Name: isolation and culture of endothelial cells from the embryonic forebrain
Uploaded: 2014-01-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da una Alleanza Nazionale per la Ricerca sulla Depressione e schizofrenia (NARSAD) Young Investigator Award e National Institutes of Health concedere R01NS073635 AV.

1. Preparazione dei reagenti e soluzioni <ol><li> Rivestimento di 35 mm piatto di coltura: collagene di tipo 1 soluzione viene fornito in soluzione acquosa in 20 mM di acido acetico (~ 100 mg di proteina / fiala). Diluire un volume adeguato di soluzione di collagene per una concentrazione di lavoro del 0,01% con acqua di coltura tissutale sterile grado. Piatti cappotto con 1 ml di soluzione di collagene per 3-4 ore a temperatura ambiente (RT) o 37 ° C, o durante la notte a 2-8 ° C. Rimuovere la soluzione in eccesso ...

<ol>
	<li>Shen, Q., S, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulate+self-renewal+and+expand+neurogenesis+of+neural+stem+cells.">Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells.</a> Science. 304, 1338-1340 (2004).</li><li>Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+system+to+study+interactions+between+endothelial+cells+and+neural+cells+of+the+developing+central+nervous+system.">A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system.</a> BMC Neurosci. 8, 3 (2007).</li><li>Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+primary+neural+progenitor+and+endothelial+cells+in+a+macroporous+gel+promotes+stable+vascular+networks+in+vivo.">Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo.</a> 19, 1469-1485 (2008).</li><li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain.">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).</li><li>Vasudevan, A., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+the+embryonic+CNS:+a+new+twist+on+an+old+tale.">Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale.</a> Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).</li><li>Won, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+vascular+networks+synchronize+GABA+neuron+migration+in+the+embryonic+forebrain.">Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain.</a> Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).</li><li>Dong, Q. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants.">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).</li><li>Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+colony+stimulation+factor-1+receptor+results+in+loss+of+microglia,+disrupted+brain+development+and+olfactory+deficits.">Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+neurons+from+medial+ganglionic+eminence+disperse+in+adult+and+embryonic+brain.">Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain.</a> 2, 461-466 (1999).</li><li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling.">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li><li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+form+a+migratory+scaffold+in+the+rostral+migratory+stream.">Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li></ol>

Funzione PVEC di sono fisiologicamente più rilevanti rispetto adulte cellule endoteliali cerebrali e EC da altre fonti di tessuto per gli studi incentrati sulle interazioni neurovascolari e anche avere un potenziale terapeutico. Per la preparazione funzione PVEC, è principio fondamentale con dissezione di lavorare velocemente per ottenere una buona redditività poiché le cellule morte possono legarsi in modo aspecifico a microsfere CD31. Inoltre, se cella singola sospensione non viene raggiunto prima della fase di ma...

Angiogenesi, neurogenesi e migrazione neuronale sono eventi critici nel sistema nervoso centrale (SNC) lo sviluppo, la riparazione e la rigenerazione. Diversi studi eleganti hanno dimostrato che le cellule endoteliali stimolano la proliferazione neuronale e viceversa attraverso il rilascio di fattori solubili e per contatto diretto. Abbiamo trovato curioso che nella maggior parte di questi studi 1-3, mentre progenitori neuronali / cellule staminali neurali sono isolate dal cervello embrionale, sono co-coltivate con cellule endoteliali da cervello adulto, altre fonti tessuti adulti, o con linee di cellule endoteliali. Ciò può essere dovuto in parte alle difficoltà tecnici associati isolando e coltivando popolazioni pure di cellule endoteliali dal cervello embrionale. Tuttavia, l&#39;angiogenesi, la neurogenesi e migrazione neuronale sono eventi concomitanti che si verificano in ordini di grandezza più robusta nel cervello embrionale rispetto al normale cervello adulto. La rete vascolare periventricolare del embryonic proencefalo (telencefalo) proviene da una nave situata all&#39;interno dei gangli basali primordium e si sviluppa in forma di un gradiente ordinata da ventrale a quella dorsale telencefalo dal giorno embrionale 11 (E11) 4,5. Questo plesso delle navi della rete vascolare periventricolare sono distinti da navi piale basato su origini, posizione anatomica, modelli di crescita, e la regolamentazione dello sviluppo 4,5. La direzione di propagazione della sfumatura angiogenesi periventricolare corrisponde alla telencefalico trasversale gradiente neurogenetico. All&#39;interno del telencefalo, il gradiente angiogenesi periventricolare e la pendenza dei neuroni GABA migrazione sovrapposizioni tangenzialmente spazialmente pure 6. Per quanto riguarda i tempi, il gradiente angiogenesi è in anticipo rispetto al neurogenetico gradiente e GABA neurone gradiente di circa un giorno. Così, le cellule endoteliali periventricolare sono spazialmente e temporalmente ben posizionati per fornire spunti critici per sostenere la neurogenesi telencefalica eneuronale 4,6 migrazione. Pertanto, l&#39;uso delle embrionali cellule endoteliali periventricolare in esperimenti di co-coltura con cellule progenitrici e / o neuroni neuronali potrebbe fornire un modello più favorevole per lo studio delle interazioni neurovascolari e lo sviluppo di nuovi viali per il trattamento di malattie neurodegenerative o lesioni cerebrali traumatiche / ischemico. Sottolineiamo l&#39;importanza di eliminare la membrana piale, non solo per limitare la contaminazione delle cellule epiteliali, ma anche per separare le cellule endoteliali piale che sono molecolarmente e funzionalmente distinta dalle cellule endoteliali della periventricolare rete vascolare 4,6 (PVECs denominati per distinguerli da piale EC) . Qui, descriviamo il metodo che usiamo abitualmente nel nostro laboratorio per ottenere una resa ricca e pura di PVECs. Queste cellule endoteliali sono preparati da forebrains embrionali isolate da un singolo mouse al momento giusto incinta. Essi possono essere ampliati, subcoltivate e congelati giù con successo per un uso futuro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="768">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">DNase I</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">D-4527</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen, Type 1 solution from rat tail </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS</td>
			<td>Quality Biologicals</td>
			<td style="width:147px;">114057-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M4055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS column</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD31 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-097-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACS multi stand</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer 70 &#181;m</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic and antimycotic solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase/Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">DMEM </td>
			<td style="width:183px;">Lonza</td>
			<td>12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm culture dish</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 ml falcon tube </td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml falcon tube</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">ECCM kit</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:147px;">355054</td>
			<td>Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF and Soybean Trypsin Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:147px;">354006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RBECGM</td>
			<td style="width:183px;">Cell applications </td>
			<td style="width:147px;">R819-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM F12 </td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glutamax</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">305050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">tissue culture grade water</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">15230162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">0.25% Trypsin</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Soyabean trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:147px;">5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Matrigel</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:147px;">354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qtracker 655 Cell Labeling Kit</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">Q25021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">C10608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Biotinylated Isolectin B4 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">L2140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Anti-Von Willebrand factor</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Anti-CD31/PECAM-1</td>
			<td style="width:183px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:147px;">550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Vectashield Hardset Mounting media with DAPI</td>
			<td style="width:183px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:147px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Ketamine</td>
			<td style="width:183px;">Butler Schein Animal Health Supply</td>
			<td style="width:147px;">44028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Xylazine</td>
			<td style="width:183px;">Lloyd Laboratories</td>
			<td style="width:147px;">1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:183px;">Motic</td>
			<td style="width:147px;">SMZ-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">hemocytometer</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">inverted microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus CK-40</td>
			<td style="width:147px;">CK-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Flouroscent microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus FSX-100</td>
			<td style="width:147px;">FSX-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Fine forceps</td>
			<td style="width:183px;">Roboz surgical instrument</td>
			<td>7 inox</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Fine microtip scissors</td>
			<td style="width:183px;">Roboz surgical instrument</td>
			<td>RS5611</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of endothelial cells from the embryonic forebrain

