Name: isolation of cortical microglia with preserved immunophenotype and functionality from murine neonates
Uploaded: 2014-01-30T13:00:00
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前にこのプロトコルを開始する、出生後日目新生仔マウスを集め1-3保護さと暖かさのために、元のケージ寝具を使用してネストされた滅菌容器内（P1-3）。これは、ミクログリア収率を最適化するためにこのプロトコルを介して迅速かつ効率的に作業することが重要である。完全な試薬リストについては、表1を参照してください。 1。楽器、文化メディア、料?...

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Neurochem. 80, 697-705 (2002).</li><li>Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonparticipation+of+nuclear+factor+kappa+B+(NFkappaB)+in+the+signaling+cascade+of+c-JunN-terminal+kinase+(JNK)-+and+p38+mitogen-activated+protein+kinase+(p38MAPK)-dependent+tumor+necrosis+factor+alpha+(TNFalpha)+induction+in+lipopolysaccharide+(LPS)-stimulated+microglia.">Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia.</a> Brain Res. , 1073-1074 (2006).</li><li>Beraud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Activation+and+Antioxidant+Responses+Induced+by+the+Parkinson's+Disease+Protein+alpha-Synuclein.">Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson's Disease Protein alpha-Synuclein.</a> J. 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Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li><li>Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+digestion+with+dispase+substantially+reduces+lymphocyte+and+macrophage+cell-surface+antigen+expression.">Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression.</a> J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).</li><li>Pino, P. A., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+brain+and+spinal+cord+mononuclear+cells+using+percoll+gradients.">Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients.</a> J. Vis. 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現在の手順では、新生マウスからの皮質ミクログリアの単離のための効果的な方法を提供しています。この手順では、蛍光イメージング、免疫細胞、およびELISAで測定し、1）保存ミクログリアの免疫表現と機能の2倍の利益を持っている、そして、2）ミクログリアの前に、他のグリア細胞（アストロサイトおよびoligodentrocytes）の存在下で成熟することができますグリア培養成熟期間中に重要?...

