Name: monitoring changes in membrane polarity, membrane integrity, and intracellular ion concentrations in streptococcus pneumoniae using fluorescent dyes
Uploaded: 2014-02-17T22:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes at JoVE.c

עבודה זו נתמכה על ידי קרן ביל ומלינדה גייטס (גרנט 53085), קרן JR Oishei, ואיגוד הריאות האמריקאי (גרנט RG-123,721-N) לAPH, וF31DC011218 מלגת NIH (NIDCD) לEAC.

1. הכנת תרבויות חיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גידול התרבות לשימוש בניסויים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבלוק חימום 37 מעלות צלזיוס, להפשיר מניות בקבוקון קפוא של ס דלקת ריאות ולהוסיף התוכן שלה ל9 מיליליטר ש?...

<ol>
	<li>Hakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+induced+by+a+human+milk+protein.">Apoptosis induced by a human milk protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (17), 8064-8068 (1995).</li><li>Hakansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+folding+variant+of+alpha-lactalbumin+with+bactericidal+activity+against+Streptococcus+pneumoniae.">A folding variant of alpha-lactalbumin with bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae.</a> Mol. Microbiol. 35 (3), 589-600 (2000).</li><li>Hakansson, A. P., Roche-Hakansson, H., Mossberg, A. K., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-Like+Death+in+Bacteria+Induced+by+HAMLET,+a+Human+Milk+Lipid-Protein+Complex.">Apoptosis-Like Death in Bacteria Induced by HAMLET, a Human Milk Lipid-Protein Complex.</a> PLoS One. 6 (3), (2011).</li><li>Kohler, C., Gogvadze, V., Hakansson, A., Svanborg, C., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+folding+variant+of+human+alpha-lactalbumin+induces+mitochondrial+permeability+transition+in+isolated+mitochondria.">A folding variant of human alpha-lactalbumin induces mitochondrial permeability transition in isolated mitochondria.</a> Eur. J. Biochem. 268 (1), 186-191 (2001).</li><li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+membrane+potential+(&#916;&#968;+m)+in+apoptosis;+an+update.">The mitochondrial membrane potential (&#916;&#968; m) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8 (2), 115-128 (2003).</li><li>Dominguez, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+in+bacteria.">Calcium signalling in bacteria.</a> Mol. Microbiol. 54 (2), 291-297 (2004).</li><li>Corratge-Faillie, C., Jabnoune, M., Zimmermann, S., Very, A. A., Fizames, C., Sentenac, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+and+sodium+transport+in+non-animal+cells:+the+Trk/Ktr/HKT+transporter+family.">Potassium and sodium transport in non-animal cells: the Trk/Ktr/HKT transporter family.</a> Cell Mol. Life Sci. 67 (15), 2511-2532 (2010).</li><li>Szabo, I., Petronilli, V., Zoratti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+patch-clamp+study+of+Bacillus+subtilis.">A patch-clamp study of Bacillus subtilis.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1112 (1), 29-38 (1992).</li><li>Zoratti, M., Petronilli, V., Szabo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-activated+composite+ion+channels+in+Bacillus+subtilis.">Stretch-activated composite ion channels in Bacillus subtilis.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 168 (2), 443-450 (1990).</li><li>Novo, D., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+flow+cytometric+membrane+potential+measurement+in+bacteria+using+diethyloxacarbocyanine+and+a+ratiometric+technique.">Accurate flow cytometric membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique.</a> Cytometry. 35 (1), 55-63 (1999).</li><li>Novo, D. J., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+flow+cytometric+analysis+of+antibiotic+effects+on+membrane+potential,+membrane+permeability,+and+bacterial+counts+of+Staphylococcus+aureus+and+Micrococcus+luteus.">Multiparameter flow cytometric analysis of antibiotic effects on membrane potential, membrane permeability, and bacterial counts of Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 44 (4), 827-834 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+estimation+by+flow+cytometry.">Membrane potential estimation by flow cytometry.</a> Methods. 21 (3), 271-279 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+analysis+at+the+single-cell+level:+tasks+and+techniques.">Microbial analysis at the single-cell level: tasks and techniques.</a> J. Microbiol. Methods. 42 (1), 3-16 (2000).</li><li>Bashford, C. L., Chance, B., Smith, J. C., Yoshida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behavior+of+oxonol+dyes+in+phospholipid+dispersions.">The behavior of oxonol dyes in phospholipid dispersions.</a> Biophys. J. 25 (1), 63-85 (1979).</li><li>Suzuki, H., Wang, Z. -. Y., Yamakoshi, M., Kobayashi, M., Nozawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+transmembrane+potential+of+bacterial+cells+by+voltage-sensitive+dyes.">Probing the transmembrane potential of bacterial cells by voltage-sensitive dyes.</a> Anal. Sci. 19 (9), 1239-1242 (2003).</li><li>Breeuwer, P., Abee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+membrane+potential,+intracellular+pH+and+respiration+of+bacteria+employing+fluorescence+techniques.">Assessment of the membrane potential, intracellular pH and respiration of bacteria employing fluorescence techniques.</a> Mol. Microb. Ecol. Manual. 8, 1563-1580 (2004).</li><li>Mortimer, F. C., Mason, D. J., Gant, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+monitoring+of+antibiotic-induced+injury+in+Escherichia+coli+using+cell-impermeant+fluorescent+probes.">Flow cytometric monitoring of antibiotic-induced injury in Escherichia coli using cell-impermeant fluorescent probes.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 44 (3), 676-681 (2000).</li><li>Clementi, E. A., Marks, L. R., Duffey, M. E., Hakansson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Initiation+Mechanism+of+Death+in+Streptococcus+pneumoniae+Induced+by+the+Human+Milk+Protein-Lipid+Complex+HAMLET+and+Activated+during+Physiological+Death.">A Novel Initiation Mechanism of Death in Streptococcus pneumoniae Induced by the Human Milk Protein-Lipid Complex HAMLET and Activated during Physiological Death.</a> J. Biol. Chem. 287 (32), 27168-27182 (2012).</li><li>Trombe, M. C., Laneelle, G., Sicard, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Streptococcus+pneumoniae+mutant+with+altered+electric+transmembrane+potential.">Characterization of a Streptococcus pneumoniae mutant with altered electric transmembrane potential.</a> J. Bacteriol. 158 (3), 1109-1114 (1984).</li><li>Trombe, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+calcium+porter+of+Streptococcus+pneumoniae+involved+in+calcium+regulation+of+growth+and+competence.">Characterization of a calcium porter of Streptococcus pneumoniae involved in calcium regulation of growth and competence.</a> J. Gen. Microbiol. 139 (3), 433-439 (1993).</li><li>Marks, L. R., Clementi, E. A., Hakansson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitization+of+Staphylococcus+aureus+to+Methicillin+and+Other+Antibiotics+In+Vitro+and+In+Vivo+in+the+Presence+of+HAMLET.">Sensitization of Staphylococcus aureus to Methicillin and Other Antibiotics In Vitro and In Vivo in the Presence of HAMLET.</a> PLoS ONE. 8 (5), (2013).</li><li>Futsaether, C. M., Johnsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fura-2+to+measure+intracellular+free+calcium+in+Propionibacterium+acnes.">Using fura-2 to measure intracellular free calcium in Propionibacterium acnes.</a> Can. J. Microbiol. 40 (6), 439-445 (1994).</li><li>Tisa, L. S., Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+properties+of+Escherichia+coli+mutants+having+abnormal+Ca2++content.">Chemotactic properties of Escherichia coli mutants having abnormal Ca2+ content.</a> J. Bacteriol. 177 (24), 7112-7118 (1995).</li><li>Werthen, M., Lundgren, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++mobilization+and+kinase+activity+during+acylated+homoserine+lactone-dependent+quorum+sensing+in+Serratia+liquefaciens.">Intracellular Ca2+ mobilization and kinase activity during acylated homoserine lactone-dependent quorum sensing in Serratia liquefaciens.</a> J. Biol. Chem. 276 (9), 6468-6472 (2001).</li><li>Avery, O. T., MacLeod, C. M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types.+Induction+of+transformation+by+a+dexoxyribonuceic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III.">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a dexoxyribonuceic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J. Exp. Med. 79, 137-158 (1944).</li><li>Clementi, E. A., Wilhelm, K. R., Schleucher, J., Morozova-Roche, L. A., Hakansson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+of+Equine+Lysozyme+and+Oleic+Acid+with+Bactericidal+Activity+against.">A Complex of Equine Lysozyme and Oleic Acid with Bactericidal Activity against.</a> PLoS One. . 8, (2013).</li></ol>

למרות המגבלה שהגודל מציג לשימוש בשיטות אלקטרופיזיולוגיה קלאסיות כדי לזהות שינויים בקוטביות ושלמותו של הקרום והשינויים בריכוזי יונים בתוך חיידקים, שתארנו דרך למדוד את האירועים הללו בס דלקת ריאות באמצעות צבעי ניאון. הפרוטוקולים שלנו הם הראשונים מסוגם תיארו לpneu...

