Name: preparation of hydroxy-paam hydrogels for decoupling the effects of mechanotransduction cues
Uploaded: 2014-08-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues at JoVE.com

This work was supported by the Belgian National Foundation for Scientific Research (F.R.S.-FNRS) through &#8220;MIS Confocal Microscopy&#8221;, &#8220;Cr&#233;dit aux Chercheurs&#8221; grants and the &#8220;Nanomotility FRFC project&#8221; (no. 2.4622.11). T.G. doctoral fellowship is supported by the Foundation for Training in Industrial and Agricultural Research (FRIA). The authors gratefully acknowledge Sylvain Desprez for mechanical characterization and G&#233;raldine Circelli for confocal imaging.

.1 הפעלת Surface של Coverslips הזכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips זכוכית מקום עגול (25 מ&quot;מ קוטר) בצלחת פטרי ולמרוח 0.1 פתרון M NaOH על זה במשך 5 דקות (מנדף הכימי המומלץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון NaOH ולטבול באופן מלא coverslips עם סטרילי DDH 2</sub...

<ol>
	<li>Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+route+to+functionalize+polyacrylamide+gels+for+the+independent+tuning+of+mechanotransduction+cues.">A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues.</a> Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).</li><li>Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Th&#233;odoly, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+investigation+reveals+distinct+roles+for+actin+cytoskeleton+and+myosin+II+activity+in+capillary+leukocyte+trafficking.">Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking.</a> Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).</li><li>Atmanli, A., Domian, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+aligned+functional+myocardial+tissue+through+microcontact+printing.">Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing.</a> J. Vis. Exp. (73), e50288 (2013).</li><li>Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Th&#233;odoly, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+microfluidic+method+to+select,+isolate,+and+manipulate+single-cells+in+mechanical+and+biochemical+assays.">A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays.</a> Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).</li><li>Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+control+of+nuclear+confinement+identifies+a+threshold+deformation+leading+to+lamina+rupture+and+induction+of+specific+genes.">Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes.</a> Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).</li><li>Rundqvist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fidelity+functional+patterns+of+an+extracellular+matrix+protein+by+electron+beam-based+inactivation.">High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).</li><li>Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+generation+of+proteins+micropatterns+for+neuron+culture+applications.">Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications.</a> Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).</li><li>Holden, M. A., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activated+patterning+of+dye-labeled+molecules+on+surfaces.">Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).</li><li>Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-assisted+surface+chemical+patterning+for+single-cell+culture.">Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture.</a> Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).</li><li>Kumar, A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+gold+having+micrometer+to+centimeter+dimensions+can+be+formed+through+a+combination+of+stamping+with+an+elastomeric+stamp+and+an+alkanethiol+"ink"+followed+by+chemical+etching.">Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol "ink" followed by chemical etching.</a> Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).</li><li>Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Polydimethylsiloxane+Substrates+with+Tunable+Elastic+Modulus+to+Study+Cell+Mechanobiology+in+Muscle+and+Nerve.">Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve.</a> PLoS ONE. 7, e51499 (2012).</li><li>Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-Phosphorylcholine+hydrogels+as+tunable+and+versatile+platforms+for+mechanobiology.">PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology.</a> Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).</li><li>Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+hydroxy-PAAm+hydrogels+and+sylgard+184+silicone+elastomers+with+tunable+elastic+moduli.">Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli.</a> Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+towards+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses.</a> Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).</li><li>Hemphill, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+possible+role+for+integrin+signaling+in+diffuse+axonal+injury.">A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22899 (2011).</li><li>Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamide+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays.">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays.</a> BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li><li>Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cell+growth+on+protein-functionalized+hydrogel+surfaces.">Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li><li>Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+coordination+between+cell+and+nuclear+shape+within+micropatterned+endothelial+cells.">Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells.</a> Nat. Commun. 3, 671 (2012).</li><li>Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Confinement:+Putting+the+squeeze+on+the+nucleus.">Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus.</a> Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).</li><li>Trappman, B., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+sense+extracellular+matrix+stiffness:+a+material's+perspective.">How cells sense extracellular matrix stiffness: a material's perspective.</a> Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).</li></ol>

רב בתצפיות מבחנה בביולוגיה של התא מודרני בוצעו על coverslips זכוכית הקשיח, לעתים קרובות מצופה בשכבה דקה של חלבוני ECM או פפטידים סינטטיים המכילים את רצף RGD. עם זאת, מצעי תרבות בסיסיים כגון לא לשחזר את כל מורכבות physicochemical של ECM ולכן אינם מספקים מודל מדויק ללימוד תהליכי mecha...

