Name: an improved method for the preparation of type i collagen from skin
Uploaded: 2014-01-21T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een onderzoek subsidie ​​van de National Institutes of Health (HL068915 naar DBC), een in New Onderzoeker Award van het Fonds Thrasher Onderzoek (naar CAP), een Grant-in-Aid van de American Heart Association (12GRNT11910008 naar DBC) , een onderzoek subsidie ​​van de Children&#39;s Heart Foundation (naar DBC), en donaties aan Ziekenhuis hartgeleiding Fonds de Boston Children&#39;s, de Ryan Family Endowment, en door David Pullman.

Hier zullen we de isolatie van COL1 van lamsvlees huid te tonen. Zoals geschreven kan dit protocol worden gebruikt om met succes isoleren KOL1 van konijn en menselijke huid. 1. Bereid Dermal Sample <ol><li> Equilibreer alle reagentia tot 4 ° C vóór gebruik. </li><li> Spoel de huid monster (25-50 g) in ijskoud dH 2 O en verwijder alle wol, bont, of haar met ontharingscrème. </li><li> Gebruik een single-edge scheermesje om het monster schoon van bindweefsel en vet te schrapen....

<ol>
	<li>Nageotte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coagulation+fibrillaire+in+vitro+du+collag&#232;ne+dissous+dans+un+acide+dilu&#233;.">Coagulation fibrillaire in vitro du collag&#232;ne dissous dans un acide dilu&#233;.</a> CR hebd. s&#233;ances Acad. Sei. 184, 115 (1927).</li><li>Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+investigation+of+the+structure+of+collagen.">Electron microscope investigation of the structure of collagen.</a> J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).</li><li>Choi, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+conduction+through+engineered+tissue.">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am. J. Pathol. 169, 72-85 (2006).</li><li>Pacak, C. A., Cowan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+myogenic+engineered+tissue+constructs.">Fabrication of myogenic engineered tissue constructs.</a> J. Vis. Exp. (27), (2009).</li><li>Cliche, S., Amiot, J., Avezard, C., Gariepy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+characterization+of+collagen+with+or+without+telopeptides+from+chicken+skin.">Extraction and characterization of collagen with or without telopeptides from chicken skin.</a> Poultry Sci. 82, 503-509 (2003).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use,+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications.">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).</li><li>Seifter, S., Gallop, P., Colowick, S., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+properties+of+soluble+collagens.">Preparation and properties of soluble collagens.</a> Methods in Enzymology. , (1963).</li><li>Pacak, C. A., Powers, J. M., Cowan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrarapid+purification+of+collagen+type+I+for+tissue+engineering+applications.">Ultrarapid purification of collagen type I for tissue engineering applications.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 879-885 (2011).</li><li>Ohan, M. P., Dunn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+stabilizes+collagen+sterilized+with+gamma+irradiation.">Glucose stabilizes collagen sterilized with gamma irradiation.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1188-1195 (2003).</li><li>Tyan, Y. C., Liao, J. D., Lin, S. P., Chen, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+the+sterilization+effect+of+gamma+ray+irradiation+of+immobilized+collagen+polypropylene+nonwoven+fabric+surfaces.">The study of the sterilization effect of gamma ray irradiation of immobilized collagen polypropylene nonwoven fabric surfaces.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1033-1043 (2003).</li><li>Ber, S., Torun Kose, G., Hasirci, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+tissue+engineering+on+patterned+collagen+films:+an+in+vitro+study.">Bone tissue engineering on patterned collagen films: an in vitro study.</a> Biomaterials. 26, 1977-1986 (2005).</li><li>Liu, Y., Sun, S., Singha, S., Cho, M. R., Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+femtosecond+laser+patterning+of+collagen+for+directed+cell+attachment.">3-D femtosecond laser patterning of collagen for directed cell attachment.</a> Biomaterials. 26, 4597-4605 (2005).</li><li>Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vascular+smooth+muscle+cells+by+micropatterning.">Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 883-890 (2003).</li><li>Leighton, J., Justh, G., Esper, M., Kronenthal, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-coated+cellulose+sponge:+three+dimensional+matrix+for+tissue+culture+of+Walker+tumor+256.">Collagen-coated cellulose sponge: three dimensional matrix for tissue culture of Walker tumor 256.</a> Science. 155, 1259-1261 (1967).</li></ol>

