Name: an improved method for the preparation of type i collagen from skin
Uploaded: 2014-01-21T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett forskningsanslag från National Institutes of Health (HL068915 till DBC), en ny forskare Award från Thrasher forskningsfonden (till CAP), en Grant-i-Stöd från American Heart Association (12GRNT11910008 till DBC) , ett forskningsbidrag från Barnens Heart Foundation (till DBC), och donationer till Boston Barnsjukhus Cardiac Conduction fonden, Ryan Family Endowment, samt av David Pullman.

Här kommer vi att visa att isoleringen av COL1 från lammskinn. Som skrivet, kan detta protokoll också användas för att framgångsrikt isolera COL1 från kanin och mänsklig hud. 1. Förbered Dermal Prov <ol><li> Jämvikta alla reagenser till 4 ° C före användning. </li><li> Skölj huden prov (25-50 g) i iskall dH 2 O och ta bort all ull, päls eller hår med hårborttagningskräm. </li><li> Använd en enda kant rakblad för att skrapa provet fri från bindväv och fett. ...

<ol>
	<li>Nageotte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coagulation+fibrillaire+in+vitro+du+collag&#232;ne+dissous+dans+un+acide+dilu&#233;.">Coagulation fibrillaire in vitro du collag&#232;ne dissous dans un acide dilu&#233;.</a> CR hebd. s&#233;ances Acad. Sei. 184, 115 (1927).</li><li>Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+investigation+of+the+structure+of+collagen.">Electron microscope investigation of the structure of collagen.</a> J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).</li><li>Choi, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+conduction+through+engineered+tissue.">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am. J. Pathol. 169, 72-85 (2006).</li><li>Pacak, C. A., Cowan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+myogenic+engineered+tissue+constructs.">Fabrication of myogenic engineered tissue constructs.</a> J. Vis. Exp. (27), (2009).</li><li>Cliche, S., Amiot, J., Avezard, C., Gariepy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+characterization+of+collagen+with+or+without+telopeptides+from+chicken+skin.">Extraction and characterization of collagen with or without telopeptides from chicken skin.</a> Poultry Sci. 82, 503-509 (2003).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use,+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications.">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).</li><li>Seifter, S., Gallop, P., Colowick, S., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+properties+of+soluble+collagens.">Preparation and properties of soluble collagens.</a> Methods in Enzymology. , (1963).</li><li>Pacak, C. A., Powers, J. M., Cowan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrarapid+purification+of+collagen+type+I+for+tissue+engineering+applications.">Ultrarapid purification of collagen type I for tissue engineering applications.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 879-885 (2011).</li><li>Ohan, M. P., Dunn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+stabilizes+collagen+sterilized+with+gamma+irradiation.">Glucose stabilizes collagen sterilized with gamma irradiation.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1188-1195 (2003).</li><li>Tyan, Y. C., Liao, J. D., Lin, S. P., Chen, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+the+sterilization+effect+of+gamma+ray+irradiation+of+immobilized+collagen+polypropylene+nonwoven+fabric+surfaces.">The study of the sterilization effect of gamma ray irradiation of immobilized collagen polypropylene nonwoven fabric surfaces.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1033-1043 (2003).</li><li>Ber, S., Torun Kose, G., Hasirci, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+tissue+engineering+on+patterned+collagen+films:+an+in+vitro+study.">Bone tissue engineering on patterned collagen films: an in vitro study.</a> Biomaterials. 26, 1977-1986 (2005).</li><li>Liu, Y., Sun, S., Singha, S., Cho, M. R., Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+femtosecond+laser+patterning+of+collagen+for+directed+cell+attachment.">3-D femtosecond laser patterning of collagen for directed cell attachment.</a> Biomaterials. 26, 4597-4605 (2005).</li><li>Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vascular+smooth+muscle+cells+by+micropatterning.">Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 883-890 (2003).</li><li>Leighton, J., Justh, G., Esper, M., Kronenthal, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-coated+cellulose+sponge:+three+dimensional+matrix+for+tissue+culture+of+Walker+tumor+256.">Collagen-coated cellulose sponge: three dimensional matrix for tissue culture of Walker tumor 256.</a> Science. 155, 1259-1261 (1967).</li></ol>

