Name: an improved method for the preparation of type i collagen from skin
Uploaded: 2014-01-21T22:00:00
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Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium von den National Institutes of Health (HL068915 zu DBC), einem New Researcher Award von der Thrasher Research Fund (CAP), ein Grant-in-Aid von der American Heart Association (12GRNT11910008 zu DBC) unterstützt ein Forschungsstipendium von der Kinderherzstiftung (DBC) und Spenden an die Kinderklinik Boston Erregungsleitungsfonds, der Ryan Familiengröße, und von David Pullman.

Hier werden wir die Isolierung von COL1 aus Lammfell zu demonstrieren. Wie geschrieben, kann dieses Protokoll auch verwendet, um erfolgreich von Kaninchen und die menschliche Haut zu isolieren COL1 werden. 1. Bereiten Dermal Beispiel <ol><li> Ins Gleichgewicht alle Reagenzien auf 4 ° C vor der Verwendung. </li><li> Spülen Hautprobe (25-50 g) in eiskaltem dH 2 O und entfernen Sie alle Wolle, Fell oder Haare mit Enthaarungscreme. </li><li> Verwenden Sie einen einzelnen Rasierkli...

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	<li>Nageotte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coagulation+fibrillaire+in+vitro+du+collag&#232;ne+dissous+dans+un+acide+dilu&#233;.">Coagulation fibrillaire in vitro du collag&#232;ne dissous dans un acide dilu&#233;.</a> CR hebd. s&#233;ances Acad. Sei. 184, 115 (1927).</li><li>Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+investigation+of+the+structure+of+collagen.">Electron microscope investigation of the structure of collagen.</a> J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).</li><li>Choi, Y. 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Ein wesentlicher Bestandteil dieses Verfahrens ist die wiederholte effiziente Kompression der Hautprobe, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Es ist wichtig, so viel wie möglich Natriumacetat in Schritt 2.5 durch Komprimieren der Probe zu entfernen. Wir verwenden einen Spatel, um die Haut gegen die Seite der Röhre zu verdichten, jedoch könnte Gaze verwendet werden, obwohl dies die Entfernung der Probe aus dem Rohr erforderlich und erhöht die erforderliche Zeit, um diese Schritte durchzuführen. Ebenso ist e...

Seit Jahrzehnten haben Wissenschaftler und kommerzielle Anbieter solubilisierten COL1 aus einem Sortiment von Gewebequellen, einschließlich Haut und Sehnen mit irgendeiner Variation eines einfachen Säure-Extraktionsprotokolls, gefolgt von Neutralisation, die in einer Resuspendierung aus einer Matrix organisiert COL1 Fibrillen führt, die verwendet werden können, isoliert für eine Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen 1-4. Zwar gibt es viele Beispiele für klinische Anwendungen für COL1, einige von diesen beschäftigen autolog stamm COL1 weil Herstellung dieses Proteins erfordert langwierige Extraktionen unter Tage oder Wochen auf 5-7 durchzuführen. Als Ergebnis der Forschung Forscher und Ärzte verwenden in der Regel teuer, Handelspräparate, die unter Verwendung von COL1 nicht-menschlichen Geweben wie Ratten, Rinder-, Schweine-oder Lederhaut oder über die Haut von Leichen entfernt oder nach der Beschneidung von Männern zubereitet werden. Für regenerative Anwendungen sind viele dieser Produkte zeigen Variabilität in Bezug auf ihre Fähigkeit, feste bildenMatrices oder Gewebe-Konstrukte in der Lage ist die Zellhaftung und Wachstum. Folglich gibt es einen deutlichen Bedarf für eine neue standardisierte Methode entwickelt, um schnell zu extrahieren COL1 aus zugänglich und reichlich autologen Gewebequellen. Ein derartiges Verfahren würde Zeit und Geld in die Forschung, in dem COL1 konnte aus dem Tiermodell von Interesse extrahiert und für die präklinische Prüfung von technischen Geweben auf Kollagenbasis Gerüste montiert werden zu speichern. Gleichzeitig würde mit der Möglichkeit, eine schnell isoliert, autolog stamm COL1 in der Klinik die allgemeine Sicherheit für die Patienten, die sonst erhalten würde allogenen oder xenogenen Vorbereitungen zu erhöhen. Bei Patienten, die eine autogenen Vorbereitung, würde dies die vereinfachte Verfahren stark das Intervall zwischen Biopsie-Sammlung und Kollagen-Anwendung zu reduzieren. Aus diesen Gründen haben wir versucht, auf eine lange etablierte COL1 Isolierung und Reinigung Verfahren unter Verwendung von High-Speed-ag verbessernitation und Größenausschluss-Zentrifugation. Dieses Verfahren ist einfach durchzuführen unter Verwendung von Standardpuffern und in vielen Labors gefunden. Durch den Einsatz von High-Speed-Agitation, reduziert unsere Protokoll die notwendige Zeit, um lösliche, Haut COL1 von etwa 10 Tagen auf weniger als 3 Stunden 8 zu isolieren. Wichtig ist, dass diese Methode kann leicht in der Klinik, um autolog stamm COL1 zur Anwendung bei Patienten während einer einzigen Reihe von Verfahren durchgeführt werden, vorzubereiten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">FastPrep-24 System</td>
			<td style="width:136px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:147px;">116004500</td>
			<td style="width:139px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:123px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:136px;">Beckman</td>
			<td style="width:147px;">J6-MI</td>
			<td style="width:139px;">Swing bucket rotor to accommodate 50 mL conical tubes at 3200 g.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method for the preparation of type i collagen from skin

