Name: an improved method for the preparation of type i collagen from skin
Uploaded: 2014-01-21T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin at JoVE.com

وأيد هذا العمل من خلال منحة بحثية من المعاهد الوطنية للصحة (HL068915 إلى DBC)، وجائزة الباحث جديد من صندوق البحوث الدراسه (لCAP)، منحة في والمساعدات من جمعية القلب الأمريكية (12GRNT11910008 إلى DBC) ، منحة بحثية من مؤسسة القلب للأطفال (لDBC)، والتبرعات لمستشفى صندوق الأطفال في بوسطن القلب التوصيل، والوقف ريان الأسرة، وديفيد بولمان.

هنا سوف علينا أن نظهر عزلة COL1 من الجلد الضأن. كما هو مكتوب، وهذا البروتوكول يمكن أن تستخدم أيضا لعزل بنجاح COL1 من الأرانب وجلد الإنسان. 1. إعداد الجلدية عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن جميع الكواشف إلى 4...

<ol>
	<li>Nageotte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coagulation+fibrillaire+in+vitro+du+collag&#232;ne+dissous+dans+un+acide+dilu&#233;.">Coagulation fibrillaire in vitro du collag&#232;ne dissous dans un acide dilu&#233;.</a> CR hebd. s&#233;ances Acad. Sei. 184, 115 (1927).</li><li>Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+investigation+of+the+structure+of+collagen.">Electron microscope investigation of the structure of collagen.</a> J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).</li><li>Choi, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+conduction+through+engineered+tissue.">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am. J. Pathol. 169, 72-85 (2006).</li><li>Pacak, C. A., Cowan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+myogenic+engineered+tissue+constructs.">Fabrication of myogenic engineered tissue constructs.</a> J. Vis. Exp. (27), (2009).</li><li>Cliche, S., Amiot, J., Avezard, C., Gariepy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+characterization+of+collagen+with+or+without+telopeptides+from+chicken+skin.">Extraction and characterization of collagen with or without telopeptides from chicken skin.</a> Poultry Sci. 82, 503-509 (2003).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use,+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications.">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).</li><li>Seifter, S., Gallop, P., Colowick, S., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+properties+of+soluble+collagens.">Preparation and properties of soluble collagens.</a> Methods in Enzymology. , (1963).</li><li>Pacak, C. A., Powers, J. M., Cowan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrarapid+purification+of+collagen+type+I+for+tissue+engineering+applications.">Ultrarapid purification of collagen type I for tissue engineering applications.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 879-885 (2011).</li><li>Ohan, M. P., Dunn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+stabilizes+collagen+sterilized+with+gamma+irradiation.">Glucose stabilizes collagen sterilized with gamma irradiation.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1188-1195 (2003).</li><li>Tyan, Y. C., Liao, J. D., Lin, S. P., Chen, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+the+sterilization+effect+of+gamma+ray+irradiation+of+immobilized+collagen+polypropylene+nonwoven+fabric+surfaces.">The study of the sterilization effect of gamma ray irradiation of immobilized collagen polypropylene nonwoven fabric surfaces.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1033-1043 (2003).</li><li>Ber, S., Torun Kose, G., Hasirci, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+tissue+engineering+on+patterned+collagen+films:+an+in+vitro+study.">Bone tissue engineering on patterned collagen films: an in vitro study.</a> Biomaterials. 26, 1977-1986 (2005).</li><li>Liu, Y., Sun, S., Singha, S., Cho, M. R., Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+femtosecond+laser+patterning+of+collagen+for+directed+cell+attachment.">3-D femtosecond laser patterning of collagen for directed cell attachment.</a> Biomaterials. 26, 4597-4605 (2005).</li><li>Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vascular+smooth+muscle+cells+by+micropatterning.">Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 883-890 (2003).</li><li>Leighton, J., Justh, G., Esper, M., Kronenthal, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-coated+cellulose+sponge:+three+dimensional+matrix+for+tissue+culture+of+Walker+tumor+256.">Collagen-coated cellulose sponge: three dimensional matrix for tissue culture of Walker tumor 256.</a> Science. 155, 1259-1261 (1967).</li></ol>

وثمة عنصر حاسم لهذا الأسلوب هو ضغط كفاءة المتكررة من العينة عن طريق الجلد لإزالة السائل الزائد. فمن الأهمية بمكان لإزالة أكبر قدر ممكن خلات الصوديوم في الخطوة 2.5 عن طريق ضغط العينة. نستخدم ملعقة ضغط الجلد ضد الجانب من الأنبوب، ولكن يمكن أن تستخدم أيضا القماش القطني، ع...