המעבדה שלנו זיהתה חלבון מורכב שומנים מחלב אדם בשם המלט (לאדם Alpha-lactalbumin Made קטלני לתאים סרטניים), שגורם לאפופטוזיס בתאים סרטניים, אבל הוא גם מסוגל להרוג מגוון רחב של מיני חיידקי 1,2. המינים שנמצאו להיות רגיש במיוחד היו אלה המכוונים את דרכי נשימה, עם Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) בו מוצגות הרגישות הגדולה ופנוטיפ כמו אפופטוזיס, מות 2,3. אירועי תחבורת שלילת קוטביות קרום ויון ספציפיים שתוארו היטב ואירועים מכריעים באפופטוזיס בתאי אוקריוטים, בפרט במיטוכונדריה, שבו יונים רדיואקטיביים TPP + וצבעי ניאון כולל JC-1 וTMRE היו בשימוש כדי להדגים שלילת קוטביות של קרום המיטוכונדריה 3 -5. לפיכך, אנו מבקשים ללמוד יותר על ההשפעה של המלט על תכונות הקשורות לממברנה אלה בpneumococcus כפי שאנו מתמקדים מאמצינולפתח הבנה טובה יותר של הרכיבים מכניסטית של פנוטיפ כמו אפופטוזיס, בחיידקים, עם פוטנציאל גדול לזיהוי טיפולי אנטיבקטריאלי רומן או מועמדי חיסון בתהליך. במבקש להקים פרוטוקולים עבור המחקרים מכניסטית שלנו, גילו כי בניגוד למתודולוגיה שתוארה היטב במערכות אוקריוטים, יש מעט מאוד מחקרים שפורסמו מפרטים מנגנוני אלקטרופיזיולוגיה והובלת יונים של 6,7 קרום החיידק. זו מיוחסת בעיקר לגודל הקטן יותר של מיקרואורגניזמים ואדריכלות פני השטח שלהם, ובמיוחד את נוכחותו של דופן תא, המגבילה את הנגישות של הקרום לשימוש בשיטות אוקריוטים קונבנציונליות כמו הידוק תיקון, אם כי כמה מחקרים באמצעות protoplasts הענק בוצעו בהצלחה מעורבת 8,9. ככל שעבודה עם protoplasts הענק אלה היא לא שיטה אידיאלית או אפילו מעשית עבור רוב מיני חיידקים שכן היא דורשת גברחיידקי ipulated במצב לא טבעי ואביוטי, המחקרים מוגבלים של קוטביות קרום חיידק שכבר בוצעו היו בעיקר מועסקים cytometry זרימה והשימוש בצבעי ניאון cyanine וoxonol 10-16. במקום cytometry זרימה, המרכזת את קריאות הקרינה בודדות מחיידק אחד בכל נקודת זמן אחת, בחרנו להשתמש בקורא צלחת גילוי הקרינה כדי לזהות עוצמת הקרינה של השעיות חיידקים בפורמט צלחת 96 היטב לאורך זמן. זה אפשר לנו לטיפול באוכלוסייה של חיידקים בנקודות זמן שונים בפשטות רבה יותר ולהקל, ולפקח באופן רציף קינטיקה הקרינה של האוכלוסייה כולה לפרקי זמן ארוכים, שקשה להשיג באמצעות cytometry זרימה. לאחר בדיקת מגוון רחב של הצבעים הפוטנציאליים רגישים ניאון (כוללים אלה שהוזכרו לעיל לשימוש עם מיטוכונדריה), השגנו ההצלחה הטכנית ומעשית הטובה ביותר באמצעותצבע bis-oxonol נקרא DiBAC 4 (3) (BIS-(oxonol חומצת 1,3-dibutylbarbituric) trimethine) כדי לעקוב אחר שינויים בקוטביות. מצאנו גם את זה חשוב כדי לפקח במקביל לשיבושים ביושרה של הקרום באמצעות יודיד propidium (PI). צבע זה מאיר על כריכה לחומצות גרעין, אבל הוא רק מסוגל לעשות זאת כאשר על שלמות קרום החיידק נפגעת, מה שהופך את המרכיב הפופולרי המשמש לגילוי תאים מתים במבחנים מכתים חיים מתים. בנוסף לPI, Sytox ירוק וTO-PRO-1 צבעי ניאון שדומים בפעולה וכבר שימשו בעבר לחיידקים בכמה מחקרים באמצעות cytometry זרימת שיטות זיהוי 17. אנחנו בחרנו להשתמש PI עקב גל העירור שלה, שאיפשר לנו לעקוב אחר הקרינה שלה במקביל לDiBAC במדגם נתון. במחקרים שלנו, יש לנו ציינו כי המלט, כמו גם אחר מורכבת חלבון שומנים בדם הקשורים לפעילות bactericidalהמכונה ELOA, שלילת קוטביות וקרע מושרה של קרום החיידק כפי שצוין על ידי עלייה בקרינה של שני הצבעים על הטיפול בpneumococci 3,18,26. עבור שני מתחמים, הבחין כי עוצמת הקרינה של DiBAC 4 (3) עלתה לפני העלייה בעוצמתו של צרכן, מצביע על כך ששלילת הקוטביות התרחשה לפני הקרע, והוא, אם כן, אירוע ספציפי הנגרם על ידי קומפלקסי חלבוני שומנים בדם bactericidal שלנו ריבית. הבחנה זו חשובה לעשות, כמו קרע של הקרום יכול לגרום לעצמו שלילת קוטביות לא ספציפית. קינטיקה (3) וקרינת PI מדידה וניתוח שני DiBAC 4 אפשרה במקביל לנו לבחון את הקשר הזה בין אירועי קרום שתיים, אשר מהווה יתרון נוסף של שימוש בfluorometry במקום cytometry זרימה. כדי לעקוב אחר שטף יון חיידקים, יש כבר כמה הצלחה קודמת עם שימוש ברדיואיזוטופים, כולל מדידת ספיגה של45 Ca 2 + בpneumococcus 19,20, שיש לנו גם שימוש במחקרים האחרונים שלנו 18, 21. עם זאת, יש בעבודה עם יונים רדיואקטיביים אלה יש כמה חסרונות. הם יכולים להיות יקרים, גוזלים זמן, ומבולגן, והוא יכול גם לחשוף את פרט ביצוע הניסוי כדי לפגוע, תלוי באיזוטופ של עניין. בנוסף, קשה לעקוב אחר שינויים מהירים לאורך זמן. לפיכך, פנינו