Name: monitoring changes in membrane polarity, membrane integrity, and intracellular ion concentrations in streptococcus pneumoniae using fluorescent dyes
Uploaded: 2014-02-17T22:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes at JoVE.c

Diese Arbeit wurde von der Bill-und-Melinda-Gates-Stiftung (Projekt 53085), der JR Oishei Foundation und der American Lung Association (Förder RG-123721-N) zu APH und NIH (NIDCD) F31DC011218 Gemeinschaft EAC unterstützt.

1. Vorbereiten bakterielle Kulturen <ol><li> Wachsende Kultur für den Einsatz in Experimenten <ol><li> In einem 37 ° C Wärmeblock, eine gefrorene auftauen Lager-Fläschchen von S. pneumoniae und fügen den Inhalt in 9 ml frisches, vorgewärmtes Todd-Hewitt-Medium mit 0,5% Hefeextrakt (THY) für ein Gesamtvolumen von 10 ml in einem Glaskulturröhrchen. </li><li> Inkubieren statisch bei 37 ° C, bis die Kultur die mittlere Log-Phase (Abs 600 nm ≈ 0,5-0,6) erreicht. </li></ol></l...

<ol>
	<li>Hakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+induced+by+a+human+milk+protein.">Apoptosis induced by a human milk protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (17), 8064-8068 (1995).</li><li>Hakansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+folding+variant+of+alpha-lactalbumin+with+bactericidal+activity+against+Streptococcus+pneumoniae.">A folding variant of alpha-lactalbumin with bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae.</a> Mol. Microbiol. 35 (3), 589-600 (2000).</li><li>Hakansson, A. P., Roche-Hakansson, H., Mossberg, A. K., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-Like+Death+in+Bacteria+Induced+by+HAMLET,+a+Human+Milk+Lipid-Protein+Complex.">Apoptosis-Like Death in Bacteria Induced by HAMLET, a Human Milk Lipid-Protein Complex.</a> PLoS One. 6 (3), (2011).</li><li>Kohler, C., Gogvadze, V., Hakansson, A., Svanborg, C., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+folding+variant+of+human+alpha-lactalbumin+induces+mitochondrial+permeability+transition+in+isolated+mitochondria.">A folding variant of human alpha-lactalbumin induces mitochondrial permeability transition in isolated mitochondria.</a> Eur. J. Biochem. 268 (1), 186-191 (2001).</li><li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+membrane+potential+(&#916;&#968;+m)+in+apoptosis;+an+update.">The mitochondrial membrane potential (&#916;&#968; m) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8 (2), 115-128 (2003).</li><li>Dominguez, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+in+bacteria.">Calcium signalling in bacteria.</a> Mol. Microbiol. 54 (2), 291-297 (2004).</li><li>Corratge-Faillie, C., Jabnoune, M., Zimmermann, S., Very, A. A., Fizames, C., Sentenac, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+and+sodium+transport+in+non-animal+cells:+the+Trk/Ktr/HKT+transporter+family.">Potassium and sodium transport in non-animal cells: the Trk/Ktr/HKT transporter family.</a> Cell Mol. Life Sci. 67 (15), 2511-2532 (2010).</li><li>Szabo, I., Petronilli, V., Zoratti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+patch-clamp+study+of+Bacillus+subtilis.">A patch-clamp study of Bacillus subtilis.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1112 (1), 29-38 (1992).</li><li>Zoratti, M., Petronilli, V., Szabo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-activated+composite+ion+channels+in+Bacillus+subtilis.">Stretch-activated composite ion channels in Bacillus subtilis.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 168 (2), 443-450 (1990).</li><li>Novo, D., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+flow+cytometric+membrane+potential+measurement+in+bacteria+using+diethyloxacarbocyanine+and+a+ratiometric+technique.">Accurate flow cytometric membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique.</a> Cytometry. 35 (1), 55-63 (1999).</li><li>Novo, D. J., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+flow+cytometric+analysis+of+antibiotic+effects+on+membrane+potential,+membrane+permeability,+and+bacterial+counts+of+Staphylococcus+aureus+and+Micrococcus+luteus.">Multiparameter flow cytometric analysis of antibiotic effects on membrane potential, membrane permeability, and bacterial counts of Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 44 (4), 827-834 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+estimation+by+flow+cytometry.">Membrane potential estimation by flow cytometry.</a> Methods. 21 (3), 271-279 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+analysis+at+the+single-cell+level:+tasks+and+techniques.">Microbial analysis at the single-cell level: tasks and techniques.