En avgörande komponent för att denna metod är den upprepade effektiv komprimering av den dermala provet för att avlägsna överskott av vätska. Det är viktigt att avlägsna så mycket natriumacetat som möjligt i steg 2,5 genom att komprimera provet. Vi använder en spatel för att kompaktera hud mot sidan av röret, men kunde ostduk också användas, även om detta skulle kräva avlägsnande av provet från röret och öka den tid som krävs för att utföra dessa steg. Likaså är det viktigt att komprimera prov...

I decennier har forskare och kommersiella leverantörer isolerade upplöst COL1 från ett sortiment av vävnadskällor inklusive hud och senor med hjälp av någon variant av en enkel syraextraktion protokoll följt av neutralisering, vilket resulterar i en resuspension av en matris av organiserad Kol1 fibriller som kan användas för en mängd olika biomedicinska tillämpningar 1-4. Det finns många exempel på kliniska tillämpningar för COL1, några av dessa sysselsätter autologously-härledda COL1 eftersom beredningen av detta protein kräver långa extraktioner ta dagar eller veckor att utföra 5-7. Som ett resultat av forskning utredare och läkare använder i allmänhet dyra, kommersiella beredningar av COL1 som är beredda att använda ickemänskliga vävnader såsom råtta, nötkreatur eller svin corium eller med hjälp av hud bort från kadaver eller efter manlig omskärelse. För regenerativa applikationer, att många av dessa produkter uppvisar variabilitet med avseende på deras förmåga bildar fastmatriser eller vävnads konstruktioner som kan stödja cellbindning och tillväxt. Följaktligen finns det ett tydligt behov av en ny standardiserad metod utformad för att snabbt extrahera COL1 från tillgängliga och rikliga autologa vävnadskällor. En sådan metod skulle spara både tid och pengar i forskning miljö där COL1 kunde extraheras från djurmodell av intresse och används för preklinisk testning av tekniska vävnader monterade på kollagenbaserade ställningar. Samtidigt, skulle ha möjlighet att använda ett snabbt-isolerad, autologously härledda COL1 på kliniken öka den totala säkerheten för patienter som annars skulle få allogena eller xenogena preparat. För patienter som får ett autogent preparat, skulle denna strömlinjeformade metoden kraftigt minska intervallet mellan biopsi insamling och kollagen ansökan. Därför sökte vi för att förbättra på en sedan länge etablerad COL1 isolering och reningsmetod med hjälp av höghastighets agitation och storlek-utanförskap centrifugering. Denna metod är enkel att utföra med användning av standardbuffertar och-utrustning som har hittats i många laboratorier. Genom att använda höghastighets agitation, minskar våra protokoll den tid som krävs för att isolera löslig, dermal COL1 från cirka 10 dagar till mindre än 3 tim 8. Viktigt kan denna metod lätt utföras i klinisk miljö för att förbereda autologously-härledda COL1 till patienter under en enda uppsättning förfaranden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">FastPrep-24 System</td>
			<td style="width:136px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:147px;">116004500</td>
			<td style="width:139px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:123px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:136px;">Beckman</td>
			<td style="width:147px;">J6-MI</td>
			<td style="width:139px;">Swing bucket rotor to accommodate 50 mL conical tubes at 3200 g.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method for the preparation of type i collagen from skin