على مدى عقود، وقد عزل الباحثون والباعة التجارية solubilized COL1 من مجموعة متنوعة من المصادر بما في ذلك الجلد والأنسجة وتر استخدام بعض الاختلاف من بروتوكول استخلاص الحمض بسيطة تليها تحييد، مما يؤدي الى إعادة تعليق من مصفوفة من الألياف COL1 المنظمة التي يمكن استخدامها لعدد وافر من التطبيقات الطبية الحيوية 1-4. في حين أن هناك العديد من الأمثلة على التطبيقات السريرية لCOL1، عدد قليل من هذه توظف COL1 المستمدة autologously لأن إعداد هذا البروتين يتطلب قلع مطولة مع الأخذ أيام أو أسابيع لأداء 5-7. ونتيجة لذلك، والمحققين البحوث والأطباء عموما استخدام، المستحضرات التجارية باهظة الثمن من COL1 التي يتم إعدادها باستخدام الأنسجة غير البشرية مثل الفئران والأبقار، أو أدمة الخنازير أو باستخدام إزالة الجثث من الجلد أو بعد ختان الذكور. للتطبيقات التجدد، وكثير من هذه المنتجات المعرض التباين فيما يتعلق قدرتها على تشكيل الصلبةمصفوفات أو يبني الأنسجة قادرة على دعم مرفق الخلية والنمو. وبالتالي، هناك حاجة واضحة لطريقة موحدة جديدة مصممة لاستخراج بسرعة COL1 من مصادر الأنسجة ذاتي الوصول إليها وفيرة. أن مثل هذا الأسلوب توفير الوقت والمال في إعداد البحوث التي يمكن استخراجها COL1 من نموذج حيواني من الفائدة وتستخدم لاختبار قبل السريرية الأنسجة المهندسة وتجميعها على السقالات القائمة على الكولاجين. في الوقت نفسه، فإن وجود خيار استخدام معزولة بسرعة، COL1 المستمدة autologously في العيادة زيادة السلامة العامة للمرضى من شأنها أن تلقي خلاف ذلك خيفي أو مستحضرات أعضاء غير بشرية. للمرضى الذين يتلقون استعدادا ذاتي المنشأ، فإن هذا الأسلوب مبسطة يقلل كثيرا من الفاصل الزمني بين جمع خزعة وتطبيق الكولاجين. لهذه الأسباب، سعينا لتحسين بناء على COL1 العزلة وتنقية الأسلوب الراسخة باستخدام عالية السرعة AGitation والحجم الاستبعاد الطرد المركزي. هذه طريقة بسيطة لأداء باستخدام مخازن القياسية والمعدات الموجودة في العديد من المختبرات. من خلال توظيف عالية السرعة والإثارة، لدينا بروتوكول يقلل من الوقت اللازم لعزل القابلة للذوبان، الجلد COL1 من ما يقرب من 10 يوما إلى أقل من 3 ساعة 8. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب لا يمكن أن يؤديها بسهولة في الإعداد السريرية من أجل إعداد COL1 المستمدة autologously للاستخدام في المرضى خلال مجموعة واحدة من الإجراءات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">FastPrep-24 System</td>
			<td style="width:136px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:147px;">116004500</td>
			<td style="width:139px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:123px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:136px;">Beckman</td>
			<td style="width:147px;">J6-MI</td>
			<td style="width:139px;">Swing bucket rotor to accommodate 50 mL conical tubes at 3200 g.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method for the preparation of type i collagen from skin