</a> J. Microbiol. Methods. 42 (1), 3-16 (2000).</li><li>Bashford, C. L., Chance, B., Smith, J. C., Yoshida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behavior+of+oxonol+dyes+in+phospholipid+dispersions.">The behavior of oxonol dyes in phospholipid dispersions.</a> Biophys. J. 25 (1), 63-85 (1979).</li><li>Suzuki, H., Wang, Z. -. Y., Yamakoshi, M., Kobayashi, M., Nozawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+transmembrane+potential+of+bacterial+cells+by+voltage-sensitive+dyes.">Probing the transmembrane potential of bacterial cells by voltage-sensitive dyes.</a> Anal. Sci. 19 (9), 1239-1242 (2003).</li><li>Breeuwer, P., Abee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+membrane+potential,+intracellular+pH+and+respiration+of+bacteria+employing+fluorescence+techniques.">Assessment of the membrane potential, intracellular pH and respiration of bacteria employing fluorescence techniques.</a> Mol. Microb. Ecol. Manual. 8, 1563-1580 (2004).</li><li>Mortimer, F. C., Mason, D. J., Gant, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+monitoring+of+antibiotic-induced+injury+in+Escherichia+coli+using+cell-impermeant+fluorescent+probes.">Flow cytometric monitoring of antibiotic-induced injury in Escherichia coli using cell-impermeant fluorescent probes.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 44 (3), 676-681 (2000).</li><li>Clementi, E. A., Marks, L. R., Duffey, M. E., Hakansson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Initiation+Mechanism+of+Death+in+Streptococcus+pneumoniae+Induced+by+the+Human+Milk+Protein-Lipid+Complex+HAMLET+and+Activated+during+Physiological+Death.">A Novel Initiation Mechanism of Death in Streptococcus pneumoniae Induced by the Human Milk Protein-Lipid Complex HAMLET and Activated during Physiological Death.</a> J. Biol. Chem. 287 (32), 27168-27182 (2012).</li><li>Trombe, M. C., Laneelle, G., Sicard, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Streptococcus+pneumoniae+mutant+with+altered+electric+transmembrane+potential.">Characterization of a Streptococcus pneumoniae mutant with altered electric transmembrane potential.</a> J. Bacteriol. 158 (3), 1109-1114 (1984).</li><li>Trombe, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+calcium+porter+of+Streptococcus+pneumoniae+involved+in+calcium+regulation+of+growth+and+competence.">Characterization of a calcium porter of Streptococcus pneumoniae involved in calcium regulation of growth and competence.</a> J. Gen. Microbiol. 139 (3), 433-439 (1993).</li><li>Marks, L. R., Clementi, E. A., Hakansson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitization+of+Staphylococcus+aureus+to+Methicillin+and+Other+Antibiotics+In+Vitro+and+In+Vivo+in+the+Presence+of+HAMLET.">Sensitization of Staphylococcus aureus to Methicillin and Other Antibiotics In Vitro and In Vivo in the Presence of HAMLET.</a> PLoS ONE. 8 (5), (2013).</li><li>Futsaether, C. M., Johnsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fura-2+to+measure+intracellular+free+calcium+in+Propionibacterium+acnes.">Using fura-2 to measure intracellular free calcium in Propionibacterium acnes.</a> Can. J. Microbiol. 40 (6), 439-445 (1994).</li><li>Tisa, L. S., Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+properties+of+Escherichia+coli+mutants+having+abnormal+Ca2++content.">Chemotactic properties of Escherichia coli mutants having abnormal Ca2+ content.</a> J. Bacteriol. 177 (24), 7112-7118 (1995).</li><li>Werthen, M., Lundgren, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++mobilization+and+kinase+activity+during+acylated+homoserine+lactone-dependent+quorum+sensing+in+Serratia+liquefaciens.">Intracellular Ca2+ mobilization and kinase activity during acylated homoserine lactone-dependent quorum sensing in Serratia liquefaciens.</a> J. Biol. Chem. 276 (9), 6468-6472 (2001).</li><li>Avery, O. T., MacLeod, C. M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types.+Induction+of+transformation+by+a+dexoxyribonuceic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III.">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a dexoxyribonuceic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J. Exp. Med. 79, 137-158 (1944).</li><li>Clementi, E. A., Wilhelm, K. R., Schleucher, J., Morozova-Roche, L. A., Hakansson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+of+Equine+Lysozyme+and+Oleic+Acid+with+Bactericidal+Activity+against.">A Complex of Equine Lysozyme and Oleic Acid with Bactericidal Activity against.</a> PLoS One. . 8, (2013).</li></ol>