היבטים של microenvironment הסלולרי המקומי רבים (למשל, קשיחות, גודל נקבובית, טבע של חלבונים, או צפיפות תאים ליגנד) לספק קואורדינטות מוגדרות של רמזי רגולציה השולטים בתהליכים תאיים כגון תנועתיות, התפשטות תאים, התמיינות, וביטוי גנים. שינויים של מאפייני physicochemical של הסביבה תאית יכולים להיתפס על ידי תאים ולגרום להשלכות פיסיולוגיות שונות, כולל עיוות של קיטוב סלולארי, הגירה, ובידול. עדיין לא ברור, עם זאת, כיצד תאים לתרגם שינויי ECM לאותות ביוכימיים סלולריים. לכן חשיבות רבה למהנדס בשליטה בmicroenvironments מבחנה שיכולה לשכפל את יחסי הגומלין בין תאים וmicroenvironment ללימוד מסלולי mechanotransduction. כדי לטפל בבעיה זו, יש לנו לאחרונה הציג שיטה חדשה 1, הנקראת הידרוג-PAAm הידרוקסי, כדי ליצור שתי אגורה בקלותמטריצות nsional רכות המאפשרות לשלוט באופן עצמאי רמזי mechanotransduction חשובים: מטריצת קשיחות, גיאומטריה תא וכליאה, הטבע של החלבון וצפיפות תאים ליגנד. ECM מכוון את התהליכים תאיים באמצעות הדרגתיים בmorphogens (chemotaxis), חלבוני דבק (haptotaxis), וקשיחות (durotaxis). במהלך העשורים האחרונים, מתקדם בפלטפורמות מבחנה פותחו כדי לבודד רמזים תאיים הללו על מנת להקניט את הדרך בה התאים מסוגלים לתרגם תכונות ביוכימיות וbiophysical לתהליכים פיסיולוגיים 2-5. אלומת אלקטרונים 6, photolithography 7, קיבוע פוטו 8, או טכניקות סיוע פלזמה 9 פותחו כדי לכוון את הצמיחה של תאי חיים על מצעי micropatterned. למרות שהטכניקות אלה הניבו תוצאות חשובות, רובם אינו מאפשרים אפליה בין ההשפעה הפרטנית של רמזים שונים על התנהגות תאוהם דורשים מתקנים טכניים שכמה מעבדות יכולות להרשות לעצמו. בין הטכניקות הללו, הדפסת microcontact (μCP), התפתחה כשיטת חזקה ונגישה ליצירת מיקרו איי תא מודבק 10. לאחרונה, מאמצים נרחבים 11-14 נעשה כדי לפתח μCP על הידרוג&#39;ל עם קשיחויות מתכונן כדי לשחזר את מגוון הרחב של קשיחויות שנצפו ברקמות חיות. בין יצירות אלה, polyacrylamide (PAAm) הפך פופולרי 15 והוא כבר אחד המטריצות המבוסס על פולימר הנפוץ ביותר עבור מבחני ביומכניקה התא. משטחי PAAm הם פונקציונליות בדרך כלל עם מקשר הצולב heterobifunctional החלבונים sulfosuccinimidyl-6 N [4&#39;-azido-2&#39;-nitrophenylamido] (sulfo-SANPAH) וECM צמודים למשטח על ידי הפעלת UV של nitrophenyl sulfo-SANPAH קבוצות אזיד 16. טכניקה נוספת מורכבת בהידרזין צימוד לחלבונים שעברו חמצון קשהעם periodate 17. Hynd ועמיתים לעבודה הציגו טכניקה עבור דפוסי משטחי הידרוג&#39;ל biomimetic עם חלבון ופפטידים הדורשת photopolymerization בנוכחות של מונומר acroyl-streptavidin 18. לאחרונה, Tseng et al. דיווחו שיטה חדשה micropatterning 19 מבוססים על חשיפה לקרינת UV עמוקה של PAAm דרך מסכת קוורץ אופטית הדורשת לדגירת ג&#39;לי הרשות הפלסטינית מופעל עם 1-אתיל-3 [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) ופתרונות N-hydroxysuccinimide (NHS) מים לפני להוסיף את החלבון. למרות היכולת של טכניקות אלה כדי ליצור micropatterns חלבונים הומוגנית ושחזור, רובם סובלים מגבלות עיקריות: תהליכי סינתזה ארוכה (למשל, דיאליזה, lyophilization, וכו &#39;), תרכובות כימיות יקרות (למשל, חומצה היאלורונית, sulfo-SANPAH) UV עמוק או הקרנה. בנוסף, טכניקות אלה אינן מאפשרות אפנון עצמאי של קשיחות מצע, micropatternגיאומטריה, טבע חלבון ECM, וצפיפות תאים ליגנד. לוקח מגבלות אלה בחשבון, שפיתחנו גישה המבוססת על acrylamide רומן ופשוט, המאפשרת קיבוע של מגוון רחב של חלבונים ומולקולות ביולוגיים על הידרוג רך ומאפשרת כוונון עצמאי של רמזי mechanotransduction כדי לפענח את תפקידם על תפקודים תאיים. במקום לטפל הידרוג PAAm עם תרכובות כימיות קשות, אנחנו מציגים מונומר acrylamide מסחרי עם קבוצות הידרוקסיל במהלך פילמור PAAm. פעולה פשוטה זו מתגברת על הרכוש אנטי דבק הפנימי של הידרוג PAAm ללא כל דרישות טכניות אחרות. הנוכחות של קבוצות הידרוקסיל מובילה לזיקה גבוהה של הידרוג-PAAm הידרוקסי לחלבונים ומולקולות ביולוגיים היוצרים אינטראקציות מימן מליטה. בשילוב עם μCP, הידרוג-PAAm הידרוקסי לאפשר דור מהיר של פלטפורמת התרבות דו ממדים עם שליטה עצמאיתעל קשיחות מטריצה, סוג של חלבוני ECM, צפיפות תאים ליגנד ודביקות מוגבלת, אשר חזתה להיות פלטפורמה רבת עוצמה ללימוד mechanotransduction. מטרת פרוטוקול זה היא לספק את המידע הדרוש בקלות מה שהופך את הידרוג-PAAm הידרוקסי ללא מומחיות כלשהי במדעי חומר. המטרה הסופית היא לספק אמצעים לחוקרים לשאול שאלות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית ברמה התאית ורקמות שעשויות להוביל להבנה טובה יותר של מסלולי mechanotransduction המעורבים במנגנוני pathophysiological.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">UV/Ozone Photoreactor</td>
			<td style="width:71px;">Ultra-Violet Products</td>
			<td style="width:119px;">Model PR-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Rocking plate</td>
			<td style="width:71px;">IKAcWerke</td>
			<td style="width:119px;">Model KS 130 Basic</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Vortexer</td>
			<td style="width:71px;">Scientific Industries</td>
			<td style="width:119px;">Model Vortex Genie2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Vacuum degassing chamber</td>
			<td style="width:71px;">Applied Vacuum Engineering</td>
			<td style="width:119px;">DP- 8-KIT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Stainless steel forceps with fine tip</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z225304-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Dressing tissue forceps</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F4392-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Petri dishes in polystyrene</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5731-500EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Aluminium foil, thickness 0.5&#160;mm</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">266574-3.4G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Isopore membrane filter (0,2 &#181;m pore size)</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">GTTP Filter code</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Round glass coverslip (22 mm diameter)</td>
			<td style="width:71px;">Neuvitro</td>
			<td style="width:119px;">GG-22</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Round glass coverslip (25 mm diameter)</td>
			<td style="width:71px;">Neuvitro</td>
			<td style="width:119px;">GG-25</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Variable volume micropipette</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z114820</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Protein microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z666505-100EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Scalpel handles</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2896-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2771-100EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Cell culture flasks (75 cm2)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS430641</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z613983-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Polydimethylsiloxane&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Acrylamide (powder)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3553</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">N,N&#8217;-Methylenebis(acrylamide)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">146072</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">N-Hydroxyethylacrylamide</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">697931</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9281</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Amonium PerSulfate (APS)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3678</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">1805</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Human Plasma Fibronectin</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">FC010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Laminin from EHS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L2020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sodium hydroxyde</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">221465-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Double-distilled water (ddH2O)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Endothelial cell growth medium</td>
			<td style="width:71px;">Cells Applications</td>
			<td style="width:119px;">211K-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C-003-5C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Accutase</td>
			<td style="width:71px;">PAA laboratories</td>
			<td style="width:119px;">L11-007</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">HEPES buffer solution 1M in H20</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83264-500ML-F</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Antibiotics-antimycotics</td>
			<td style="width:71px;">PAA laboratories</td>
			<td style="width:119px;">P11-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Phosphate Buffer Saline solution</td>
			<td style="width:71px;">PAA laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H15-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Phaloidin</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-vinculin antibody produced in mouse</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">V9131</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">T-2762</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Fibronectin</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">F3648</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">(rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">41469</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Laminin antibody</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">L9393</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">(rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-rabbit IgG-FITC</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7512</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3924-100ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459844-2.5L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of hydroxy-paam hydrogels for decoupling the effects of mechanotransduction cues

