Name: an improved method for the preparation of type i collagen from skin
Uploaded: 2014-01-21T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af en forskningsbevilling fra National Institutes of Health (HL068915 til DBC), en ny forsker Award fra Thrasher Research Fund (til den fælles landbrugspolitik), en Grant-in-Aid fra American Heart Association (12GRNT11910008 til DBC) , en forskningsbevilling fra Børns Heart Foundation (til DBC), og donationer til Boston Børnehospital hjerteledningen fonden, Ryan Family Endowment, og af David Pullman.

Her vil vi vise isolering af Kol1 fra lammeskind. Som skrevet, kan protokollen også anvendes med succes isolere Kol1 fra kanin og menneskehud. 1.. Forbered Dermal Sample <ol><li> Ækvilibrer alle reagenser til 4 ° C før brug. </li><li> Skyl huden prøve (25-50 g) i iskoldt dH2O og fjerne enhver uld, pels eller hår med hårfjerningsmiddel. </li><li> Brug et enkelt barberblad til at skrabe prøven fri for bindevæv og fedt. </li><li> Skyl prøven i iskold dH 2 O. </...

<ol>
	<li>Nageotte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coagulation+fibrillaire+in+vitro+du+collag&#232;ne+dissous+dans+un+acide+dilu&#233;.">Coagulation fibrillaire in vitro du collag&#232;ne dissous dans un acide dilu&#233;.</a> CR hebd. s&#233;ances Acad. Sei. 184, 115 (1927).</li><li>Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+investigation+of+the+structure+of+collagen.">Electron microscope investigation of the structure of collagen.</a> J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).</li><li>Choi, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+conduction+through+engineered+tissue.">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am. J. Pathol. 169, 72-85 (2006).</li><li>Pacak, C. A., Cowan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+myogenic+engineered+tissue+constructs.">Fabrication of myogenic engineered tissue constructs.</a> J. Vis. Exp. (27), (2009).</li><li>Cliche, S., Amiot, J., Avezard, C., Gariepy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+characterization+of+collagen+with+or+without+telopeptides+from+chicken+skin.">Extraction and characterization of collagen with or without telopeptides from chicken skin.</a> Poultry Sci. 82, 503-509 (2003).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use,+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications.">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).</li><li>Seifter, S., Gallop, P., Colowick, S., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+properties+of+soluble+collagens.">Preparation and properties of soluble collagens.</a> Methods in Enzymology. , (1963).</li><li>Pacak, C. A., Powers, J. M., Cowan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrarapid+purification+of+collagen+type+I+for+tissue+engineering+applications.">Ultrarapid purification of collagen type I for tissue engineering applications.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 879-885 (2011).</li><li>Ohan, M. P., Dunn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+stabilizes+collagen+sterilized+with+gamma+irradiation.">Glucose stabilizes collagen sterilized with gamma irradiation.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1188-1195 (2003).</li><li>Tyan, Y. C., Liao, J. D., Lin, S. P., Chen, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+the+sterilization+effect+of+gamma+ray+irradiation+of+immobilized+collagen+polypropylene+nonwoven+fabric+surfaces.">The study of the sterilization effect of gamma ray irradiation of immobilized collagen polypropylene nonwoven fabric surfaces.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1033-1043 (2003).</li><li>Ber, S., Torun Kose, G., Hasirci, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+tissue+engineering+on+patterned+collagen+films:+an+in+vitro+study.">Bone tissue engineering on patterned collagen films: an in vitro study.</a> Biomaterials. 26, 1977-1986 (2005).</li><li>Liu, Y., Sun, S., Singha, S., Cho, M. R., Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+femtosecond+laser+patterning+of+collagen+for+directed+cell+attachment.">3-D femtosecond laser patterning of collagen for directed cell attachment.</a> Biomaterials. 26, 4597-4605 (2005).</li><li>Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vascular+smooth+muscle+cells+by+micropatterning.">Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 883-890 (2003).</li><li>Leighton, J., Justh, G., Esper, M., Kronenthal, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-coated+cellulose+sponge:+three+dimensional+matrix+for+tissue+culture+of+Walker+tumor+256.">Collagen-coated cellulose sponge: three dimensional matrix for tissue culture of Walker tumor 256.</a> Science. 155, 1259-1261 (1967).</li></ol>

