Name: monitoring changes in membrane polarity, membrane integrity, and intracellular ion concentrations in streptococcus pneumoniae using fluorescent dyes
Uploaded: 2014-02-17T22:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes at JoVE.c

이 작품은 빌과 멜린다 게이츠 재단 (보조금 53,085), JR Oishei 재단과 미국 폐 협회 (부여 RG-123721-N) APH, 그리고 EAC에 NIH (NIDCD) 화목 F31DC011218에 의해 지원되었다.

1. 세균 배양을 준비 <ol><li> 실험에 사용하기 위해 문화를 성장 <ol><li> 37 ° C에서 가열 블록에서 S.의 고정 된 주식 병을 녹여 폐렴과 신선한 9 ml의 내용을 추가, 유리 문화 튜브에 10 ㎖의 총 볼륨의 0.5 % 효모 추출물 (THY)와 토드 휴이트 국물을 데워진. </li><li> 문화가 중반 로그 단계 (상승률의 600 ㎚ ≈ 0.5 ~ 0.6)에 도달 할 때까지 37 ° C에서 정적으로 품어. </li></ol></...

<ol>
	<li>Hakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+induced+by+a+human+milk+protein.">Apoptosis induced by a human milk protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (17), 8064-8068 (1995).</li><li>Hakansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+folding+variant+of+alpha-lactalbumin+with+bactericidal+activity+against+Streptococcus+pneumoniae.">A folding variant of alpha-lactalbumin with bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae.</a> Mol. Microbiol. 35 (3), 589-600 (2000).</li><li>Hakansson, A. P., Roche-Hakansson, H., Mossberg, A. K., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-Like+Death+in+Bacteria+Induced+by+HAMLET,+a+Human+Milk+Lipid-Protein+Complex.">Apoptosis-Like Death in Bacteria Induced by HAMLET, a Human Milk Lipid-Protein Complex.</a> PLoS One. 6 (3), (2011).</li><li>Kohler, C., Gogvadze, V., Hakansson, A., Svanborg, C., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+folding+variant+of+human+alpha-lactalbumin+induces+mitochondrial+permeability+transition+in+isolated+mitochondria.">A folding variant of human alpha-lactalbumin induces mitochondrial permeability transition in isolated mitochondria.</a> Eur. J. Biochem. 268 (1), 186-191 (2001).</li><li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+membrane+potential+(&#916;&#968;+m)+in+apoptosis;+an+update.">The mitochondrial membrane potential (&#916;&#968; m) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8 (2), 115-128 (2003).</li><li>Dominguez, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+in+bacteria.">Calcium signalling in bacteria.</a> Mol. Microbiol. 54 (2), 291-297 (2004).</li><li>Corratge-Faillie, C., Jabnoune, M., Zimmermann, S., Very, A. A., Fizames, C., Sentenac, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+and+sodium+transport+in+non-animal+cells:+the+Trk/Ktr/HKT+transporter+family.">Potassium and sodium transport in non-animal cells: the Trk/Ktr/HKT transporter family.</a> Cell Mol. Life Sci. 67 (15), 2511-2532 (2010).</li><li>Szabo, I., Petronilli, V., Zoratti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+patch-clamp+study+of+Bacillus+subtilis.">A patch-clamp study of Bacillus subtilis.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1112 (1), 29-38 (1992).</li><li>Zoratti, M., Petronilli, V., Szabo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-activated+composite+ion+channels+in+Bacillus+subtilis.">Stretch-activated composite ion channels in Bacillus subtilis.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 168 (2), 443-450 (1990).</li><li>Novo, D., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+flow+cytometric+membrane+potential+measurement+in+bacteria+using+diethyloxacarbocyanine+and+a+ratiometric+technique.">Accurate flow cytometric membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique.</a> Cytometry. 35 (1), 55-63 (1999).</li><li>Novo, D. J., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+flow+cytometric+analysis+of+antibiotic+effects+on+membrane+potential,+membrane+permeability,+and+bacterial+counts+of+Staphylococcus+aureus+and+Micrococcus+luteus.">Multiparameter flow cytometric analysis of antibiotic effects on membrane potential, membrane permeability, and bacterial counts of Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 44 (4), 827-834 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+estimation+by+flow+cytometry.">Membrane potential estimation by flow cytometry.</a> Methods. 21 (3), 271-279 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+analysis+at+the+single-cell+level:+tasks+and+techniques.">Microbial analysis at the single-cell level: tasks and techniques.</a> J. Microbiol. Methods. 42 (1), 3-16 (2000).