Trotz der Einschränkung, dass Größe stellt für die Verwendung von klassischen Methoden der Elektrophysiologie, Änderungen in der Polarität und der Unversehrtheit der Membran und Änderungen der Ionenkonzentration in Bakterien zu detektieren, haben wir einen Weg, um diese Ereignisse zu messen beschrieben in S. pneumoniae Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen. Unsere Protokolle sind die ersten ihrer Art für die Pneumokokken und einer der wenigen, für die Bakterienarten im Allgemeinen beschrieben wird. Dur...

Unser Labor hat ein Protein-Lipid-Komplex aus menschlicher Milch namens Hamlet (für Menschen Alpha-Lactalbumin Aus tödlich Tumorzellen), die Apoptose in Tumorzellen induziert identifiziert, aber auch in der Lage, eine Vielzahl von Bakterienarten 1,2 töten. Die Arten, die sich als besonders sensitiv waren diejenigen, die die Atemwege zielen, mit Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) Anzeigen des größten Empfindlichkeit und ein Apoptose-ähnlichen Phänotyp Todes 2,3. Membrandepolarisation und spezifische Ionentransportereignisse sind gut beschrieben und entscheidenden Ereignisse während der Apoptose in eukaryotischen Zellen, insbesondere in den Mitochondrien, wo radioaktive TPP +-Ionen und Fluoreszenzfarbstoffe einschließlich JC-1 und TMRE wurden zur Depolarisation der Mitochondrienmembran 3 zeigen, -5. So haben wir versucht, mehr über die Wirkung von HAMLET auf diesen Membran-bezogene Funktionen in der Pneumokokken zu lernen, wie wir unsere Anstrengungen konzentrierenein besseres Verständnis der mechanistischen Komponenten des Apoptose-ähnlichen Phänotyps in Bakterien mit großem Potential zur Identifizierung neuer antibakterielle Therapien oder Impfstoffkandidaten in den Prozess. In dem Bestreben, Protokolle für unsere mechanistische Untersuchungen zu schaffen, haben wir entdeckt, dass im Gegensatz zu den gut beschriebenen Methodik in eukaryontischen Systemen, gibt es sehr wenige veröffentlichte Studien Detaillierung Elektrophysiologie und Ionentransportmechanismen der bakteriellen Membran 6,7. Dies ist vor allem auf die kleinere Größe der Mikroorganismen und ihrer Oberflächenarchitektur, insbesondere die Anwesenheit von Zellwand beschränkt, dass die Zugänglichkeit der Membran für die Verwendung von herkömmlichen Methoden, wie eukaryontische Patch-Clamping, obwohl einige Studien mit riesigen Protoplasten wurden mit unterschiedlichem Erfolg durchgeführt worden zurückzuführen 8,9. Wie die Arbeit mit diesen riesigen Protoplasten ist keine ideale oder sogar praktische Methode für die meisten Bakterienarten, da es Menschen erfordertipulated Bakterien in einer unnatürlichen und abiotischen Zustand die begrenzte Studien der Bakterienmembran Polarität, die durchgeführt wurden in erster Linie verwendet Durchflusszytometrie und die Verwendung von Cyanin-und Oxonol-Farbstoffe fluoreszierende 10-16. Statt der Durchflusszytometrie, welche einzelnen Fluoreszenzmesswerte zu einem einzigen Zeitpunkt Punkt sammelt von einem Bakterium, entschieden wir uns, eine Fluoreszenzdetektion Plattenlesegerät verwenden, um Fluoreszenzintensität der Bakteriensuspensionen in einer 96-Well-Plattenformat im Laufe der Zeit zu erkennen. Dies ermöglichte es uns, eine Population von Bakterien zu verschiedenen Zeitpunkten mit viel größerer Einfachheit und Leichtigkeit zu behandeln und überwachen kontinuierlich die Fluoreszenz-Kinetik der gesamten Bevölkerung für längere Zeit, die nur schwer mittels Durchflusszytometrie zu erreichen ist. Nach dem Testen eine Vielzahl der potentialsensitive Fluoreszenzfarbstoffe (einschließlich der oben zur Verwendung mit der genannten Mitochondrien) erzielten wir die besten technischen und praktischen Erfolg mit derBis-Oxonol-Farbstoff genannt DiBAC 4 (3) (Bis-(1,3-dibutylbarbituric Säure) Trimethinoxonol) auf Änderungen in der Polarität zu überwachen. Wir fanden es auch wertvoll, um gleichzeitig Störungen in der Unversehrtheit der Membran unter Verwendung von Propidiumiodid (PI) zu überwachen. Dieser Farbstoff fluoresziert bei der Bindung an Nukleinsäure, ist aber nur in der Lage, dies zu tun, wenn die Integrität der Bakterienmembran beeinträchtigt wird, so dass es die beliebte Komponente verwendet, um tote Zellen zu erkennen im Live-tot-Färbung-Assays. Zusätzlich zu PI, SYTOX grün und TO-PRO-1 sind Fluoreszenzfarbstoffe, die eine ähnliche Wirkung besitzen und wurden zuvor für Bakterien in einigen Studien unter Verwendung der Durchflusszytometrie Nachweisverfahren 17 verwendet. Wir entschieden uns, PI wegen seiner Anregungswellenlänge, die uns zu seiner Fluoreszenz gleichzeitig mit DiBAC in einer gegebenen Probe zu überwachen erlaubt zu verwenden. In unseren Studien haben wir, dass HAMLET, sowie ein weiteres verwandtes Protein-Lipid-Komplex mit der bakteriziden Aktivität beobachtetals Eloa induzierte Depolarisation und Bruch der Bakterienmembran bekannt, wie durch Zunahme der Fluoreszenz der beiden Farbstoffe bei der Behandlung der Pneumokokken 3,18,26 angegeben. Für beide Komplexe beobachteten wir, dass die Fluoreszenzintensität der DiBAC 4 (3) vor der Erhöhung der Intensität des PI erhöht, was anzeigt, daß die Depolarisation stattgefunden vor Bruch und ist daher ein bestimmtes Ereignis durch unsere bakterizide Protein-Lipid-Komplexen von induzierten Interesse. Diese Unterscheidung ist wichtig zu machen, als Bruch