ويستخدم نوع قابل للذوبان 1 الكولاجين (COL1) على نطاق واسع باعتبارها الركيزة لاصقة لمزارع الخلايا وكما سقالة الخلوية للتطبيقات التجدد. سريريا، ويستخدم على نطاق واسع هذا البروتين للجراحة التجميلية، والحقن الجلدية، تطعيم العظام، والجراحة الترميمية. مصادر COL1 لهذه الإجراءات هي غير البشرية عادة، مما يزيد من احتمال التهاب والرفض وكذلك انتقال المرض أجنبي بيولوجيا. في ضوء ذلك، فإن الأسلوب بكفاءة وبسرعة تنقية COL1 من كميات محدودة من أنسجة مستمدة autologously-تحايل العديد من هذه القضايا، ولكن العزلة البروتوكولات القياسية هي طويلة وتتطلب كميات كبيرة من الأنسجة كولاجيني كثير من الأحيان. هنا، علينا أن نظهر طريقة استخراج COL1 فعالة أن يقلل من الوقت اللازم لعزل وتنقية هذا البروتين من حوالي 10 أيام إلى أقل من 3 في الساعة. اخترنا الأدمة كمصدر الأنسجة لدينا بسبب توافره خلال العديد من الإجراءات الجراحية. Tيستخدم طريقته مخازن استخراج التقليدية جنبا إلى جنب مع الانفعالات قوية والترشيح الطرد المركزي للحصول على درجة عالية من محض، قابل للذوبان COL1 من كميات صغيرة من أدمة. لفترة وجيزة، يتم غسلها الخزعات الجلدية تماما في DH الجليد الباردة 2 O بعد إزالة الدهون، والنسيج الضام، والشعر. يتم تجريد عينات الجلد من البروتينات والسكريات غير كولاجيني باستخدام 0.5 M خلات الصوديوم وسرعة عالية مقعد بين كبار الخالط. يتم استخراج الكولاجين من المواد الصلبة المتبقية في وقت لاحق مع 0.075 M الصوديوم العازلة سيترات باستخدام الخالط. يتم تنقية هذه المقتطفات باستخدام 100،000 ميغاواط وقف انتاج المواد الانشطارية مرشحات الطرد المركزي التي تحقق الاستعدادات COL1 من نوعية مماثلة أو متفوقة على المنتجات التجارية أو تلك التي تم الحصول عليها باستخدام إجراءات التقليدية. نتوقع أن هذه الطريقة تسهل استخدام المستمدة autologously-COL1 للعديد من البحوث والتطبيقات السريرية.

هذا البروتوكول العزلة COL1 يتطلب حوالي 2 ساعة و 15 دقيقة لإكمال. ويبين الشكل 1 رسما تخطيطيا يحدد الخطوات الرئيسية في هذا الإجراء. إعداد العينة وتنفيذ 7 دورات من الثورات عالية السرعة ويشطف مع خلات الصوديوم يستغرق حوالي 35 دقيقة (أرقام 1A-C). أداء التحريض واحدة وشطف دو...

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin at JoVE.com

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

طريقة محسنة لإعداد النوع الأول الكولاجين من الجلد

تتطلب الإجراءات التقليدية لعزل نوع قابل للذوبان 1 الكولاجين (COL1) حوالي 10 يوما من البداية الى النهاية بسبب حضانات عازلة طويلة وشاقة resuspensions من الألياف. هنا، نحن تصف وسيلة لتنقية COL1 الخزعات الجلدية الصغيرة في أقل من 3 دقائق.

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

عضوي النمط I الكولاجين الفحص: A منهاج طيع لتقييم سلوك الخلية في سياق الأبعاد 3-

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

بناء هيدروجيل الكولاجين لتسليم الشيتوزان الجذعية المجهرية الخلية محملة

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

ثابت الطريقة النتوء الضغط التي تسيطر عليها لإعداد الحويصلات الدهن نانو الحجم

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

تحسين طريقة لإعداد القائم على الخليوي، الاتصال نموذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

التصوير مبدل طبيعة الكولاجين السواحل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; و<em&gt; خارج الحي</em&gt; عن طريق التهجين أثار صور من المحاكاة محبوس الكولاجين الببتيدات

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

An Improved Mechanical Testing Method to Assess Bone-implant Anchorage

لتحسين طرق الاختبارات الميكانيكية لتقييم العظم زرع مرسى

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

الهندسة 3D Cellularized الهلام الكولاجين لتجديد الأنسجة الوعائية

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

الأنسجة المفروم في المضغوط الكولاجين: وBiotransplant التي تحتوي على خلية لإصلاح الترميمية نظموا وحيد

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

إعداد 3D الهلام الكولاجين وMicrochannels لدراسة التفاعلات 3D<em&gt; في فيفو</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

تقييم انتشار Keratinocyte على عمليات ثنائية وثلاثية الأبعاد في النوع الأول من ركائز الكولاجين

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...