for&#160; generating vacuum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">Dispensing needles, 23 G (.4mm I.D., .6mm O.D.)</td>
			<td style="width:171px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:291px;">75165A684</td>
			<td style="width:449px;">Needle for outlet connection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">Dispensing needles, 21 G, (.6mm I.D.,&#160; .8mm O.D.)</td>
			<td style="width:171px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:291px;"><a href="http://www.mcmaster.com/#75165A679" title="Close">75165A679</a></td>
			<td style="width:449px;">Needle for outlet connection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Halocarbon oil</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:291px;">H8898</td>
			<td style="width:449px;">Halocarbon oil 700</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dumostar Number 5 Forceps</td>
			<td style="width:171px;">Roboz</td>
			<td style="width:291px;">RS-498</td>
			<td style="width:449px;">For nerve crush</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">PDMS Kit (Base and curing agent)</td>
			<td style="width:171px;">Ellsworth</td>
			<td style="width:291px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td style="width:449px;">Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Glass Coverslips</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">12-544-C</td>
			<td style="width:449px;">24 x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Disposable Plastic Cup (9 oz.)</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Plastic coffee stirrer stick</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Grape juice agar plates</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"><a href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925">See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in drosophila larvae

Онлайн изображений является важным методом для изучения биологических процессов клеток, хотя это может быть сложным в живых животных. Полупрозрачный кутикула личинки дрозофилы делает его привлекательным модельным организмом для живых визуальных исследований. Тем не менее, важной задачей для живых методов визуализации является неинвазивным иммобилизации и позиционировать животное на микроскоп. Этот протокол представляет собой простой и легкий в использовании метод иммобилизации и отображения личинок дрозофилы на полидиметилсилоксана (PDMS) микрофлюидных устройства, которое мы называем &quot;чип личинка&quot;. Чип личинка состоит из плотного облегающие PDMS микрокамере, который прилагается к тонкой покровного стекла, которое, по заявлению вакууме с помощью шприца, обездвиживает животное и приносит брюшной структуры, такие как нервной цепочки, сегментных нервов и тела стены мышцы, в непосредственной близости от покровного стекла. Это позволяет для изображений с высоким разрешением, а главное, позволяет избежать использования ЭНАsthetics и химических веществ, что облегчает изучение широкого круга физиологических процессов. Так как личинки восстановить легко от иммобилизации, они могут быть легко подвергнуты нескольких сеансов обработки изображений. Это позволяет продольных исследований с течением времени курсов колеблется от нескольких часов до нескольких дней. Этот протокол описывает шаг за шагом, как подготовить чипа и, как использовать микросхему для живого изображения нейронных событий в 3-й возрастной стадии личинок. Эти мероприятия включают в себя быстрое продвижение транспортов с органелл в аксонов, ответов кальция травмы, а покадровой исследований торговле фото-кабриолет белков на большие расстояния и временных масштабах. Другое применение чипа является изучение регенеративные и дегенеративные ответов на аксонов травмы, так что вторая часть этого протокола описывает новый и простой процедуры за причинение вреда аксоны в пределах периферических нервов с помощью сегментной нерва давки.

Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae at JoVE.com

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Личинок дрозофилы являются привлекательным модельной системой для живого изображения из-за их полупрозрачной кожицей и мощных генетики. Этот протокол описывает, как использовать в PDMS устройство однослойный, называемый &#39;личинка чип &quot;для живого изображения клеточных процессов в нейронах 3-й возрастной стадии личинок дрозофилы.

Использование Microfluidics фишки для живых изображений и изучения ответов травм в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Личинки

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue EHT

Биолюминесценция изображений для оценки иммунного ответа после вживления Engineered ткани сердца (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or ...

Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

Импульсные наддува нервных клеток травматического Исследование мозговой травмы

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate blast-induced traumatic brain injury (TBI). ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Простой микрофлюидных устройства для<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Визуализация<em&gt; C. Элеганс</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt; И данио рерио

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Endothelialized Microfluidics для изучения взаимодействий в микрососудистой гематологические заболевания

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

Подводная Печать клеток на модифицированной поверхности с помощью непрерывного потока Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Использование Cell-субстрата сопротивление и живых изображений сотовый измерить в реальном времени изменения в клеточной адгезии и Де адгезии, индуцированной Matrix модификации

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Электротаксис Исследования клетки легких рака с использованием многоканального Dual-электрического поля микрофлюидных Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Многоцветная флуоресценция обнаружения для дроплета Microfluidics Использование оптических волокон

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Training Persons with Spinal Cord Injury to Ambulate Using a Powered Exoskeleton

Обучение лиц с повреждением спинного мозга, чтобы передвигаться Использование экзоскелетами

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Расплава Electrospinning написания трехмерных Poly(ε-caprolactone) леса с контролируемым морфологии тканей инженерных приложений

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...