Name: an improved method for the preparation of type i collagen from skin
Uploaded: 2014-01-21T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av et forskningsstipend fra National Institutes of Health (HL068915 til DBC), en ny Researcher Award fra Thrasher Research Fund (CAP), en Grant-i-Aid fra American Heart Association (12GRNT11910008 til DBC) , et forskningsstipend fra Barnas Heart Foundation (til DBC), og donasjoner til Boston Children Hospital hjertets ledningsevne Fund, Ryan Family Endowment, og David Pullman.

Her vil vi demonstrere isolering av kol1 fra lammeskinn. Som skrevet, kan denne protokollen også bli brukt for å kunne isolere kol1 fra kanin og menneskelig hud. En. Forbered Dermal Sample <ol><li> Stabil alle reagenser til 4 ° C før bruk. </li><li> Skyll dermal prøve (25-50 g) i iskaldt dH 2 O og fjerne ull, pels, eller hår med hårfjerningskrem. </li><li> Bruk en single-edge barberblad til å skrape prøven ren av bindevev og fett. </li><li> Skyll prøven i iskaldt dH <s...

<ol>
	<li>Nageotte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coagulation+fibrillaire+in+vitro+du+collag&#232;ne+dissous+dans+un+acide+dilu&#233;.">Coagulation fibrillaire in vitro du collag&#232;ne dissous dans un acide dilu&#233;.</a> CR hebd. s&#233;ances Acad. Sei. 184, 115 (1927).</li><li>Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+investigation+of+the+structure+of+collagen.">Electron microscope investigation of the structure of collagen.</a> J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).</li><li>Choi, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+conduction+through+engineered+tissue.">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am. J. Pathol. 169, 72-85 (2006).</li><li>Pacak, C. A., Cowan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+myogenic+engineered+tissue+constructs.">Fabrication of myogenic engineered tissue constructs.</a> J. Vis. Exp. (27), (2009).</li><li>Cliche, S., Amiot, J., Avezard, C., Gariepy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+characterization+of+collagen+with+or+without+telopeptides+from+chicken+skin.">Extraction and characterization of collagen with or without telopeptides from chicken skin.</a> Poultry Sci. 82, 503-509 (2003).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use,+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications.">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).</li><li>Seifter, S., Gallop, P., Colowick, S., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+properties+of+soluble+collagens.">Preparation and properties of soluble collagens.</a> Methods in Enzymology. , (1963).</li><li>Pacak, C. A., Powers, J. M., Cowan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrarapid+purification+of+collagen+type+I+for+tissue+engineering+applications.">Ultrarapid purification of collagen type I for tissue engineering applications.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 879-885 (2011).</li><li>Ohan, M. P., Dunn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+stabilizes+collagen+sterilized+with+gamma+irradiation.">Glucose stabilizes collagen sterilized with gamma irradiation.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1188-1195 (2003).</li><li>Tyan, Y. C., Liao, J. D., Lin, S. P., Chen, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+the+sterilization+effect+of+gamma+ray+irradiation+of+immobilized+collagen+polypropylene+nonwoven+fabric+surfaces.">The study of the sterilization effect of gamma ray irradiation of immobilized collagen polypropylene nonwoven fabric surfaces.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1033-1043 (2003).</li><li>Ber, S., Torun Kose, G., Hasirci, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+tissue+engineering+on+patterned+collagen+films:+an+in+vitro+study.">Bone tissue engineering on patterned collagen films: an in vitro study.</a> Biomaterials. 26, 1977-1986 (2005).</li><li>Liu, Y., Sun, S., Singha, S., Cho, M. R., Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+femtosecond+laser+patterning+of+collagen+for+directed+cell+attachment.">3-D femtosecond laser patterning of collagen for directed cell attachment.</a> Biomaterials. 26, 4597-4605 (2005).</li><li>Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vascular+smooth+muscle+cells+by+micropatterning.">Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 883-890 (2003).</li><li>Leighton, J., Justh, G., Esper, M., Kronenthal, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-coated+cellulose+sponge:+three+dimensional+matrix+for+tissue+culture+of+Walker+tumor+256.">Collagen-coated cellulose sponge: three dimensional matrix for tissue culture of Walker tumor 256.</a> Science. 155, 1259-1261 (1967).</li></ol>