Et afgørende element ved denne metode er den gentagne effektiv komprimering af dermal prøven for at fjerne overskydende væske. Det er vigtigt at fjerne så meget natriumacetat som muligt i trin 2.5 ved at komprimere prøven. Vi bruger en spatel til at komprimere huden mod siden af ​​røret, men kunne ostelærred også anvendes, selv om dette ville nødvendiggøre fjernelse af prøven fra røret og øge den tid, der kræves for at udføre disse trin. Ligeledes er det vigtigt at komprimere prøven i trin 3.1, såle...

I årtier har forskere og kommercielle leverandører isoleret solubiliseret Kol1 fra et sortiment vævskilder herunder hud og sener ved hjælp af en variant af en simpel syreekstraktionsmetode protokol efterfulgt af neutralisering, hvilket resulterer i en genopslæmning af en matrix af organiserede Kol1 fibriller, der kan anvendes til en lang række biomedicinske anvendelser 1-4. Mens der er mange eksempler på kliniske applikationer til Kol1, få af disse beskæftiger autologt afledt col1 fordi forberedelsen af dette protein kræver langvarige ekstraktioner tage dage eller uger at udføre 5-7. Som et resultat, forskning efterforskere og læger generelt bruge dyre kommercielle præparater af Kol1, der er udarbejdet ved hjælp af ikke-menneskelige væv såsom rotter, kvæg eller svin læderhuden eller ved hjælp af hud fjernes fra døde dyr eller efter mandlig omskæring. For regenerativ applikationer, mange af disse produkter udviser variation med hensyn til deres evne til at danne fastmatricer eller vævskonstruktioner kan understøtte cellebinding og vækst. Derfor er der et udtalt behov for en ny standardiseret metode designet til hurtigt at udtrække Kol1 fra tilgængelige og rigelige autologe væv kilder. En sådan metode ville spare både tid og penge i forskning indstilling, hvor Kol1 kunne udvindes fra dyremodel af interesse og anvendes til præklinisk afprøvning af manipuleret væv samles på kollagenbaserede stillads. På samme tid, ville have mulighed for at bruge en hurtigt isoleret, autologt afledt col1 i klinikken øge den samlede sikkerhed for patienter, der ellers ville modtage allogene eller xenogene præparater. For patienter, der fik en autogen forberedelse, ville dette strømlinede metode i høj grad reducere intervallet mellem biopsi indsamling og kollagen ansøgning. Af disse grunde vi forsøgt at forbedre på en veletableret Kol1 isolering og rensning metode ved hjælp af high-speed aggrænsning og størrelse-udelukkelse centrifugering. Denne metode er enkel at udføre ved anvendelse af standard buffere og udstyr, der findes i mange laboratorier. Ved at anvende high-speed agitation, vores protokol reducerer den nødvendige tid til at isolere opløselige, dermal Kol1 fra cirka 10 dage til mindre end 3 timer 8. Vigtigt er det, kan denne metode let udføres i det kliniske miljø for at forberede autologt afledt col1 til patienter i løbet af et enkelt sæt procedurer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">FastPrep-24 System</td>
			<td style="width:136px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:147px;">116004500</td>
			<td style="width:139px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:123px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:136px;">Beckman</td>
			<td style="width:147px;">J6-MI</td>
			<td style="width:139px;">Swing bucket rotor to accommodate 50 mL conical tubes at 3200 g.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method for the preparation of type i collagen from skin

