Name: an improved method for the preparation of type i collagen from skin
Uploaded: 2014-01-21T22:00:00
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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de investigação dos Institutos Nacionais de Saúde (HL068915 para DBC), uma nova Researcher Award do Fundo de Investigação Thrasher (a PAC), um Grant-in-Aid da American Heart Association (12GRNT11910008 para DBC) , uma bolsa de investigação da Fundação das Crianças do Coração (para DBC) e doações para Hospital Cardiológico Fundo das Crianças de Boston Condução, a família de Ryan Endowment, e por David Pullman.

Aqui vamos demonstrar o isolamento de COL1 de pele de cordeiro. Como escrito, este protocolo pode também ser utilizado com êxito para isolar COL1 de coelho e pele humana. 1. Prepare dérmica Amostra <ol><li> Equilibrar todos os reagentes a 4 ° C antes de usar. </li><li> Lavar amostra dérmica (25-50 g) em gelada dH 2 O e remover qualquer lã, pele, cabelo ou com creme depilatório. </li><li> Use uma lâmina de barbear de ponta única para raspar a limpo amostra de tecido conj...

<ol>
	<li>Nageotte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coagulation+fibrillaire+in+vitro+du+collag&#232;ne+dissous+dans+un+acide+dilu&#233;.">Coagulation fibrillaire in vitro du collag&#232;ne dissous dans un acide dilu&#233;.</a> CR hebd. s&#233;ances Acad. Sei. 184, 115 (1927).</li><li>Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+investigation+of+the+structure+of+collagen.">Electron microscope investigation of the structure of collagen.</a> J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).</li><li>Choi, Y. 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Um componente importante do presente método é a compressão eficaz repetida da amostra cutânea para remover o excesso de líquido. É essencial para remover tanto quanto possível, de acetato de sódio no passo de 2,5 por compressão da amostra. Usamos uma espátula para compactar a pele contra o lado do tubo, no entanto, gaze também pode ser usado, embora isto exigir a remoção da amostra do tubo e aumentar o tempo necessário para realizar estes passos. Da mesma forma, é importante para comprimir a amostra no pa...

Durante décadas, os investigadores e os fornecedores comerciais isolaram COL1 solubilizado a partir de uma variedade de fontes de tecidos, incluindo a pele e tendões usando uma variação de um protocolo de extracção de ácido simples, seguido de neutralização, o que resulta numa libertação de uma matriz de fibrilas COL1 organizados que podem ser utilizados para uma infinidade de aplicações biomédicas 1-4. Embora existam muitos exemplos de aplicações clínicas para COL1, alguns deles empregam COL1 autologously derivados porque a preparação desta proteína requer longas extrações levando dias ou semanas para realizar 5-7. Como resultado, os investigadores e médicos investigação utilizam geralmente caros, preparações comerciais de COL1 que são preparados usando os tecidos não-humanas, tais como rato, bovino, porcino ou cório ou usando pele retiradas de cadáveres ou depois da circuncisão masculina. Para aplicações regenerativas, muitos destes produtos apresentam variabilidade no que diz respeito à sua capacidade para formar sólidomatrizes ou construções de tecidos capazes de suportar a ligação de células e o crescimento. Por conseguinte, existe uma grande necessidade de um novo método normalizado concebido para extrair rapidamente COL1 a partir de fontes de tecidos autólogos acessíveis e abundantes. Tal método poderia economizar tempo e dinheiro no ambiente de pesquisa, onde COL1 poderia ser extraído do modelo animal de interesse e utilizado para testes pré-clínicos de tecidos artificiais montados em andaimes à base de colágeno. Ao mesmo tempo, ter a opção de usar um rapidamente isolada, COL1 autologously derivado na clínica seria aumentar a segurança geral dos pacientes que, de outra forma recebem alogénicas ou xenogénicas preparações. Para os pacientes que receberam uma preparação autogeneic, este método simplificado seria reduzir bastante o intervalo entre a coleta de biópsia e aplicação de colágeno. Por estas razões, buscamos aperfeiçoar um método de isolamento e purificação COL1 estabelecido há muito tempo usando ag de alta velocidadeacreditação e de exclusão de tamanho de centrifugação. Este método é simples de executar, usando soluções padrão e equipamentos encontrados em muitos laboratórios. Ao empregar a agitação de alta velocidade, o nosso protocolo reduz o tempo necessário para isolar solúvel, dérmica COL1 de aproximadamente 10 dias para menos de 3 horas 8. Importante, este método pode ser facilmente realizada no cenário clínico, a fim de preparar COL1 autologously-derivado para utilização em doentes durante um único conjunto de procedimentos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">FastPrep-24 System</td>
			<td style="width:136px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:147px;">116004500</td>
			<td style="width:139px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:123px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:136px;">Beckman</td>
			<td style="width:147px;">J6-MI</td>
			<td style="width:139px;">Swing bucket rotor to accommodate 50 mL conical tubes at 3200 g.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method for the preparation of type i collagen from skin