der Membran selbst verursachen unspezifische Depolarisation. Messung und Analyse sowohl DiBAC 4 (3) und PI-Fluoreszenz-Kinetik gleichzeitig erlaubt es uns, diese Beziehung zwischen den beiden Membran Ereignisse, die ein zusätzlicher Vorteil der Verwendung Fluorometrie statt Durchflusszytometrie ist zu prüfen. Um bakterielle Ionenfluss zu überwachen, hat es einige bisherigen Erfolge mit der Verwendung von Radioisotopen, einschließlich der Aufnahme von Mess45 Ca 2 + in der Pneumokokken 19,20, die wir auch in unseren bisherigen Untersuchungen 18, 21 verwendet. , Die Arbeit mit diesen radioaktiven Ionen hat jedoch mehrere Nachteile. Sie können teuer, zeitaufwendig und schwierig, und auch die einzelnen aussetzen Durchführung des Experiments zu schaden, abhängig von der Isotopen von Interesse. Zusätzlich ist es schwierig, schnelle Änderungen im Laufe der Zeit zu überwachen. Somit Richtung einer alternativen Methode der Messung, die Acetoxymethyl-(AM)-ester Versionen von ionensensitiven Fluoreszenzindikatorfarbstoffe verwendet wandten wir. An sich ist der Indikatorfarbstoff gegeben und nicht durch die Membran leicht, aber mit der Zugabe des lipophilen Estergruppe kann die jetzt ungeladenes Molekül durch die Membran des Bakteriums geben. Beim Eintritt in den Innenraum, die Bakterien Esterasen spalten die Estergruppe, so dass der Farbstoff in der Zelle frei und wieder aufgeladen, deutlich verlangsamt seine Fähigkeit, die Zelle zu verlassen und so der Farbstoff to reichern sich über die Zeit. Jedoch ist die Verwendung dieser Ester Farbstoffe nur in einigen Bakterienspezies beschrieben worden, um Veränderungen der intrazellulären Ca 2 + + H 22-24 und 16 zu erkennen, mit unterschiedlichen Methoden der Beladung, Detektion und Erfolg. Mit dem Wunsch, Änderungen der intrazellulären Ca 2 + zu überwachen und K + und H +-Konzentrationen in S. pneumoniae bei Behandlung mit HAMLET und andere Verbindungen, die wir erfolgreich erstellt Protokolle, um fluoreszierende Indikatorfarbstoffe in Bakterienzellen effizient zu laden. Effektive Laden in Bakterien erforderlich, die sowohl Probenecid Farbstoffretention erhöht durch die Blockierung Anionen-Transporter und Antriebsladung, eine proprietäre Verbindung von Life Technologies, die Beladungseffizienz erhöht. Fura-2/AM (Erfassungs Ca 2 +), PBFI / AM (Erfassungs K +) und BCECF / AM (Erfassungs H +) wurden erfolgreich in sowohl nicht eingekapselte und eingekapselt Pneumokokken st geladenRegen eine Messung der resultierenden Fluoreszenz-Muster nach der Zugabe von Ionophoren, wie Ionomycin (Ca 2 + Entkoppler) Valinomycin (K + Entkoppler) und CCCP (H + Entkoppler) unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenleseerfassungs 18, 21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="864">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Todd Hewitt</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">249240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5879</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:359px;">DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P4170</td>
			<td>Make up in deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PowerLoad</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P10020</td>
			<td>100X concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Probenecid</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P36400</td>
			<td>Make 100X stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Fura-2/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">F1221</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PBFI/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P1267</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nigericin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">3246-01</td>
			<td>monobasic</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">K2HPO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">4012-01</td>
			<td>dibasic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">NaOH</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">5565-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">BCECF/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B1170</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">CCCP</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm,</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;dissipating the electrical potential and the H+ gradient.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Culture tube&#160;</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">53283-802</td>
			<td>Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Spectronic 20D+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">15 ml plastic conical tube</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Clear 96-well polystyrene microtiter plate</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Plate reader</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Synergy 2 Multi-Mode&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:143px;">Microplate Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Gen5 software</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Gen5&#8482; Software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring changes in membrane polarity, membrane integrity, and intracellular ion concentrations in streptococcus pneumoniae using fluorescent dyes