Lösliga typ 1 kollagen (COL1) används i stor utsträckning som ett klister substrat för cellkulturer och som en cellulär klätterställning för regenerativa applikationer. Kliniskt är detta protein i stor utsträckning för kosmetisk kirurgi, dermal injektioner, ben ympning, och rekonstruktiv kirurgi. Källorna till COL1 för dessa förfaranden är vanligen icke-mänskliga, vilket ökar risken för inflammation och avvisande samt överföring xenobiotisk sjukdom. Mot bakgrund av detta, skulle en metod för att snabbt och effektivt rena COL1 från begränsade mängder autologously-härledda vävnader kringgå många av dessa frågor, men standardisoleringsprotokoll är långa och kräver ofta stora mängder av kollagena vävnader. Här visar vi en effektiv COL1 extraktionsmetod som minskar den tid som behövs för att isolera och rena detta protein från cirka 10 dagar till mindre än 3 tim. Vi valde dermis som vår vävnadskälla på grund av sin tillgänglighet under många kirurgiska ingrepp. Thans metod använder traditionella utsugs buffertar i kombination med kraftfulla agitation och centrifugal-filtrering för att erhålla högt rent, lösligt COL1 från små mängder av läderhuden. I korthet är dermal biopsier tvättas noggrant i iskallt dH 2 O efter att ta bort fett, bindväv, och hår. Hudproven strippas av noncollagenous proteiner och polysackarider med användning av 0,5 M natriumacetat och en hög hastighet bänkhomogenisator. Kollagen från kvarvarande fasta substanser extraheras därefter med en 0,075 M natriumcitrat-buffert med användning av homogenisator. Dessa extrakt renas med hjälp av 100.000 MW cut-off centrifugal filter som ger Kol1 beredningar av jämförbar eller bättre kvalitet till kommersiella produkter eller de som erhållits med hjälp av traditionella förfaranden. Vi räknar med den här metoden kommer att underlätta utnyttjandet av autologously härledd COL1 för en mängd forskning och kliniska tillämpningar.

Denna COL1 isolering protokollet kräver cirka 2 timmar och 15 minuter att slutföra. Figur 1 visar ett schematiskt diagram som sammanfattar de viktigaste stegen i detta förfarande. Preparering av provet och utföra de 7 cykler av höghastighets agitations och sköljer med natriumacetat tar ungefär 35 min (figurerna 1A-C). Utföra en agitation och skölj cykel med dH 2 O tar ca 5 minuter (figur 1D och 1E). Lägga natriumcitrat och utsätta provet för en om...

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin at JoVE.com

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

En förbättrad metod för framställning av typ I kollagen från huden

Traditionella förfaranden för isolering av lösligt typ 1 kollagen (COL1) kräver ca 10 dagar från början till slut på grund av långa buffert inkubationer och mödosamma resuspensions av fibriller. Här beskriver vi ett sätt att rena COL1 från små dermala biopsier på mindre än tre timmar.

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Organotypisk Kollagen I Analys: en formbar plattform att bedöma Cell Beteende i en 3-dimensionell sammanhang

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Konstruera en Kollagen Hydrogel för leverans av Stem Cell-laddad kitosanmikrosfärer

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Konstant tryck kontrollerad Extrusion metod för framställning av Nano-storlek lipidvesiklar

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Förbättrad metod för framställning av en human cellbaserad, Kontakta modell av blod-hjärnbarriären

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Imaging Denaturerat Kollagen Strands<em&gt; In vivo</em&gt; Och<em&gt; Ex vivo</em&gt; Via Foto-utlöst Hybridisering av Caged Collagen Mimetic peptider

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

An Improved Mechanical Testing Method to Assess Bone-implant Anchorage

En förbättrad mekanisk testning metod för att bedöma Bone-implantatet Anchorage

Recent advances in material science have led to a substantial increase in the topographical complexity of implant surfaces, both on a micro- and a ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingenjörs 3D Cellularized kollagengeler för kärlvävnad Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Malet Tissue i Compressed Kollagen: en cell som innehåller BioTransplant för enkel iscensatt rekonstruktiv Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Beredning av 3D koUagengeler och mikro för studien av 3D interaktioner<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Utvärdering av keratinocyter spridning på två - och tredimensionella typ I kollagen substrat

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...