Een essentieel onderdeel van deze methode is de herhaalde efficiënte compressie van de huid monster om overtollige vloeistof te verwijderen. Het is cruciaal om zoveel natriumacetaat mogelijk in stap 2.5 verwijderen door het monster comprimeren. We gebruiken een spatel om de huid tegen de zijkant van de buis compact, maar kan kaasdoek worden gebruikt, hoewel dit het verwijderen van het monster zou vergen van de buis en verhogen de tijd nodig om deze stappen uitvoert. Evenzo is het belangrijk om het monster in stap 3.1 c...

Voor decennia, onderzoekers en commerciële verkopers hebben geïsoleerd oplosbaar KOL1 uit een assortiment van weefselbronnen zoals huid en pezen met een variant van een eenvoudige zuur-extractie protocol gevolgd door neutralisatie, waardoor een resuspensie van een matrix van georganiseerde KOL1 fibrillen die kunnen worden voor een veelheid van biomedische toepassingen 1-4. Hoewel er vele voorbeelden van klinische toepassingen COL1, enkele van deze dienst autoloog afgeleide KOL1 vanwege bereiding van dit eiwit vereist een langdurig extracties nemen dagen of weken uit te voeren 5-7. Daardoor onderzoekonderzoekers en artsen algemeen gebruik van dure, commerciële preparaten van KOL1 die worden bereid met humane weefsels zoals ratten, runder of varkens lederhuid of middels vel verwijderd uit kadavers of na besnijdenis. Voor regeneratieve toepassingen veel van deze producten vertonen variabiliteit wat betreft hun vermogen om vaste vormenmatrices of weefsel constructen kunnen ondersteunen celhechting en groei. Bijgevolg is er een duidelijke behoefte aan een nieuwe gestandaardiseerde methode ontworpen om snel extraheren KOL1 van toegankelijke en overvloedig autoloog weefsel bronnen. Een dergelijke methode zou zowel tijd als geld te besparen in de onderzoeksomgeving waar COL1 kon worden gewonnen uit het diermodel van belang en wordt gebruikt voor preklinische testen van gemanipuleerde weefsels samengesteld op basis van collageen steigers. Tegelijkertijd heeft de optie om een ​​snel geïsoleerd autoloog-afgeleide KOL1 in de kliniek zou de algemene veiligheid voor patiënten die anders allogene of xenogene preparaten zouden ontvangen toenemen. Voor patiënten die een autogeneic voorbereiding, zou dit gestroomlijnde methode sterk verminderen van de tijd tussen biopsie collectie en collageen toepassing. Daarom wilden we verbeteren lang gevestigde KOL1 isolatie en zuiveringsmethoden met hoge snelheid agtatie en de grootte-uitsluiting centrifugeren. Deze werkwijze is eenvoudig uit te voeren met behulp van standaard buffers en apparatuur in veel laboratoria. Door het gebruik van high-speed agitatie, ons protocol vermindert de tijd die nodig is om te isoleren oplosbaar, dermal COL1 van ongeveer 10 dagen tot minder dan 3 uur 8. Belangrijk is, kan deze werkwijze gemakkelijk worden uitgevoerd in de klinische setting om autoloog afgeleide KOL1 bereiden voor gebruik bij patiënten tijdens een enkele reeks procedures.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">FastPrep-24 System</td>
			<td style="width:136px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:147px;">116004500</td>
			<td style="width:139px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:123px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:136px;">Beckman</td>
			<td style="width:147px;">J6-MI</td>
			<td style="width:139px;">Swing bucket rotor to accommodate 50 mL conical tubes at 3200 g.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method for the preparation of type i collagen from skin