</li><li>Bashford, C. L., Chance, B., Smith, J. C., Yoshida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behavior+of+oxonol+dyes+in+phospholipid+dispersions.">The behavior of oxonol dyes in phospholipid dispersions.</a> Biophys. J. 25 (1), 63-85 (1979).</li><li>Suzuki, H., Wang, Z. -. Y., Yamakoshi, M., Kobayashi, M., Nozawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+transmembrane+potential+of+bacterial+cells+by+voltage-sensitive+dyes.">Probing the transmembrane potential of bacterial cells by voltage-sensitive dyes.</a> Anal. Sci. 19 (9), 1239-1242 (2003).</li><li>Breeuwer, P., Abee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+membrane+potential,+intracellular+pH+and+respiration+of+bacteria+employing+fluorescence+techniques.">Assessment of the membrane potential, intracellular pH and respiration of bacteria employing fluorescence techniques.</a> Mol. Microb. Ecol. Manual. 8, 1563-1580 (2004).</li><li>Mortimer, F. C., Mason, D. J., Gant, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+monitoring+of+antibiotic-induced+injury+in+Escherichia+coli+using+cell-impermeant+fluorescent+probes.">Flow cytometric monitoring of antibiotic-induced injury in Escherichia coli using cell-impermeant fluorescent probes.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 44 (3), 676-681 (2000).</li><li>Clementi, E. A., Marks, L. R., Duffey, M. E., Hakansson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Initiation+Mechanism+of+Death+in+Streptococcus+pneumoniae+Induced+by+the+Human+Milk+Protein-Lipid+Complex+HAMLET+and+Activated+during+Physiological+Death.">A Novel Initiation Mechanism of Death in Streptococcus pneumoniae Induced by the Human Milk Protein-Lipid Complex HAMLET and Activated during Physiological Death.</a> J. Biol. Chem. 287 (32), 27168-27182 (2012).</li><li>Trombe, M. C., Laneelle, G., Sicard, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Streptococcus+pneumoniae+mutant+with+altered+electric+transmembrane+potential.">Characterization of a Streptococcus pneumoniae mutant with altered electric transmembrane potential.</a> J. Bacteriol. 158 (3), 1109-1114 (1984).</li><li>Trombe, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+calcium+porter+of+Streptococcus+pneumoniae+involved+in+calcium+regulation+of+growth+and+competence.">Characterization of a calcium porter of Streptococcus pneumoniae involved in calcium regulation of growth and competence.</a> J. Gen. Microbiol. 139 (3), 433-439 (1993).</li><li>Marks, L. R., Clementi, E. A., Hakansson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitization+of+Staphylococcus+aureus+to+Methicillin+and+Other+Antibiotics+In+Vitro+and+In+Vivo+in+the+Presence+of+HAMLET.">Sensitization of Staphylococcus aureus to Methicillin and Other Antibiotics In Vitro and In Vivo in the Presence of HAMLET.</a> PLoS ONE. 8 (5), (2013).</li><li>Futsaether, C. M., Johnsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fura-2+to+measure+intracellular+free+calcium+in+Propionibacterium+acnes.">Using fura-2 to measure intracellular free calcium in Propionibacterium acnes.</a> Can. J. Microbiol. 40 (6), 439-445 (1994).</li><li>Tisa, L. S., Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+properties+of+Escherichia+coli+mutants+having+abnormal+Ca2++content.">Chemotactic properties of Escherichia coli mutants having abnormal Ca2+ content.</a> J. Bacteriol. 177 (24), 7112-7118 (1995).</li><li>Werthen, M., Lundgren, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++mobilization+and+kinase+activity+during+acylated+homoserine+lactone-dependent+quorum+sensing+in+Serratia+liquefaciens.">Intracellular Ca2+ mobilization and kinase activity during acylated homoserine lactone-dependent quorum sensing in Serratia liquefaciens.</a> J. Biol. Chem. 276 (9), 6468-6472 (2001).</li><li>Avery, O. T., MacLeod, C. M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types.+Induction+of+transformation+by+a+dexoxyribonuceic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III.">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a dexoxyribonuceic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J. Exp. Med. 79, 137-158 (1944).</li><li>Clementi, E. A., Wilhelm, K. R., Schleucher, J., Morozova-Roche, L. A., Hakansson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+of+Equine+Lysozyme+and+Oleic+Acid+with+Bactericidal+Activity+against.">A Complex of Equine Lysozyme and Oleic Acid with Bactericidal Activity against.</a> PLoS One. . 8, (2013).</li></ol>