לכיוון שיטה חלופית של מדידה שמעסיקה גרסאות אסתר acetoxymethyl (PM) של צבעי ניאון מחוון יון רגיש. על ידי עצמו, צבע המחוון טעון ואינו עובר דרך הממברנה בקלות, אבל עם התוספת של קבוצת אסתר lipophilic, המולקולה כעת בלתי טעונים יכולה לעבור דרך הממברנה של החיידק. עם כניסתו לפנים, esterases החיידקים לדבוק קבוצת אסתר, והשאיר את צבען חופשי בתוך התא והואשם שוב, להאט באופן משמעותי את יכולתה לצאת מהתא ומאפשר לא לצבועo מצטברת בתוך לאורך זמן. עם זאת, שימוש בצבעי אסתר אלה תוארו רק בכמה מיני חיידקים כדי לזהות שינויים בתאיים Ca 2 + 22-24 ו-H +16, עם שיטות שונות של העמסה, איתור, והצלחה. עם רצון לעקוב אחר שינויים בתאיים Ca 2 + וגם רמות K + ו-H + בס pneumoniae על טיפול עם המלט ותרכובות אחרות, יצרנו בהצלחה פרוטוקולים כדי לטעון צבעי ניאון מחוון ביעילות לתאי חיידקים. טעינה יעילה לחיידקים נדרשים שני פרובנציד שמגביר אצירת צבע על ידי חסימת אניון-מובילים וPowerLoad, מתחם קנייני מחיים טכנולוגיים שמגביר את יעילות טעינה. Fura-2/AM (גילוי Ca 2 +), PBFI / AM (גילוי K +), וBCECF / AM (גילוי + H) הועמסו בהצלחה לתוך st pneumococcal שני unencapsulated והמארזגשמים המאפשרים מדידה של דפוסי הקרינה וכתוצאה מכך לאחר תוספת של יונופורים, כגון ionomycin (Ca 2 + uncoupler), valinomycin (K + uncoupler) וCCCP (H + uncoupler) באמצעות צלחת גילוי הקרינה קורא 18, 21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="864">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Todd Hewitt</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">249240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5879</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:359px;">DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P4170</td>
			<td>Make up in deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PowerLoad</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P10020</td>
			<td>100X concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Probenecid</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P36400</td>
			<td>Make 100X stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Fura-2/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">F1221</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PBFI/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P1267</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nigericin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">3246-01</td>
			<td>monobasic</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">K2HPO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">4012-01</td>
			<td>dibasic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">NaOH</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">5565-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">BCECF/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B1170</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">CCCP</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm,</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;dissipating the electrical potential and the H+ gradient.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Culture tube&#160;</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">53283-802</td>
			<td>Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Spectronic 20D+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">15 ml plastic conical tube</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Clear 96-well polystyrene microtiter plate</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Plate reader</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Synergy 2 Multi-Mode&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:143px;">Microplate Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Gen5 software</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Gen5&#8482; Software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring changes in membrane polarity, membrane integrity, and intracellular ion concentrations in streptococcus pneumoniae using fluorescent dyes