Oplosbaar type 1 collageen (COL1) wordt uitgebreid gebruikt als kleefstof substraat voor celculturen en als cellulaire matrix voor regeneratieve toepassingen. Klinisch wordt dit eiwit veel gebruikt voor cosmetische chirurgie, huid injecties, bottransplantatie en reconstructieve chirurgie. De bronnen van KOL1 voor deze procedures vaak humane, die de kans op ontsteking en afwijzing en overdracht xenobiotische ziekte verhoogt. Met het oog hierop zou een methode om snel en efficiënt zuiveren KOL1 van beperkte hoeveelheden autoloog afgeleide weefsels veel van deze problemen te omzeilen, maar standaard isolatietechnieken protocollen lang en vereisen vaak grote hoeveelheden collageen weefsels. Hier tonen we een efficiënte KOL1 extractiewerkwijze dat de tijd die nodig isoleren en zuiveren van dit eiwit van ongeveer 10 dagen tot minder dan 3 uur vermindert. Wij kozen de dermis als onze weefselbron vanwege de beschikbaarheid gedurende vele chirurgische procedures. Tzijn methode gebruikt traditionele extractiebuffers gecombineerd met krachtige agitatie en centrifugale filtratie om zeer zuiver, oplosbaar COL1 verkrijgen van kleine hoeveelheden lederhuid. In het kort worden dermale biopten grondig gewassen in ijskoude dH 2 O na verwijderen van vet, bindweefsel, en haar. De huid monsters worden ontdaan van collagene eiwitten en polysachariden met behulp van 0,5 M natriumacetaat en een hoge snelheid bench-top homogenisator. Collageen van overblijvende vaste stoffen wordt vervolgens geëxtraheerd met een 0,075 M natriumcitraatbuffer met de homogenisator. Deze extracten worden gezuiverd met behulp van 100.000 MW cut-off centrifugale filters die COL1 bereidingen van vergelijkbare of betere kwaliteit aan commerciële producten of die verkregen met behulp van traditionele procedures opleveren. We verwachten dat deze methode het gebruik van autoloog-afgeleide KOL1 voor een veelheid van onderzoek en klinische toepassingen te vergemakkelijken.

Dit COL1 isolatie protocol vereist ongeveer 2 uur en 15 minuten in beslag. Figuur 1 toont een schematisch diagram waarin de belangrijkste stappen in deze procedure. De voorbereiding van het monster en het uitvoeren van de 7 cycli van high-speed beroeringen en spoelt met natriumacetaat duurt ongeveer 35 min (figuren 1A-C). Het uitvoeren van een agitatie en spoel cyclus met dH 2 O duurt ongeveer 5 minuten (figuren 1D en 1E). Natriumcitraat toe te voegen en het ...

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin at JoVE.com

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Een verbeterde werkwijze voor de bereiding van type I collageen van de huid

Traditionele procedures voor de isolatie van oplosbare type 1 collageen (COL1) hebben ongeveer 10 dagen van start tot finish vanwege langdurige buffer incubatie en moeizame resuspensions van fibrillen. We beschrijven hier een middel te zuiveren KOL1 van kleine huid biopten in minder dan 3 uur.

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Organotypische Collageen I Assay: een Smeedbaar Platform to Cell Gedrag beoordelen in een 3-dimensionale Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

De bouw van een Collageen Hydrogel voor de levering van Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Constant Pressure-gecontroleerde Extrusie werkwijze voor de bereiding van Nano-sized lipide bolletjes

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Verbeterde werkwijze voor de bereiding van een Human-Cell gebaseerde, Contact Model van de bloed-hersenbarrière

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Beeldvorming Gedenatureerd Collageen Strengen<em&gt; In vivo</em&gt; En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Via-Foto getriggerd Hybridisatie van Caged Collageen Mimetic Peptiden

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

An Improved Mechanical Testing Method to Assess Bone-implant Anchorage

Een verbeterde mechanische testmethode te beoordelen Bone-implantaat Anchorage

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Engineering 3D Cellularized Collageen Gel voor Vasculaire Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Gehakt Tissue in Compressed Collageen: A-cel met Biotransplant voor Single-geënsceneerde Reconstructieve Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Voorbereiding van de 3D Collageen Gels en Microkanalen voor de Studie van 3D-Interacties<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Evaluatie van Keratinocyt proliferatie op twee - en drie - dimensional Type I collageen substraten

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...