크기 및 극성 막 및 박테리아 내 이온 농도의 변화의 무결성의 변화를 감지하는 전기 생리학 고전적인 방법을 사용하기 위해 제시 제한에도 불구하고, 우리는 S. 이러한 이벤트를 측정하는 방법을 설명했다 폐렴은 형광 염료를 사용. 우리의 프로토콜은 폐렴 구균 및 일반 세균 종에 대해 설명 된 몇 가지 중 하나에 대해 설명 자신의 종류의 첫번째이다. 형광 검출 플레이트 판독기를 ?...

우리 연구실은 종양 세포의 세포 사멸을 유도 (종양 세포에 치명적인 만든 인간의 알파 - 락트 알부민을위한) 햄릿이라는 인간의 우유에서 단백질 지질 복합체를 확인뿐만 아니라, 세균 종 1,2의 다양한 죽일 수있다. 특히 민감한 것으로 발견 된 종은 최대 감도와 죽음 2,3의 세포 사멸과 같은 표현형을 표시하는 폐렴 구균 (폐렴 구균)와 호흡 기관을 대상으로 그들이었다. 막 탈분극과 특정 이온 전송 이벤트는 잘 설명하고 방사성 TPP + 이온과 JC-1과 TMRE 등의 형광 염료는 미토콘드리아 막 3의 탈분극을 설명하는 데 사용 된 미토콘드리아, 특히 진핵 세포에서 세포 사멸 중에 중요한 이벤트 -5. 따라서, 우리는 우리가 우리의 노력을 집중으로 폐렴 구균 이러한 막 관련 기능에 햄릿의 효과에 대한 자세한 내용을 보려면 모색그 과정에서 새로운 항균 치료 또는 백신 후보를 식별하기위한 큰 잠재력을 가진 박테리아의 세포 사멸과 같은 표현형의 기계적 구성 요소의 더 나은 이해를 개발할 수 있습니다. 우리 역학적 연구를위한 프로토콜을 확립하고자, 우리는 진핵 시스템에서 잘 설명 된 방법론 달리 박테리아 막 6,7의 전기 생리학 및 이온 수송 메커니즘을 상세히 거의 발표 된 연구가 있다는 것을 발견했다. 이것은 주로 작은 미생물의 크기와 그 표면 구조, 거 원형질체를 사용하여 일부 연구는 혼합 성공적으로 수행되었지만 특히 칸막이 벽의 존재, 즉, 패치 클램프 같은 종래 진핵 방법의 사용을위한 멤브레인의 접근성을 제한에 기인 8,9. 그것은 사람을 필요로하기 때문에 이러한 거대한 원형질체와 작업은 대부분의 세균 종을위한 이상적인 또는 실용적인 방법이 아니므로ipulated 박테리아 부자연 및 비 생물 적 상태에서 수행 된 박테리아 막 극성의 한정된 연구는 주로 유세포 분석기를 사용하고 형광 시아닌 및 옥소 놀 염료의 사용은 10-16. 하나의 시점에 하나의 박테리아에서 개별 형광 판독 값을 수집하는, 유동 세포 계측법 대신에, 우리는 시간이 지남에 따라 96 - 웰 플레이트 형식으로 세균 현탁액의 형광 강도를 검출하는 형광 검출 플레이트 판독기를 사용하여 선택 하였다. 이것은 훨씬 더 단순 다양한 시점에서 박테리아의 인구를 치료하고 완화, 지속적으로 유동 세포 계측법 사용하여 달성하기 어려운 시간의 연장 기간에 전체 인구의 형광 반응 속도를 모니터링 할 수있었습니다. (미토콘드리아와 함께 사용하기 위해 상기 언급 된 것 등) 전위에 민감한 형광 염료의 다양한 테스트 후에, 우리가 사용하는 최상의 기술 및 실제 성공을 달성DiBAC 4라는 비스 - 옥소 놀 염료 (3) (비스 - (1,3 - dibutylbarbituric 산) trimethine의 옥소 놀) 극성의 변화를 모니터링 할 수 있습니다. 우리는 또한 귀중한 동시에 요오드화 프로피 듐 (PI)을 사용하여 멤브레인의 무결성을 모니터링하기 위해 중단되었다고. 이 염료는 핵산에 결합에 형광하지만, 세균 세포막의 무결성이 그 라이브 죽은 염색 분석에 죽은 세포를 감지하는 데 사용되는 인기있는 구성 요소 만들기, 손상되었을 때 그렇게 만 할 수 있습니다. PI 이외에, SYTOX 녹색과 TO-PRO-1 액션 유사하며, 이전에 검출 방법 17 유동 세포 계측법을 사용하여 몇 가지 연구에서 박테리아에 사용 된 형광 염료이다. 우리는 때문에 우리는 주어진 샘플에서 DiBAC과 동시에 자사의 형광을 모니터링 할 수는 여기 파장에 PI를 사용하기로 결정했습니다. 우리의 연구에서, 우리는 햄릿뿐만 아니라 살균 작용을 가진 다른 관련 단백질 - 지질 복합체를 관찰폐렴 구균 3,18,26의 치료시 두 염료의 형광의 증가로 표시된 바와 같이 세균 막 ELOA 유도 탈분극과 파열로 알려져 있습니다. 두 착물을 위해, 우리는 DiBAC (4)의 형광 강도 (3) 탈분극 파열 이전에 발생했음을 나타내는 전에 PI의 강도 증가로 증가하고 있음을 관찰 그러므로, 우리의 살균성 단백질 - 지질 복합체에 의해 유도 된 특정 이벤트 관심. 이 구별은 막의 파열 자체가 특이 탈분극을 일으킬 수 있도록하는 것이 중요합니다. DiBAC 4를 모두 측정 및 분석 (3) 및 PI 형광 반응 속도는 동시에 우리는 형광 측정을 사용하는 대신에 유동 세포 계측법의 추가 이점이 두 개의 막 이벤트 사이의 관계를 조사 할 수 있었다. 세균 이온 플럭스를 모니터링하기 위해,의 이해를 측정하는 등의 방사성 동위 원소를 사용하여 몇 가지 이전의 성공이 있었다45 카 우리는 또한 우리의 최근의 연구 (18), (21)에 사용한 폐렴 구균 19, 20, 2 +. 그러나 이러한 방사성 이온으로 작업하는 몇 가지 단점이 있습니다. 그들은 비용이 많이들 수 있습니다, 시간이 많이 소요하고, 지저분한, 또한 관심의 동위 원소에 따라, 해를 실험을 수행하는 개인을 노출 할 수 있습니다. 또한, 시간이 지남에 급격한 변화를 모니터하는 것은 곤란하다. 따라서, 우리는 이온 성 형광 표시기 염료의 아세 (AM) 에스테르 버전을 사용 측정하는 다른 방법을 향하고. 그 자체로, 지시 염료가 충전되어 쉽게 막을 통과하지 않지만, 친 유성 에스테르 기의 추가와 함께, 현재 대전 된 분자는 세균의 세포막을 통과 할 수있다. 내부에 들어 서면, 세균 에스 테라 제는 충전을 다시 크게 셀을 종료 할 수있는 능력을 둔화 및 허용 염료 T 세포 내부 무료 염료를 떠나, 에스테르 그룹을 절단하고O는 시간이 지남에 따라 내부에 축적된다. 그러나 이러한 에스테르 염료의 사용은로드, 감지, 성공의 다양한 방법으로, 세포 내 칼슘 2 + 22 ~ 24과 H + 16의 변화를 감지하는 몇 종의 박테리아에 설명되어 있습니다. 세포 내 칼슘의 변화를 모니터하는 욕망 2 +와 S.