Cellule endoteliali cerebrali embrionali possono servire come strumento importante nello studio dell&#39;angiogenesi e sviluppo neurovascolari e interazioni. Le due reti vascolari del prosencefalo embrionale, piale e periventricolare, sono spazialmente distintivo e avere origini e modelli di crescita. Le cellule endoteliali delle reti vascolari piale e periventricolare hanno profili di espressione genica e funzioni uniche. Qui vi presentiamo un protocollo step-by-step per l&#39;isolamento, la cultura, e la verifica delle popolazioni pure di cellule endoteliali dalla rete vascolare periventricolare (PVECs) del prosencefalo embrionale (telencefalo). In questo approccio, telencefalo privo di membrana piale ottenuto da giorno embrionale 15 topi è macinata, digerito con collagenasi / dispasi, e disperso meccanicamente in una sospensione di cellule singole. PVECs sono purificati dalla sospensione cellulare mediante la selezione positiva con l&#39;anticorpo anti-CD-31/PECAM-1 coniugato con microsfere con un forte magneticometodo di separazione. Cellule purificate sono coltivate su collagene 1 rivestite piatti di coltura di cellule endoteliali terreno di coltura fino a quando diventano confluenti e l&#39;ulteriore subcoltivate. PVECs ottenuto con questo protocollo mostra ciottoli e fenotipi fusiformi, come visualizzato dal contrasto di fase microscopia ottica e microscopia a fluorescenza. Purezza delle culture funzione PVEC è stato stabilito con i marcatori delle cellule endoteliali. Nelle nostre mani, questo metodo affidabile e coerente produce popolazioni pure di PVECs. Questo protocollo andrà a beneficio studi volti a ottenere intuizioni meccanicistica nel prosencefalo angiogenesi, comprendere le interazioni funzione PVEC e trasversali colloqui con tipi di cellule neuronali e detiene un enorme potenziale per l&#39;angiogenesi terapeutica.

La caratterizzazione fenotipica di PVECs dal giorno 1-12 è mostrata da contrasto di fase microscopia ottica (Figura 2). Le cellule attaccate al piatto al giorno 1 mostra morfologia caratteristica di divisione cellulare (Figura 2A). Tra 5-8 giorni, PVECs transizione dalla pietra, affastellate al mandrino morfologia forma tipica per le cellule endoteliali e più simile al suo stato in vivo (Figure 2B e 2C). Di giorno 12 la cultura funzione PVEC ...

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Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Questo video mostra una strategia semplice e affidabile per la preparazione di colture pure di cellule endoteliali del prosencefalo embrionale entro 10-12 giorni e sarà utile per la ricerca focalizzata su molti aspetti della angiogenesi cerebrale.

Isolamento e coltura di cellule endoteliali dal embrionali Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

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Ricerca

Neuroscienze

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L&#39;isolamento e la coltura di cellule staminali neurali Crest di follicoli dei capelli umani

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

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Isolamento e la coltura di neuroni ippocampali da topi prenatali

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Isolamento e la coltura di cellule embrionali neuronali di ratto: un protocollo veloce

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

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Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

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Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolamento di cellule primarie murini cervello microvascolare endoteliali

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Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

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Isolamento e la coltura di adulti neurali cellule staminali dal Subcallosal Zona mouse

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...