En viktig komponent i denne metoden er at gjentatte effektiv sammentrykning av dermal prøve for å fjerne overskudd av væske. Det er viktig å fjerne så mye som mulig natriumacetat i trinn 2.5 ved å komprimere prøven. Vi benytter en spatel for å komprimere huden mot siden av røret, men osteklede, kan også anvendes, selv om dette ville nødvendiggjøre fjerning av prøven fra røret og øke den tid som kreves for å utføre denne fremgangsmåten. Likeledes er det viktig å komprimere prøven i trinn 3.1, slik at ...

I flere tiår har forskere og kommersielle leverandører isolert solubilisert Kol1 fra et utvalg av vevs-kilder, inkludert hud-og sene ved hjelp av en variant av en enkel syre ekstraksjon protokoll etterfulgt av nøytralisering, hvilket resulterer i en resuspensjon av en matriks av organiserte Kol1 fibriller som kan benyttes for en rekke biomedisinske applikasjoner 1-4. Mens det er mange eksempler på kliniske applikasjoner for kol1, noen av disse benytter autologously-avledet kol1 fordi utarbeidelsen av dette proteinet krever lange utdrag tar dager eller uker å utføre 5-7. Som et resultat av forsknings-forskere og leger generelt bruke dyre, kommersielle preparater av Kol1 som er fremstilt ved hjelp av ikke-humane vev som rotte, bovint eller porcint corium eller ved hjelp av huden fjernet fra kadavre eller etter male omskjæring. For regenerative applikasjoner, mange av disse produkter utstillings variabilitet med hensyn til deres evne til å danne et fastmatriser eller vev-konstruksjoner som er i stand til å støtte cellefesting og vekst. Det er derfor et klart behov for en ny standardisert metode utviklet for å raskt trekke kol1 fra tilgjengelige og rikelig autologe vevskilder. En slik metode vil spare både tid og penger i forskning setting der kol1 kunne hentes ut fra dyremodell av renter og benyttes for preklinisk testing av konstruerte vev montert på kollagen-baserte stillaser. På samme tid, vil ha mulighet for å bruke en hurtig-isolert, autologously-avledet col1 i klinikken øke den totale sikkerhet for pasientene som ellers ville motta allogeneiske eller xenogeneiske preparater. For pasienter som får en autogent forberedelser, ville dette strømlinjeformet metode sterkt redusere intervallet mellom biopsi innsamling og kollagen søknad. For disse grunner, forsøkte vi å forbedre et veletablert kol1 isolering og rensing metoden ved hjelp av høyhastighets agutfelling og størrelsesutelukkelses-sentrifugering. Denne metoden er enkel å utføre ved anvendelse av standardbuffere og utstyr som finnes i mange laboratorier. Ved å ansette høyhastighets agitasjon, reduserer vår protokoll nødvendig tid til å isolere løselig, dermal kol1 fra ca 10 dager til mindre enn tre timers åtte. Viktigere, kan denne metoden være lett utføres i klinisk setting for å forberede autologously-avledet kol1 for bruk hos pasienter under et enkelt sett med prosedyrer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">FastPrep-24 System</td>
			<td style="width:136px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:147px;">116004500</td>
			<td style="width:139px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:123px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:136px;">Beckman</td>
			<td style="width:147px;">J6-MI</td>
			<td style="width:139px;">Swing bucket rotor to accommodate 50 mL conical tubes at 3200 g.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method for the preparation of type i collagen from skin

