Name: an improved method for the preparation of type i collagen from skin
Uploaded: 2014-01-21T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin at JoVE.com

Эта работа была поддержана исследовательского гранта от Национального института здоровья (HL068915 в DBC), новую награду исследователь из исследовательского фонда Thrasher (к CAP), Грант-в-помощь от Американской ассоциации сердца (12GRNT11910008 к DBC) , исследовательский грант от Детского Heart Foundation (к DBC), и пожертвования в Бостонской детской больницы сердечной проводимости фонда, Райан Family фонда, и Дэвид Pullman.

Здесь мы продемонстрируем изоляцию COL1 от кожи ягненка. Как написано, этот протокол также может быть использован, чтобы успешно изолировать COL1 из кролика и кожи человека. 1. Подготовка Кожные пробы <ol><li> Уравновесьте все реактивы до 4 ° С до использования. </li><li> Промыть кож...

<ol>
	<li>Nageotte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coagulation+fibrillaire+in+vitro+du+collag&#232;ne+dissous+dans+un+acide+dilu&#233;.">Coagulation fibrillaire in vitro du collag&#232;ne dissous dans un acide dilu&#233;.</a> CR hebd. s&#233;ances Acad. Sei. 184, 115 (1927).</li><li>Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+investigation+of+the+structure+of+collagen.">Electron microscope investigation of the structure of collagen.</a> J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).</li><li>Choi, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+conduction+through+engineered+tissue.">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am. J. Pathol. 169, 72-85 (2006).</li><li>Pacak, C. A., Cowan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+myogenic+engineered+tissue+constructs.">Fabrication of myogenic engineered tissue constructs.</a> J. Vis. Exp. (27), (2009).</li><li>Cliche, S., Amiot, J., Avezard, C., Gariepy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+characterization+of+collagen+with+or+without+telopeptides+from+chicken+skin.">Extraction and characterization of collagen with or without telopeptides from chicken skin.</a> Poultry Sci. 82, 503-509 (2003).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use,+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications.">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).</li><li>Seifter, S., Gallop, P., Colowick, S., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+properties+of+soluble+collagens.">Preparation and properties of soluble collagens.</a> Methods in Enzymology. , (1963).</li><li>Pacak, C. A., Powers, J. M., Cowan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrarapid+purification+of+collagen+type+I+for+tissue+engineering+applications.">Ultrarapid purification of collagen type I for tissue engineering applications.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 879-885 (2011).</li><li>Ohan, M. P., Dunn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+stabilizes+collagen+sterilized+with+gamma+irradiation.">Glucose stabilizes collagen sterilized with gamma irradiation.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1188-1195 (2003).</li><li>Tyan, Y. C., Liao, J. D., Lin, S. P., Chen, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+the+sterilization+effect+of+gamma+ray+irradiation+of+immobilized+collagen+polypropylene+nonwoven+fabric+surfaces.">The study of the sterilization effect of gamma ray irradiation of immobilized collagen polypropylene nonwoven fabric surfaces.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1033-1043 (2003).</li><li>Ber, S., Torun Kose, G., Hasirci, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+tissue+engineering+on+patterned+collagen+films:+an+in+vitro+study.">Bone tissue engineering on patterned collagen films: an in vitro study.</a> Biomaterials. 26, 1977-1986 (2005).</li><li>Liu, Y., Sun, S., Singha, S., Cho, M. R., Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+femtosecond+laser+patterning+of+collagen+for+directed+cell+attachment.">3-D femtosecond laser patterning of collagen for directed cell attachment.</a> Biomaterials. 26, 4597-4605 (2005).</li><li>Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vascular+smooth+muscle+cells+by+micropatterning.">Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 883-890 (2003).</li><li>Leighton, J., Justh, G., Esper, M., Kronenthal, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-coated+cellulose+sponge:+three+dimensional+matrix+for+tissue+culture+of+Walker+tumor+256.">Collagen-coated cellulose sponge: three dimensional matrix for tissue culture of Walker tumor 256.</a> Science. 155, 1259-1261 (1967).</li></ol>

Важнейшим компонентом этого метода является повторное эффективное сжатие образца кожного для удаления избытка жидкости. Очень важно, чтобы удалить как можно больше ацетат натрия, как это возможно в шаге 2,5 путем сжатия образца. Мы используем лопаточку, чтобы уплотнить кожу от стороны ?...