小膠細胞は、CNS実質の監視マクロファージは、成体哺乳類の脳の全細胞集団の約12％を構成する。小膠細胞は、卵黄嚢、骨髄前駆細胞に由来し、成体CNS 1-5内の異なる領域における細胞構築の細胞密度および形態が変化している。健康な成人の脳では、ミクログリアは、微細な、ダイナミックなプロセスと、小さな枝状または極性細胞である。周辺マクロファージの形態とは対照的に、ミクログリアは細胞非アクティブとして表示されることがあり、健康な脳では静止、ロープロファイル表現型を示すが、in vivoイメージング研究は、ミクログリアのプロセスを動的」を彷彿とさせる方法で、その微小環境を監視するために拡張し、撤回することを実証サンプリングと測量」6,7。 ミクログリアは、スイッチング、高度かつ差別的脳における環境的および病態生理学的な変化に応答する監視者からの​​状態 - 一般的に彼らの休止およびそれぞれ活性化した状態とみなさエフェクターへ。活性化のこのスイッチは、このような病原体関連分子パターン（PAMP）に反応し、Toll様受容体（TLR）、などの膜結合パターン認識受容体（PRR）の係合によって、すなわち細菌やウイルス由来のリポタンパク質を媒介することができます、核酸、及び炭水化物8-11。のPAMPのほかに、PRRは、また、細胞損傷12-16のようなCNS恒常性に摂動を表す危険/ダメージ関連分子パターン（DAMPS）として知られている無菌の、非病原性の分子に対するミクログリア活性化を誘導することが示されている。かつて従事し、PRRははミクログリア細胞の形態や遺伝子発現の変化をもたらす細胞内シグナル伝達カスケードを開始する、具体的には、活性化したミクログリアは、アメーバ様の表現型を適応させる細胞核にP65、NF-κBサブユニット（P65）を転位し、アップレギュレートのproductionような活性酸素種（ROS）16-24に沿っ腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、インターロイキン1-β（IL-1β）などの炎症誘発性サイトカインの分泌。 CNSの先天性免疫応答の積分が、これらの分泌された分子はまた、それによって、パーキンソン病およびアルツハイマー病などの25-29疾患状態における神経変性を誘導し、悪化、ニューロンの酸化ストレスを増加させることが見出されている。 しかし、病的状態にあるミクログリア活性化のメカニズムは完全には理解されていない。ミクログリアの活性化の生体内での機能の多くは、培養中で要約することができるように、したがって、ミクログリアの単離は、これらの生物学的プロセスへの強力な調査ツールです。いくつかの方法がCNS組織30,31の酵素消化後のパーコール勾配を経由して分離を含むミクログリアを分離するための利用可能です。しかし、酵素消化を変更することができます細胞表面抗原の発現32を減少させることによって、細胞の免疫表現型、および本明細書に記載された方法よりも、動物あたりの細胞収量をもたらす。以前パーコール勾配収率3-5×10 5細胞30,33,34を経由して、全CNSから単離法を報告しながら、具体的には、7.5×10 5細胞の子犬皮質あたりの平均ミクログリア収率を報告している。現在の手順では、それによってミクログリア免疫表現性と機能性を維持し、彼らの低接着特性に基づいたミクログリアを分離することにより、消化酵素の使用を回避する。 （CX3CR1-GFP + / - ）は、本研究では、新生児のヘテロ接合カイン-GFPに由来し混合グリア培養からミクログリア細胞の単離を記載し、ロータリーシェーカー、以前の延長線上の機械的攪拌を経由して、C57BL / 6マウスの皮質公表された方法の24,35。私たちは、ミクログリアの容易な視覚化のための前のマウス系統を利用単球特異的プロモーター36〜38 -これらのマウスは、内因性CX3CR1遺伝子座の制御下にGFPを発現する。このメソッドは、保存免疫表現ex vivoで細菌性リポ多糖（LPS）またはパム3 CSK 4、TLR4およびTLR1 / 2アゴニストでチャレンジしたときの形態学的変化、p65の核移行、およびTNF-αの分泌によって証明されるようにして高純度のミクログリアの文化を生産であった。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:233px;">Glucose</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">G8270</td>
			<td style="width:143px;">Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 &#176;C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Sodium pyruvate 100 mM (100x)</td>
			<td style="width:149px;">Hyclone</td>
			<td style="width:155px;">SH30239.01</td>
			<td style="width:143px;">Store at 4 &#176;C. Used to make MCM and MGM.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x)</td>
			<td style="width:149px;">Gibco</td>
			<td style="width:155px;">15140-122</td>
			<td style="width:143px;">Store at -20 &#176;C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">L-glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td style="width:149px;">Gibco</td>
			<td style="width:155px;">25030-081</td>
			<td style="width:143px;">Store at -20 &#176;C. Used to make MCM and MGM.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Fetal Bovine Serum (Defined)</td>
			<td style="width:149px;">Hyclone</td>
			<td style="width:155px;">SH30070.03</td>
			<td style="width:143px;">Filter sterilize; store at -20 &#176;C. Used to make MCM and MGM.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:233px;">Minimum Essential Medium Earle&#39;s (MEM)</td>
			<td style="width:149px;">Cellgro</td>
			<td style="width:155px;">15-010-CV</td>
			<td style="width:143px;">Without L-glutamine. Contains Earle&#39;s salts. Used to make MCM, MGM, and DM.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Horse Serum</td>
			<td style="width:149px;">Gibco</td>
			<td style="width:155px;">16050</td>
			<td style="width:143px;">Filter sterilize; store at -20 &#176;C. Used to make MCM and MGM.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:149px;">Cellgro</td>
			<td style="width:155px;">21-021-CV</td>
			<td style="width:143px;">Without calcium and magnesium. Store at 4 &#176;C. Used to make MM.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">HEPES 1 M</td>
			<td style="width:149px;">Gibco</td>
			<td style="width:155px;">15630-031</td>
			<td style="width:143px;">Store at 4 &#176;C. Used to make MM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">T-75 Flask</td>
			<td style="width:149px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">430641</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, dilactate (DAPI)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:155px;">D3571</td>
			<td style="width:143px;">Used to stain cell nucleus.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Rabbit anti-Iba1</td>
			<td style="width:149px;">Wako</td>
			<td style="width:155px;">019-19741</td>
			<td style="width:143px;">Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Rabbit anti-NF&#954;B (p65)</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:155px;">7970</td>
			<td style="width:143px;">Used at 1/1250 dilution for ICC staining for p65.</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:233px;">Alexafluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:155px;">A11012</td>
			<td style="width:143px;">Used at 1/1000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">10 ml Disposable Serological Pipet</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">13-678-11E</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">50 ml Disposable Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">05-539-8</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">15 ml Disposible Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">05-539-12</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Sterile Polystyrene Petri Dish</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">875713</td>
			<td style="width:143px;">100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1)</td>
			<td style="width:149px;">Roboz Surgical</td>
			<td style="width:155px;">RS-6010</td>
			<td style="width:143px;">1; 5 inch; used for removing head</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Scissor: Vannas 
			(scissor #2)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">15000-08</td>
			<td style="width:143px;">1; non-angled; 2.5mm cutting edge; used to open scalp</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Scissor: Student Vannas (scissor #3)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">91501-09</td>
			<td style="width:143px;">1; curved; used to mince brain tissue</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Forcep: Dumont #7 
			(forcep #1)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">91197-00</td>
			<td style="width:143px;">2; used to secure nose and remove cortices&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Forcep: Dumont #2 
			(forcep #2)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">11223-20</td>
			<td style="width:143px;">1; used to remove scalp</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Forcep: Dumont #3 
			(forcep #3)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">11231-30</td>
			<td style="width:143px;">1; used to remove skull</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Forcep: Dumont #5a 
			(forcep #4)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">11253-21</td>
			<td style="width:143px;">1; used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Table of specific equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:149px;">Name of Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:143px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Zoom Stereo Dissection Microscope&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Olympus</td>
			<td style="width:155px;">SZ4060</td>
			<td style="width:143px;">Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Laminar-Horizontal Flow Cabinet</td>
			<td style="width:149px;">Nuaire</td>
			<td style="width:155px;">NU-201-330</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:149px;">Labconco</td>
			<td style="width:155px;">3440001</td>
			<td style="width:143px;">Class II</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:233px;">Water-Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>97025-836</td>
			<td style="width:143px;">Set to 37 &#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Swing-out buckets</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td>75006441</td>
			<td style="width:143px;">To be used with Swing-out rotor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Swing-out Rotor</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td>75006445</td>
			<td style="width:143px;">Max Radius: 19.2 (cm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Sorvall Legend RT+ Centrifuge 
			(clinical centrifuge)</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td>75-004-377</td>
			<td style="width:143px;">With swing-out rotor</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">AccuSpin Micro 17 microcentrifuge 
			(tabletop microcentrifuge)</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S98645</td>
			<td style="width:143px;">With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; 
			Cat #: 75003524)&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cortical microglia with preserved immunophenotype and functionality from murine neonates