Løselig type 1 kollagen (kol1) er mye brukt som et lim substrat for cellekulturer og som en mobil stillas for regenerativ applikasjoner. Klinisk, er dette proteinet mye brukt for kosmetisk kirurgi, dermal injeksjoner, bein pode, og rekonstruktiv kirurgi. Kildene til Kol1 for disse fremgangsmåter er vanligvis ikke-humant, noe som øker potensialet for betennelse eller avvisning samt xenobiotic sykdomsoverføring. I lys av dette, ville en fremgangsmåte til effektivt og raskt å rense Kol1 av begrensede mengder av autologously-avledet vev omgå mange av disse problemene, men vanlige isoleringsmetoder er omstendelige og krever ofte store mengder av collagenous vev. Her viser vi en effektiv col1 ekstraksjon metode som reduserer tiden som er nødvendig for å isolere og rense dette protein fra omtrent 10 dager til mindre enn 3 timer. Vi valgte dermis som vår vev kilde på grunn av sin tilgjengelighet under mange kirurgiske prosedyrer. Thans metode bruker tradisjonelle ekstraksjons buffere kombinert med kraftig omrøring og sentrifugal filtrering til å gi svært ren, oppløselig Kol1 fra små mengder av corium. Kort fortalt er dermal biopsier vaskes grundig i iskaldt dH 2 O etter å fjerne fett, bindevev, og hår. Hudprøvene blir strippet for noncollagenous proteiner og polysakkarider ved bruk av 0,5 M natrium-acetat, og en høyhastighets benk-topp-homogenisator. Kollagen fra gjenværende faste stoffer ble deretter ekstrahert med en 0,075 M natrium-citrat-buffer ved hjelp av homogenisator. Disse ekstraktene er renset ved hjelp av 100 000 MW cut-off sentrifugale filtre som gir kol1 preparater av sammenlignbare eller overlegen kvalitet til kommersielle produkter eller de som ble oppnådd ved hjelp av tradisjonelle prosedyrer. Vi forventer denne metoden vil forenkle utnyttelsen av autologously-avledet kol1 for et mangfold av forskning og kliniske applikasjoner.

Dette kol1 isolasjon protokollen krever ca 2 timer og 15 minutter å fullføre. Figur 1 viser et skjematisk diagram som beskriver de viktigste trinn i denne fremgangsmåten. Klargjøring av prøven og utføre de syv sykluser av høyhastighets agitations og skyller med natriumacetat tar ca 35 min (figur 1A-C). Utføre en agitasjon og skyll syklus med dH 2 O tar ca 5 min (Tall 1D og 1E). Legge natriumcitrat og å underkaste prøven en agitering og skyllesykluse...

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin at JoVE.com

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

En forbedret fremgangsmåte for fremstillingen av type I kollagen fra hud

Tradisjonelle prosedyrer for isolering av løselig type 1 kollagen (kol1) krever omtrent 10 dager fra start til slutt på grunn av lange buffer inkubasjoner og arbeidskrevende resuspensions av fibriller. Her beskriver vi et middel for å rense kol1 fra små dermal biopsier på mindre enn tre timer.

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Konstruere en Kollagen Hydrogel for levering av Stem Cell-lastet Chitosan Mikrokuler

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Konstant trykk-kontrollert Extrusion Metode for utarbeidelse av nanostørrelse Lipid Blemmer

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Forbedret fremgangsmåte for fremstilling av en human cellebasert kontakt Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Imaging denaturert kollagen Strands<em&gt; In vivo</em&gt; Og<em&gt; Ex vivo</em&gt; Via Photo-utløst Hybridisering av Caged Kollagen Mimetic Peptider

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

An Improved Mechanical Testing Method to Assess Bone-implant Anchorage

En forbedret mekanisk testing metode for å vurdere Bone-implantat Anchorage

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingeniør 3D Cellularized Kollagen Geleer til Vaskulær Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Hakket Tissue i Compressed Kollagen: A Cell holdig Biotransplant for Single-iscenesatt rekonstruktiv Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Utarbeidelse av 3D kollagen Gels og mikro for studier av 3D Interaksjoner<em&gt; I Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Evaluering av Keratinocyte spredning på to - og tre - dimensjonale Type I kollagen underlag

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...