Membran-Depolarisation und Ionenflüsse sind Ereignisse, die ausgiebig in biologischen Systemen aufgrund ihrer Fähigkeit, tiefgreifend beeinträchtigen Zellfunktionen, einschließlich Energetik und Signaltransduktion untersucht worden sind. Während beide Fluoreszenz-und elektrophysiologischen Methoden, einschließlich Elektrodenverbrauch und Patch-Clamp, sind gut für die Messung dieser Ereignisse in eukaryotischen Zellen entwickelt haben Methodik zur Messung von ähnlichen Veranstaltungen in Mikroorganismen schwieriger zu entwickeln, bewährt aufgrund ihrer geringen Größe in Kombination mit der immer komplexer äußeren Oberfläche von Bakterien Abschirmen der Membran. Während unserer Studien des Todes-Einweihung in Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken), wollten wir die Rolle der Membran Ereignisse, einschließlich der Änderungen in der Polarität, Integrität und intrazellulären Ionenkonzentrationen aufzuklären. Suche in der Literatur fanden wir, dass nur sehr wenige Studien existieren. Andere Forscher hatten Radioisotop-Aufnahme oder Ionen-Gleichgewicht Grippe messen überwachtxes und Membranpotential und eine begrenzte Anzahl von Studien, vor allem in Gram-negative Organismen, hatte einige Erfolge gesehen mit Carbocyanin oder oxonol fluoreszierenden Farbstoffen Membranpotential zu messen, oder Laden Bakterien mit Zell-permeant acetoxymethyl (AM)-Ester-Versionen von ionensensitiven fluoreszierende Indikatorfarbstoffe. Wir haben deshalb festgelegt und optimierte Protokolle für die Messung Membranpotential, Bruch, und Ionentransport in der Gram-positiven Organismus S. pneumoniae. Wir entwickelten Protokollen unter Verwendung des Bis-Oxonol-Farbstoff DiBAC 4 (3) und der Zell-impermeante Farbstoff Propidiumiodid zu Membrandepolarisation und Bruch zu messen, die jeweils, ebenso wie Verfahren, um optimal die Pneumokokken mit den AM-Ester der ratiometrische Farbstoffe laden Fura-2, PBFI und BCECF um Veränderungen der intrazellulären Konzentration von Ca 2 +, K + und H +, jeweils zu erfassen, unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenleseerfassungs. Diese Protokolle sind die ersten ihrer Art für die Pneumokokkenund die meisten dieser Farbstoffe nicht in andere Bakterienspezies verwendet wurde. Obwohl unsere Protokolle für S. optimiert pneumoniae, glauben wir, diese Ansätze sollten einen hervorragenden Ausgangspunkt für ähnliche Studien in anderen Bakterienarten bilden.