에도 K +와 H + 레벨 폐렴은 햄릿과 다른 화합물과 치료에, 우리는 성공적으로 효율적으로 박테리아 세포에 형광 표시기 염료를로드하는 프로토콜을 만들었습니다. 음이온 수송 및 PowerLoad, 적재 효율을 증가 생명 기술의 독점적 인 화합물을 차단하여 색소 보존을 증가 모두 프로 베네 시드를 요구 박테리아에 효과적인로드. (K +을 검출)은 fura-2/AM 중 (Ca 2 +을 검출), PBFI / AM, 및 BCECF / AM (H의 +를 검출)을 성공적으로 캡슐화 및 캡슐화 모두 폐렴 구균 성으로로드 된형광 검출 플레이트 리더 18, 21을 사용하여 (K + uncoupler)와 CCCP (H + uncoupler을) 발리 노마 이신 (Valinomycin) 등 이오 노마 이신 (칼슘 2 + uncoupler) 등 ionophores, 첨가 한 후, 그 결과 형광 패턴의 측정을 가능하게 비.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="864">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Todd Hewitt</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">249240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5879</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:359px;">DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P4170</td>
			<td>Make up in deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PowerLoad</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P10020</td>
			<td>100X concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Probenecid</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P36400</td>
			<td>Make 100X stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Fura-2/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">F1221</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PBFI/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P1267</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nigericin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">3246-01</td>
			<td>monobasic</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">K2HPO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">4012-01</td>
			<td>dibasic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">NaOH</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">5565-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">BCECF/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B1170</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">CCCP</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm,</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;dissipating the electrical potential and the H+ gradient.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Culture tube&#160;</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">53283-802</td>
			<td>Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Spectronic 20D+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">15 ml plastic conical tube</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Clear 96-well polystyrene microtiter plate</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Plate reader</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Synergy 2 Multi-Mode&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:143px;">Microplate Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Gen5 software</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Gen5&#8482; Software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring changes in membrane polarity, membrane integrity, and intracellular ion concentrations in streptococcus pneumoniae using fluorescent dyes