עכשיו זה גם נקבע כי רב תפקודים תאיים מוסדרים על ידי יחסי גומלין של תאים עם רמזי physicochemical ומכאניים של סביבתם מטריצת חוץ תאית (ECM). תאים האיקריוטים לחוש כל הזמן microenvironment המקומי שלהם באמצעות mechanosensors משטח כדי transduce שינויים פיזיים של ECM לאותות ביוכימיים, ולשלב את האותות האלה להשגת שינויים ספציפיים בביטוי גנים. מעניין, פרמטרים physicochemical ומכאניים של בני הזוג יכול ECM אחד עם השני כדי להסדיר את גורל תא. לכן, מפתח להבנת mechanotransduction הוא לנתק את תרומתו היחסית של רמזי ECM על תפקודים תאיים. כאן אנו מציגים פרוטוקול ניסוי מפורט במהירות ובקלות ליצור הידרוג רלוונטי מבחינה ביולוגית לכוונון העצמאי של רמזי mechanotransduction במבחנה. אנו הידרוג polyacrylamide שינוי כימי (PAAm) להתגבר באופן מהותי שאינו adhesive נכסים על ידי שילוב מונומרים acrylamide-פונקציונליות הידרוקסיל במהלך פילמור. השגנו הידרוג&#39;ל רומן PAAm, נקרא הידרוקסי-PAAm, המאפשר קיבוע מכל הסוג רצוי של חלבוני ECM. שילוב של הידרוקסי-PAAm הידרוג עם הדפסת microcontact מאפשרת לשלוט באופן עצמאי את המורפולוגיה של תאים בודדים, נוקשות המטריצה, הטבע והצפיפות של חלבוני ECM. אנו מספקים שיטה פשוטה ומהירה שניתן להגדיר בכל מעבדת ביולוגיה ללמוד בתהליכי mechanotransduction תא מבחנה. אנו מאשרים הרומן הזה פלטפורמה דו ממדים על ידי ביצוע ניסויים על תאי האנדותל המדגימים צימוד מכאני בין נוקשות ECM והגרעין.

