Name: isolation and characterization of chimeric human fc-expressing proteins using protein a membrane adsorbers and a streamlined workflow
Uploaded: 2014-01-08T14:15:00
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Les auteurs tiennent à remercier M. Luis F. Delgadillo (Département de génie chimique et biomoléculaire, Université de l’Ohio), M. Matthew H. Williams (Département de génie chimique et biomoléculaire, Université de l’Ohio) et M. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women’s Hospital et Harvard Medical School) pour leur assistance technique d’experts. Les auteurs souhaitent également remercier les étudiants che 404/BME 504 de l’hiver 2011 et de l’automne 2012 CHE 4830/BME 5830 (département de génie chimique et biomoléculaire et de génie biomédical, Université de l’Ohio) pour leurs conseils techniques et leurs discussions. Ce travail a été soutenu par la subvention d’instrumentation de recherche majeure CBET-1039869 (MMB) de la National Science Foundation (NSF), la subvention de recherche CBET-1106118 (MMB), la subvention de recherche A050422 de la Fondation de la dermatologie (SRB), la subvention NCI des National Institutes of Health (NIH) 1R15CA161830-01 (MMB), la bourse postdoctorale NIH Kirschstein-NRSA F32CA144219-01A1 (SRB), la subvention NIH/NCI R01CA173610 (CJD) et la subvention R01AT004628 (CJD) des NIH NCCAM.

1. Vérifiez l’affinité pour la protéine A
<ol><li>Vérifier que la protéine exprimant Fc (protéine de fusion recombinante ou anticorps IgG, ci-après appelée « protéine ») a une affinité acceptable pour la protéine A14-17 avant d’utiliser l’adsorbeur membranaire de la protéine A, et tester la présence de la protéine dans la solution mère(p. ex. surnageant de culture cellulaire clarifié par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min aux cellules en suspension de granulés). Utili...

<ol>
	<li>Gagnon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+trends+in+antibody+purification.">Technology trends in antibody purification.</a> J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).</li><li>Gottschalk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioseparation+in+antibody+manufacturing:+The+good,+the+bad+and+the+ugly.">Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly.</a> Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).</li><li>Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+and+purification+process+development+for+monoclonal+antibody+production.">Recovery and purification process development for monoclonal antibody production.</a> MAbs. 2, 480-499 (2010).</li><li>Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+antibody+purification.">Future of antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).</li><li>Boi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+adsorbers+as+purification+tools+for+monoclonal+antibody+purification.">Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).</li><li>Cuatrecasas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+by+affinity+chromatography.+Derivatizations+of+agarose+and+polyacrylamide+beads.">Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads.</a> J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).</li><li>Shukla, A. A., Gottschalk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+disposable+technologies+for+biopharmaceutical+manufacturing.">Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing.</a> Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).</li><li>Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+a+new+protein+a+affinity+membrane+for+the+primary+recovery+of+antibodies.">Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies.</a> Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).</li><li>Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+immunoglobulins+g+by+protein+a/g+afinity+membrane+chromatography.">Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography.</a> J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).</li><li>Thommes, J., Etzel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatives+to+chromatographic+separations.">Alternatives to chromatographic separations.</a> Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).</li><li>Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+and+simulation+of+affinity+membrane+adsorption.">Modelling and simulation of affinity membrane adsorption.</a> J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).</li><li>van Beijeren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-aided+process+design+of+affinity+membrane+adsorbers:+A+case+study+on+antibodies+capturing.">Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing.</a> Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).</li><li>Lauriere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semidry+electroblotting+system+efficiently+transfers+both+high-+and+low-molecular-weight+proteins+separated+by+sds-page.">A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page.</a> Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).</li><li>Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+antibodies+using+affinity+chromatography.">Purification of antibodies using affinity chromatography.</a> Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).</li><li>Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+a+from+staphylococcus+aureus.+Its+isolation+by+affinity+chromatography+and+its+use+as+an+immunosorbent+for+isolation+of+immunoglobulins.">Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins.</a> FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).</li><li>Hober, S., Nord, K., Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+a+chromatography+for+antibody+purification.">Protein a chromatography for antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).</li><li>Kronvall, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+surface+component+in+group+a,+c,+and+g+streptococci+with+non-immune+reactivity+for+immunoglobulin+g.">A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g.</a> J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).</li><li>Cedeno-Laurent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+nascent+galectin-1+chimeric+molecule+for+studying+the+role+of+leukocyte+galectin-1+ligands+and+immune+disease+modulation.">Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation.</a> J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+t4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+Procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Coomassie+brilliant+blue+g250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrylamide+gels.">The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Cedeno-Laurent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+inhibition+of+galectin-1-binding+carbohydrates+accentuates+antitumor+immunity.">Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity.</a> J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer.">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (33), (2009).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+Bradford+Protein+Assay.">Linearization of the Bradford Protein Assay.</a> J. Vis. Exp. (38), (2010).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analyses+of+all+Influenza+Type+A+Viral+Hemagglutinins+and+Neuraminidases+using+Universal+Antibodies+in+Simple+Slot+Blot+Assays.">Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays.</a> J. Vis. Exp. (50), (2011).</li></ol>

Le protocole décrit ci-dessus a été développé pour isoler et caractériser rapidement une protéine de fusion chimérique exprimant fc humain (Gal-1hFc), sans compromettre de manière significative la récupération de produit ou gonfler le coût. Les composants clés du flux de travail rationalisé sont un adsorbeur à membrane de protéine A pour l’isolement, et le transfert semi-à-papier et l’immunoblotting assisté par vide pour la caractérisation par western blotting.
La dimin...