CNS組織からミクログリアの単離は、ex vivoでミクログリア生物学を研究するために使用される強力な調査ツールです。本発明の方法は、ロータリーシェーカーで機械的攪拌により、新生児マウスの皮質からのミクログリアを単離するための手順を詳しく説明します。このミクログリアの分離法の利回り生体内で正常な、非病理状態で静止ミクログリアを示す形態学的および機能的な特徴を示す高純度皮質ミクログリア。この手順は、形態学的変化、NF-κB（P65）のp65サブユニットの核移行、および特徴的な前炎症性サイトカインの分泌の誘導によって示されるように、ミクログリア免疫表現および生化学的機能を維持し、腫瘍壊死因子α（TNF-α ）、リポポリサッカライド（LPS）とパム3 CSK 4（PAM）の課題に依存する。そのため、本単離法は、静止してACTIの両方の免疫表現を保持するex vivoでの条件でミクログリア生物を調査する実験方法を提供し、ミクログリアをvated。

隔離中のミクログリアex vivoでの免疫表現と機能性を保持することミクログリア生物学のための捜査モデルとして、これらの細胞を利用できることが重要です。本発明の方法を用いて、ミクログリアimmunofunctionalityの正常な保全性を実証するために、我々はP3新生児から皮質ミクログリアを単離した（CX3CR1-GFP + / -およびC57BL / 6）およびLPS又はパムのいずれかで培養物を処理した。...

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Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

ミクログリア生物学の成功の調査の一つの鍵は、CNS組織からの単離の間にex vivoでミクログリア免疫機能の維持である。蛍光イメージング、免疫細胞、および炎症誘発性刺激リポ多糖（LPS）とパム3 CSK 4（PAM）を用いたELISA次のミクログリアの活性化によって評価されるように、高純度と免疫機能細胞培養で回転振盪結果を経由してミクログリアを分離する。

マウス新生児から保護免疫表現と機能皮質ミクログリアの分離

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

新生仔ラットの脳組織の混合グリア細胞培養物から主要なミクログリアの分離

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

マウス歯肉細胞の単離、処理と解析

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

新生児と大人の中枢神経系から培養ミクログリア

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞の精製

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

ネズミリンパ節間質細胞の単離

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

単離と異なる高齢マウス胸腺移植片の移植。

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

母体·胎児界面におけるマウス組織からの白血球の分離

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

単離とマウスリンパ球の活性化

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...