В течение десятилетий исследователи и коммерческие поставщики выделили солюбилизированного COL1 из ассортимента тканевых источников, включая кожу и сухожилия с помощью некоторые вариации простого протокола экстракции кислотой с последующей нейтрализацией, в результате чего в ресуспендирования матрицы, организованных COL1 фибрилл, которые могут быть использованы для множества биомедицинских приложений 1-4. В то время как есть много примеров клинических приложений для COL1, некоторые из них используют аутогенно производный COL1 потому подготовка этого белка требует длительных экстракции принимая несколько дней или недель, чтобы выполнить 5-7. В результате исследований исследователи и врачи обычно используют дорогие, коммерческие препараты COL1, которые получают с помощью нечеловеческие тканей, таких как крысы, быка или свиньи дермы или с использованием кожи удалены из трупов или после обрезания мужчин. Для восстановительных приложений, многие из них изменчивости продукты выставочная с точки зрения их способности сформировать твердоеМатрицы или ткани конструкции, способные поддерживать прикрепление и рост клеток. Следовательно, существует явная необходимость в новом стандартного метода предназначены для быстрого извлечения COL1 из доступного и обильными аутологичных тканевых источников. Такой метод позволит сэкономить время и деньги в установке исследования, где COL1 могли быть извлечены из животной модели интерес и используется для доклинических испытаний инженерных тканей, собранных на основе коллагена лесов. В то же время, имея возможность использовать быстро изолированы, аутогенно производный COL1 в клинике было бы увеличить общую безопасность для пациентов, которые могли бы получать аллогенных или ксеногенных препараты. Для пациентов, получающих autogeneic подготовку, это обтекаемый метод позволит значительно сократить интервал между сбором биопсии и коллагена применения. По этим причинам, мы стремились улучшить давние методом выделения и очистки COL1 с помощью высокоскоростного AGitation и гель-центрифугирования. Этот метод прост для выполнения с использованием стандартных буферов и оборудования, найденные во многих лабораториях. Используя высокоскоростную агитацию, наш протокол сокращает время, необходимое для выделения растворимого, кожные COL1 от примерно 10 дней до менее чем 3 часа 8. Важно отметить, что этот метод может быть легко выполнена в клинических условиях с целью подготовки аутогенно производный COL1 для использования у пациентов во время одного набора процедур.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">FastPrep-24 System</td>
			<td style="width:136px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:147px;">116004500</td>
			<td style="width:139px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:123px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:136px;">Beckman</td>
			<td style="width:147px;">J6-MI</td>
			<td style="width:139px;">Swing bucket rotor to accommodate 50 mL conical tubes at 3200 g.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method for the preparation of type i collagen from skin

Растворимый коллаген типа 1 (COL1) широко используется в качестве клейкой подложки для клеточных культур и как сотовый каркаса для регенеративных приложений. Клинически этот белок широко используется для косметической хирургии, кожных инъекций, костной пластики и реконструктивной хирургии. Источники COL1 для этих процедур, как правило, нечеловеческий, что увеличивает потенциал для воспаления и отторжения, а также передачу ксенобиотиков заболевания. В связи с этим, метод, чтобы быстро и эффективно очищать COL1 от ограниченных количеств аутогенно производных тканей бы обойти многие из этих проблем, однако стандартные протоколы изоляции являются длительными и часто требуют большого количества коллагеновых тканей. Здесь мы демонстрируем эффективную COL1 метод извлечения, который уменьшает время, необходимое для выделения и очистки этого белка от 10 дней до менее чем 3 часа. Мы выбрали дермы как нашего источника ткани из-за его доступности во многих хирургических процедур. Тего метод использует традиционные буферы экстракции в сочетании с силовым перемешивании и центробежной фильтрации, чтобы получить высоко-чистый, растворимый COL1 из небольших количеств дермы. Вкратце, кожные биопсии тщательно промывают в ледяной дН 2 O после удаления жира, соединительную ткань, и волосы. Образцы кожи лишены неколлагеновых белков и полисахаридов с использованием 0,5 М ацетата натрия и высокоскоростное Настольные гомогенизатора. Коллаген из остаточных твердых веществ впоследствии экстрагируют 0,075 М буфере цитрата натрия, используя гомогенизатор. Эти экстракты очищают, используя 100000 МВт отсечения центробежные фильтры, которые дают COL1 препараты сопоставимой или высшего качества в коммерческих продуктов или полученными с использованием традиционных процедур. Мы ожидаем, этот метод будет способствовать использование аутогенно производного COL1 для множества исследований и клинического применения.

Этот протокол изоляции COL1 требуется около 2 ч и 15 мин для завершения. На рисунке 1 показана схема с описанием основные шаги этой процедуры. Подготовка образца и выполнения 7 циклов высокоскоростных волнений и полоскания с ацетата натрия занимает около 35 мин (1А-C). Выполнение одно...

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin at JoVE.com

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Улучшенный способ по подготовке I типа коллагена из кожи

Традиционные процедуры выделения растворимого типа 1 коллагена (COL1) потребуется около 10 дней с начала до конца из-за длительных инкубации буферных и трудоемких resuspensions фибрилл. Здесь мы описываем средства для очистки COL1 от небольших кожных биопсий менее чем за 3 часа.

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Органотипической коллагена I Анализ: ковкий платформы для оценки сотовый Поведение в 3-мерной Контекст

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Построение коллагена Гидрогель для доставки стволовых клеток, загруженных Хитозан микросфер

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Постоянное давление контролируемый методом экструзии для приготовления наноразмерных липидных везикул

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Улучшенная способ получения человеческой клетки на основе, Связаться Модель гематоэнцефалического барьера

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Визуализация денатурированного коллагена Пряди<em&gt; В естественных условиях</em&gt; И<em&gt; Экс естественных</em&gt; Через Фото-срабатывает гибридизации скованного Коллаген Mimetic пептидов

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

An Improved Mechanical Testing Method to Assess Bone-implant Anchorage

Улучшенная Механические испытания Метод для оценки костного имплантата Анкоридж

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Инженерные 3D Cellularized Коллаген Гели для сосудистой регенерации ткани

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Измельченной ткани в сжатом коллагена: Сотовый содержащих Biotransplant одноместным-ступенчатую реконструктивной Ремонт

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Подготовка 3D Коллаген Гели и микроканалов для изучения 3D взаимодействий<em&gt; В Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Оценки распространения кератиноцитов на двух - и трехмерных типа коллаген субстратов

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...