막 탈분극과 이온 플럭스로 인해 깊이 지학 및 신호 transductions 등의 세포 기능을 영향을 미칠 수있는 능력을 생물학적 시스템에서 광범위하게 연구 된 이벤트입니다. 전극 사용량 및 패치 클램프 등 모두 형광 및 전기 생리 방법은, 잘 진핵 세포에서 이러한 이벤트를 측정하기 위해 개발되었지만, 미생물의 유사 이벤트를 측정하기위한 방법은 더 복잡와 함께 그들의 작은 크기 관련 개발하기 위하여 도전 입증 멤브레인을 차폐 박테리아의 외면. 폐렴 구균 (폐렴 구균)의 죽음을 시작으로 우리의 연구 기간 동안, 우리는 극성의 변화, 무결성, 세포 내 이온 농도 등의 막 이벤트의 역할을 명료하게하고 싶었다. 문헌 검색, 우리는 거의 연구가 존재하는 것으로 나타났습니다. 다른 연구자들은 이온 독감을 측정하는 방사성 동위 원소의 흡수 또는 평형을 모니터링했다XES과 막 잠재력과 주로 그람 음성균에있는 연구의 제한된 수의, 막 전위를 측정하는 carbocyanine 또는 옥소 놀 형광 염료를 사용, 또는 (AM) 에스테르 버전 세포 투과 아세와 박테리아를로드하는 일부 성공을 볼 수 없었다 이온 성 형광 표시기 염료. 따라서 우리는 그람 양성 유기체 S.에서 막 전위, 파열, 이온 수송을 측정하기위한 프로토콜을 설립 최적화 폐렴. 우리의 방법이 최적의 비율 적 염료 AM 에스테르와 폐렴 구균을로드로 각각 막 탈분극 및 파열을 측정뿐만하는 비스 - 옥소 놀 염료 DiBAC 사 (3) 및 휴대 impermeant 염료 프로피 듐 요오다 이드를 사용하는 프로토콜을 개발 의 Fura-2, PBFI 및 BCECF은 형광 검출 플레이트 리더를 사용하여, 칼슘 2 +, K +, H +를 각각의 세포 내 농도의 변화를 검출한다. 이러한 프로토콜은 폐렴 구균에 대한 자신의 종류의 첫번째입니다이들 염료의 대부분은 다른 세균 종에 사용되지 않았다. 우리의 프로토콜은 S.에 최적화되어 있지만 폐렴, 우리는 이러한 접근 방식이 다른 종의 박테리아에서 유사한 연구를위한 훌륭한 출발점을 형성해야한다 생각합니다.