נתיבי שלילת קוטביות קרום ויון הם אירועים שנחקרו רב במערכות ביולוגיות בשל היכולת שלהם להשפיע עמוקות תפקודים תאיים, כולל האנרגטיקה וtransductions אות. בעוד שני שיטות הניאון ואלקטרו, ובכלל זה שימוש אלקטרודת ותיקון-clamping, פותחו גם למדידת אירועים אלה בתאי אוקריוטים, מתודולוגיה למדידת אירועים דומים במיקרואורגניזמים הוכיחו יותר מאתגר כדי לפתח בהתחשב בגודל הקטן שלהם בשילוב עם יותר מורכב משטח חיצוני של חיידקי מיגון הממברנה. במהלך הלימודים של מוות חניכה בStreptococcus pneumoniae (pneumococcus) שלנו, אנחנו רוצים להבהיר את התפקיד של אירועי קרום, לרבות שינויים בקוטביות, יושרה, וריכוזי יון תאיים. חיפוש בספרות, מצאנו כי מעט מאוד מחקרים קיימים. חוקרים אחרים היו במעקב ספיגת radioisotope או שיווי משקל כדי למדוד שפעת יוןXES וקרום פוטנציאלי ומספר מצומצם של מחקרים, רובם באורגניזמים גראם שליליים, שראו הצלחה מסוימת באמצעות carbocyanine או oxonol צבעי ניאון למדידת פוטנציאל ממברנה, או טעינת חיידקים עם acetoxymethyl תא permeant (AM) גרסאות אסתר של יון רגיש צבעי ניאון מחוון. לפיכך, אנו הוקמו ומותאמים פרוטוקולים למדידת פוטנציאל ממברנה, קרע, ויוני תחבורה באורגניזם גראם החיובי ס דלקת ריאות. פיתחנו פרוטוקולים באמצעות צבע bis-oxonol DiBAC 4 (3) ויודיד propidium לצבוע תאי impermeant למדוד שלילת קוטביות קרום וקרע, בהתאמה, כמו גם שיטות לטעינה אופטימלית pneumococci עם אסטרים AM של צבעי ratiometric פורע-2, PBFI, וBCECF כדי לזהות שינויים בריכוזי תוך תאיים של Ca 2 +, K +, ו-H +, בהתאמה, באמצעות קורא צלחת הקרינה איתור. פרוטוקולים אלה הם הראשונים מסוגם לpneumococcusורוב הצבעים האלה לא היה בשימוש בכל מיני חיידקים אחרים. למרות שהפרוטוקולים שלנו כבר מותאמים לס pneumoniae, אנו מאמינים גישות אלו צריכות להוות נקודת התחלה מצוינת למחקרים דומים במינים חיידקים אחרים.