Lösliche Typ-1-Kollagen (COL1) wird weitgehend als Klebstoff Substrat für Zellkulturen sowie als Zellgerüst für regenerative Anwendungen verwendet. Klinisch wird dieses Protein häufig für kosmetische Chirurgie, Hautinjektionen, Knochentransplantation, und rekonstruktive Chirurgie. Die Quellen der COL1 für diese Verfahren sind allgemein nicht-menschlichen, welche das Potential für eine Entzündung und Ablehnung sowie xenobiotischen Krankheitsübertragung erhöht. Im Hinblick darauf wäre ein Verfahren, um schnell und effizient zu reinigen COL1 von begrenzten Mengen von autolog abgeleiteten Gewebe umgehen viele dieser Probleme, jedoch sind Standardisolierungsprotokolle langwierig und erfordern große Mengen an kollagenem Gewebe oft. Hier zeigen wir ein effizientes COL1 Extraktionsmethode, die die benötigte Zeit, um von ungefähr 10 Tage zu isolieren und zu reinigen, dieses Protein auf weniger als 3 h reduziert. Wir wählten die Dermis als unsere Gewebequelle wegen seiner Verfügbarkeit in vielen chirurgischen Verfahren. Tseine Methode verwendet traditionelle Extraktionspuffer kombiniert mit kraftvollen Bewegung und Zentrifugalfiltration zu hochreinem, lösliche COL1 von kleinen Mengen von Lederhaut erhalten. Kurz gesagt, Hautbiopsien werden gründlich in eiskaltem dH 2 O nach Entfernen von Fett, Bindegewebe und Haare gewaschen. Die Hautproben werden von nicht-kollagenen Proteinen und Polysacchariden unter Verwendung von 0,5 M Natriumacetat und eine Hochgeschwindigkeitslabortisch-Homogenisators abgestreift. Kollagen von restlichen Feststoffen wird anschließend mit einer 0,075 M Natriumcitrat-Puffer unter Verwendung eines Homogenisators extrahiert. Diese Extrakte werden mit 100.000 MW Cut-off-Filter, die Kreisel COL1 Zubereitungen der vergleichbare oder überlegene Qualität, kommerzielle Produkte oder solche mit herkömmlichen Verfahren gereinigt, erhalten. Wir erwarten, dieses Verfahren die Verwendung von autologen abgeleiteten COL1 für eine Vielzahl von Forschungs-und klinischen Anwendungen zu erleichtern.

Diese COL1 Isolation Protokoll benötigt etwa 2 Stunden und 15 Minuten in Anspruch. Fig. 1 zeigt ein schematisches Diagramm, das die Hauptschritte in diesem Verfahren. Herstellung der Probe und Durchführen der 7 Zyklen von Hochgeschwindigkeits-Agitation und spült mit Natriumacetat dauert etwa 35 min (Fig. 1A-C). Durchführen einer Agitation und spülen Zyklus mit dH 2 O dauert ca. 5 min (1D und 1E). Hinzufügen von Natriumcitrat und Unterwerfen der Probe ei...

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An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Typ I-Kollagen aus der Haut

Traditionelle Verfahren zur Isolierung von löslichen Typ-1-Kollagen (COL1) benötigen etwa 10 Tage von Anfang an wegen der langwierigen und mühsamen Puffer Inkubationen Resuspensionen von Fibrillen zu beenden. Hier beschreiben wir ein Mittel, um COL1 von kleinen Hautbiopsien in weniger als 3 Stunden zu reinigen.

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Organotypische Collagen I Assay: A Temperguss Platform to Cell Verhalten in 3-Dimensional Kontext beurteilen

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Forschung

Biotechnik

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Der Bau einer Kollagen-Hydrogel für die Lieferung von Stem Cell-beladenen Chitosan-Mikrokügelchen

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

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Constant Pressure-gesteuerte Extrusionsverfahren zur Herstellung von Nano-Größe Lipidvesikeln

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Imaging denaturierten Kollagen-Stränge<em&gt; In-vivo-</em&gt; Und<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Über die Photo-ausgelöst Hybridisierung von Caged Collagen mimetischen Peptiden

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

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Eine verbesserte mechanische Testverfahren zu Knochen-Implantat-Anchorage bewerten

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Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

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Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Bewertung der Keratinozyten Verbreitung auf zwei- und dreidimensionale Typ I Kollagen Substrate

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...