Bei allen Experimenten, gibt es eine Reihe von Proben und in jeder Vertiefung vorhanden Bedingungen. Somit wird jedes Verfolgung stellt die Fluoreszenzintensität einer gesamten Bakterienpopulation im Laufe der Zeit. Die Ergebnisse sollten leicht zu interpretieren sein, mit einer klaren Unterscheidung zwischen der Fluoreszenz der behandelten Proben und die der unbehandelten Kontrollen. Die Kinetik und der Grad eines beobachteten Fluoreszenzänderung kann Informationen über die möglichen Mechanismus und das Au...

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Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Überwachen von Änderungen in Membran-Polarity, Membrane Integrity und intrazelluläre Ionenkonzentrationen in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Verwenden von Fluoreszenzfarbstoffen

Anders als bei Eukaryonten zu sehen, gibt es nur wenig Untersuchungen, die detailliert Membrandepolarisation und Ionenkonzentrationsänderungen in Bakterien, in erster Linie ihrer geringen Größe macht herkömmliche Messverfahren schwierig. Hier haben wir ausführlich Protokolle zur Überwachung solcher Veranstaltungen in der deutlichen Gram-positive Erreger Streptococcus pneumoniae Verwendung Fluoreszenztechniken.

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Mit Bioluminescent Imaging, um Synergie von Untersuchen Streptococcus pneumoniae Und Influenza A Virus in Infant Mäuse

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging von Bacillus subtilis Und Streptococcus pneumoniae Verwendung von Automated Zeitraffer-Mikroskopie

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Charakterisierung von Entzündungsreaktionen während der intranasalen Kolonisation mit Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

Kapsel Serotypisierung von<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Verwenden der Quellung Reaktion

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Kapsel Serotypisierung<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Durch Latexagglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Antikörpermarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen unter Verwendung von magnetischen Protein A und Protein G-Kügelchen

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Reinigung der Membran-Fach für endoplasmatische Retikulum-assoziierten Abbau von exogenen Antigenen in Kreuz-Präsentation

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Zellmembran Reparatur Assays mit einem zwei-Photonen-Laser-Mikroskop

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...