איור 1 א מציג את שיתוף פילמור של acrylamide (AAM) וbisacrylamide (bis-עאם) עם N-hydroxyethylacrylamide מונומרים (HEA) המכילים הידרוקסיל עיקרי שהוקם על ידי פילמור הרדיקלי האקראי רשת הידרופילי של polyacrylamide עם קבוצות הידרוקסיל משובצות (הידרוקסי-PAAm) . בפרוטוקול זה, מ&quot;ג משקל 65 של חימום חייב להי...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues at JoVE.com

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

אנו מציגים הידרוג&#39;ל חדש polyacrylamide, נקרא הידרוקסי-PAAm, המאפשר ישיר מחייב של חלבוני ECM עם עלות או מומחיות מינימאלית. שילוב של הידרוקסי-PAAm הידרוג עם הדפסת microcontact מאפשרת שליטה עצמאית של רמזים רבים של microenvironment התא הטבעי ללימוד mechanostransduction הסלולרי.

הכנת הידרוקסי-PAAm הידרוג לצימוד האפקטים של רמזי mechanotransduction

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

אקסון צמיחה מתיחה: Mechanotransduction הצמיחה העצבית

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

מערכת ניסיונית ללמוד Mechanotransduction ב לתאי ריאה עוברית

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

חלבון נמוך מולקולרית משקל העשרה על סרטים סיליקה mesoporous דק גילוי סמן ביולוגי

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

הסינתזה של RGD פונקציונלית הידרוג ככלי יישומים טיפוליים

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

אור בתיווך גיבוש דפוסים של הידרוג עבור יישומי תרבית תאים

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

סינתזה של הידרוג עם מאפייני Antifouling ופלטות לטיהור מים

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

הייצור של חלבון כמו אלסטין Hydrogels כימוס, Immunostaining של תאים ב- 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

מדידת הסלולר העולמי מטריקס מטאלו-פרוטאינאז ופעילות מטבולית Hydrogels תלת-ממד

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...