Tipo 1 Solúvel colagénio (COL1) é amplamente utilizado como um substrato adesivo para culturas de células e como um andaime para aplicações de regeneração celular. Clinicamente, esta proteína é amplamente utilizado para a cirurgia estética, injeções dérmicas, enxerto ósseo e cirurgia reconstrutiva. As fontes de COL1 para estes processos são geralmente não-humanos, o que aumenta o potencial para a inflamação e a rejeição, bem como a transmissão da doença de xenobióticos. Em vista disto, um método eficiente e rápido para purificar COL1 de quantidades limitadas de tecidos autologously derivados iria contornar muitos destes problemas, no entanto, os protocolos de isolamento convencionais são demorados e muitas vezes necessitam de grandes quantidades de tecidos colagenosos. Aqui, demonstramos um método de extracção COL1 eficiente que reduz o tempo necessário para isolar e purificar a proteína a partir de cerca de 10 dias para menos de 3 horas. Escolhemos a derme como a fonte de tecido devido à sua disponibilidade durante muitos procedimentos cirúrgicos. Tseu método usa buffers de extração tradicionais combinados com agitação vigorosa e filtração centrífuga para obter altamente pura, COL1 solúvel de pequenas quantidades de cório. Resumidamente, as biópsias da derme são lavados em gelada dH2O após a remoção de gordura, tecido conectivo, e cabelo. As amostras de pele são retirados de proteínas e polissacarídeos noncollagenous usando 0,5 M de acetato de sódio e uma alta velocidade de bancada homogeneizador. O colagénio de sólidos residuais é subsequentemente extraído com um tampão de citrato de sódio 0,075 M com o homogeneizador. Estes extractos são purificados usando 100.000 MW de corte filtros centrífugos que produzem preparações COL1 de qualidade comparável ou superior aos produtos comerciais ou aquelas obtidas através de procedimentos tradicionais. Prevemos que este método vai proporcionar a utilização dos derivados de autologously COL1 para uma multiplicidade de pesquisa e aplicações clínicas.

Este protocolo de isolamento COL1 requer cerca de 2 horas e 15 minutos para ser concluído. A Figura 1 mostra um diagrama esquemático que representa as principais etapas deste processo. Preparação da amostra e realizando os 7 ciclos de agitações de alta velocidade e lavagens com acetato de sódio leva cerca de 35 minutos (Figuras 1A-C). Realizando uma agitação e enxágüe ciclo com dH2O demora cerca de 5 min (Figuras 1D e 1E). A adição de citrato de ...

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An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Um método aperfeiçoado para a preparação de colágeno tipo I Da Pele

Procedimentos tradicionais para o isolamento do tipo solúvel 1 colágeno (col1) requerem cerca de 10 dias do início ao fim por causa de incubações tampão longas e trabalhosas resuspensions de fibrilas. Aqui, nós descrevemos um meio para purificar a partir de pequenas biópsias COL1 dérmicos em menos de 3 horas.

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Organotípica Colágeno Ensaio I: Uma Plataforma maleável para Avaliar Comportamento celular em um contexto de 3-Dimensional

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Bioengenharia

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Construindo um hidrogel de colágeno para a entrega de células-tronco carregado microesferas

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Método de extrusão constante pressão controlada para a Preparação de vesículas lipídicas nanométricas

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Imagiologia desnaturadas colágeno Vertentes<em&gt; In vivo</em&gt; E<em&gt; Ex vivo</em&gt; Via foto desencadeada Hibridização do Caged Colágeno mimético Peptídeos

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

An Improved Mechanical Testing Method to Assess Bone-implant Anchorage

Um método melhorado Ensaios Mecânicos para Avaliar osso-implante Anchorage

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

O tecido triturado em Compressed Collagen: Um BioTransplant contendo celular para o reparo Reconstructive Single-encenado

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparação de 3D colágeno Géis e microcanais para o estudo das interações 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Avaliação da proliferação queratinócito em duas e três dimensões tipo I colágeno substratos

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...