Opløselig type 1 kollagen (Kol1) anvendes i udstrakt grad som en klæbende substrat for cellekulturer og som et cellulært stillads for regenerativ applikationer. Klinisk er dette protein i vid udstrækning anvendes til kosmetisk kirurgi, dermal injektioner, knogletransplantation og rekonstruktionskirurgi. Kilderne til Kol1 for disse procedurer er almindeligt ikke-humant, hvilket øger risikoen for betændelse og afvisning samt fremsendelse xenobiotikum sygdom. I lyset af dette vil en metode til hurtigt og effektivt at oprense Kol1 fra begrænsede mængder autologt afledte væv omgå mange af disse spørgsmål, men standard isolation protokoller er langvarige og kræver ofte store mængder af collagene væv. Her viser vi en effektiv Kol1 ekstraktion metode, der reducerer den nødvendige tid til at isolere og oprense dette protein fra omkring 10 dage til mindre end 3 timer. Vi valgte dermis som vores vævskilden på grund af dets tilgængelighed i mange kirurgiske procedurer. Thans metode bruger traditionelle udvinding buffere kombineret med kraftig agitation og centrifugalfiltreringsenheden at opnå meget ren, opløselig Kol1 fra små mængder af læderhuden. Kort fortalt dermale biopsier vasket grundigt i iskold dH2O efter fjernelse af fedt, bindevæv, og hår. Hudprøverne fratages noncollagenous proteiner og polysaccharider ved hjælp af 0,5 M natriumacetat og en høj hastighed bench-top homogenisator. Kollagen fra resterende faststoffer efterfølgende ekstraheret med en 0,075 M natriumcitrat-buffer ved hjælp af homogenisator. Disse ekstrakter renses ved hjælp af 100.000 MW cut-off centrifugefiltre der giver Kol1 præparater af sammenlignelige eller bedre kvalitet til kommercielle produkter eller dem, der opnås ved hjælp af traditionelle procedurer. Vi forventer, at denne metode vil lette udnyttelsen af ​​autologt afledt Kol1 for et væld af forskning og kliniske anvendelser.

Denne Kol1 isolation protokollen kræver omkring 2 timer og 15 minutter at gennemføre. Figur 1 viser et skematisk diagram skitserer de vigtigste trin i denne procedure. Forberedelse af prøven og udførelse af de 7 cykler af højhastigheds-agitation og skylninger med natriumacetat tager ca 35 min (figur 1A-C). Udførelse af en agitation og skyl cyklus med dH2O tager cirka 5 minutter (figur 1D og 1E). Tilføjelse natriumcitrat og udsætte prøven for en omrø...

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin at JoVE.com

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

En forbedret metode til forberedelse af type I kollagen fra hud

Traditionelle metoder til isolering af opløselige type 1 kollagen (Kol1) kræver omkring 10 dage fra start til slut på grund af langvarige buffer inkubationer og møjsommelig resuspensions af fibriller. Her beskriver vi et middel til at rense Kol1 fra små dermale biopsier i mindre end 3 timer.

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Konstruktion af et Collagen hydrogel til levering af stamcelle-loaded chitosanmikrosfærer

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Konstant tryk-styret Ekstrudering fremgangsmåde til fremstilling af nano-størrelse lipidvesikler

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Forbedret metode til forberedelse af en menneskelig celle-baseret, Contact Model af blod-hjerne barrieren

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Imaging Denatureret Kollagen Strands<em&gt; In vivo</em&gt; Og<em&gt; Ex vivo</em&gt; Via Photo-udløst Hybridisering af Caged Collagen mimetiske peptider

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

An Improved Mechanical Testing Method to Assess Bone-implant Anchorage

En forbedret Mekanisk testning metode til at vurdere Bone-implantat Anchorage

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Engineering 3D Cellularized kollagengeler for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Hakket Væv i Komprimeret Collagen: A Cell-holdige Biotransplant for Single-iscenesat rekonstruktionskirurgi Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Udarbejdelse af 3D Kollagen Gels og mikrokanalerne for Studiet af 3D Interactions<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Evaluering af keratinocytter spredning på to - og tre - dimensionelle Type I kollagen substrater

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...