모든 실험의 경우, 하나의 샘플과 각각의 웰에 존재하는 조건의 집합이 있습니다. 따라서, 각각의 추적은 시간이 지남에 박테리아의 전체 인구의 형광 강도를 나타냅니다. 결과는 처리 샘플 및 치료 컨트롤의의 형광 사이에 명확한 구분으로, 쉽게 해석 할 수 있어야합니다. 형광의 관찰 된 변화의 속도론 및 정도는 모니터되는 이벤트의 가능한 메커니즘과 범위에 대한 정보를 제공 할 수 있...

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Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

진핵 생물에 본 것과 달리, 주로 작은 크기로 박테리아의 세부 막 탈분극 및 이온 농도 변화 측정 어려운 종래의 방법을 만드는 것이 연구의 소수가있다. 여기, 우리 형광 기술을 이용하여 중요한 그람 양성 병원균 폐렴 구균에 이러한 이벤트를 모니터링하기위한 세부 프로토콜.

막 극성, 멤브레인 무결성 및 세포 내 이온 농도의 모니터링 변경<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 형광 염료를 사용

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae</em유아 마우스에서>와 인플루엔자 바이러스

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

연구

면역학 및 감염병학

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

라이브 셀 이미징 바실러스 subtilis과 연쇄상 구균 pneumoniae 자동 시간 저속 현미경을 사용하여

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

시각화 및 정량하기 위해 형광 단백질을 사용하여<em&gt; 클라미디아</em&gt; 액포 성장 역학 살아있는 세포에서

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

의 캡슐 혈청 형<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; Quellung 반응을 이용하여

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

의 캡슐 혈청 형<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 라텍스 응집에 의해

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

형광 염료와 항체 라벨은 자기 단백질 A와 단백질 G 비즈를 사용하여

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

외 인 항 원 십자가-프레 젠 테이 션에의 바인딩과 그물 관련 성능 저하 막 구획의 정화

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

세포 막 복구 분석 결과 2 광자 레이저 현미경을 사용 하 여

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...