לכל הניסויים, יש דגימה אחת וקבוצה של תנאים נוכחים בכל טוב. לפיכך, כל עקיבה מייצגת את עוצמת הקרינה של אוכלוסייה שלמה של חיידקים לאורך זמן. התוצאות צריכה להיות לפרש בקלות, עם הבחנה ברורה בין הקרינה של דגימות מטופלים ושל בקרות שלא טופלו. קינטיקה ומידת שינוי שנצפה בקר...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes at JoVE.c

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

ניטור שינויים בממברנה קוטביות, ממברנה יושרה, וריכוזי יון תאיים ב<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; שימוש צבעי ניאון

שלא כמו שראה לאאוקריוטים, יש מיעוט מחקרים ששלילת קוטביות קרום פירוט וריכוז יונים שינויים בחיידקים, כגודלם הקטן בעיקר הופך את השיטות מקובלות של מדידה קשה. כאן, אנו פרוטוקולי פרט לניטור אירועים כאלה בפתוגן גראם חיובית המשמעותי Streptococcus pneumoniae תוך שימוש בטכניקות הקרינה.

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת<em&gt; כלמידיה</em&gt; חלולית דינמיקת צמיחה בתאים חיים

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

קופסית Serotyping של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; שימוש תגובת Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

קופסית Serotyping של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; על ידי לאטקס התלכדות

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

תיוג נוגדן עם צבעי ניאון באמצעות חלבון מגנטי חלבון G חרוזים

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

טיהור של קרום התא עבור הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה של אנטיגנים אקסוגני במצגת-קרוס

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Assay תיקון קרום התא באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים לייזר

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...