L’isolement des anticorps et des protéines recombinantes exprimant des fragments de l’immunoglobuline G (IgG) Fc à partir de surnageants de culture cellulaire et de solutions cellulaires lysées diluées peut être accompli en utilisant la chromatographie d’affinité de la protéine A. Dans les laboratoires de sciences fondamentales et d’ingénierie et l’industrie, les colonnes remplies d’agarose, de verre ou de perles polymères revêtues de protéines poreuses A sont les plus couramment utilisées pour la chromatographie d’affinité, malgré des coûts financiers élevés et de longs délais de traitement1-3. Il est bien connu que la chromatographie d’affinité représente le plus grand goulot d’étranglement des dépenses et du traitement en laboratoire et en milieu industriel2,4. En conséquence, de nombreuses améliorations ont été développées pour réduire les coûts et le temps de traitement sans sacrifier la récupération globale du produit à partir du train de processus1,2,5-7. La chromatographie d’affinité utilisant une protéine membranaire de protéines2,5,7-10est particulièrement prometteuse pour l’isolement des anticorps et autres protéines exprimant fc. Alors que la capture fc en chromatographie sur colonne est limitée en diffusion(c’est-à-dire que la protéine exprimant Fc doit diffuser dans et à travers les pores internes pour atteindre la majorité de la protéine A) avec une chute de pression élevée à travers la colonne, le transport de masse dans les adsorbeurs membranaires est entraîné par la convection en vrac, ce qui permet d’éviter les limitations de diffusion8,9,11,12. De plus, la chute de pression à travers l’adsorbeur membranaire est faible, permettant ainsi des débits de perfusion plus rapides par rapport aux colonnes bourrées de perles8,9,11,12. Ainsi, pour l’isolement à l’échelle du laboratoire, la chromatographie sur membrane devrait réduire le temps d’isolement de plusieurs heures et augmenter la capture du produit par rapport à la chromatographie sur colonne. En outre, des modèles mathématiques pour l’adsorption d’IgG dans les adsorbeurs membranaires ont été proposés8,9,11,12, permettant ainsi aux utilisateurs finaux de prédire les performances en laboratoire.
Un autre goulot d’étranglement dans les laboratoires de sciences fondamentales et d’ingénierie est la caractérisation de la protéine exprimant Fc. Cependant, le choix de méthodes appropriées pour effectuer des essais de caractérisation, comme les western blots, peut réduire considérablement le temps consacré aux essais de produits. Par exemple, le transfert semi-dentaire dans un système tampon discontinu peut accomplir le transfert électrophorétique de protéines d’un gel SDS-PAGE vers une membrane de polyvinyl difluoridine (PVDF) en quelques minutes, par opposition à un transfert de 1 à 2 heures en réservoir (humide) dans un système tampon continu13.
Un protocole rapide, peu coûteux, et efficace pour isoler et caractériser une protéine de fusion chimérique exprimant un fragment de Fc d’IgG humain est décrit ci-dessus. La plupart des équipements sont facilement disponibles dans les laboratoires standard de sciences biomédicales fondamentales, de biologie, de chimie et de génie (bio)chimique, et tous les réactifs sont disponibles dans le commerce. Bien que des résultats représentatifs aient été générés à partir de l’isolement et de la caractérisation d’une protéine murine galectin-1/human Fc de fusion (Gal-1hFc), le protocole rationalisé peut être appliqué à l’isolement d’autres molécules qui possèdent un fragment de Fc, telles que des anticorps, des fragments de Fc eux-mêmes, ou d’autres protéines de fusion de Fc. Nos améliorations ont considérablement réduit le temps de traitement (aussi peu que 4 heures, mais plus généralement ~ 9 heures, par rapport à plus de 20 heures de travail) tout en obtenant une récupération de produit similaire ou améliorée par rapport aux méthodes standard.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="822">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml)&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sartorius-Stedim</td>
			<td style="width:147px;">93PRAP06HB-12--A</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml</td>
			<td style="width:191px;">Millipore</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td>Use 15 ml volume if needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Sterile vacuum filter unit, 0.22 &#181;m, 500 ml</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">10 ml Syringes with Luer Lock tips</td>
			<td>BD</td>
			<td>301604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">30 ml Syringes with&#160; Luer Lock tips</td>
			<td>BD</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>WU-95903-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Snap i.d. antibody collection tray</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>WBAVDABTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Snap i.d. single well blot holder</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>WBAVDBH01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Elution buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Tris, ultra pure</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>819623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:313px;">DPBS with Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Human Fc</td>
			<td>Bethyl Research Laboratories</td>
			<td>&#160;P80-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Anti-human Fc-APC</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>109136170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Anti-human Fc-AP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-5018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Alkaline phosphatase substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:147px;">S3841</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene)</td>
			<td>BD</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-2226</td>
			<td style="width:173px;">A peristaltic pump is also acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Protein gel electrophoresis system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>552BR094876</td>
			<td style="width:173px;">Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Semidry blotter&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td style="width:147px;">690BR006163</td>
			<td style="width:173px;">Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:313px;">SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system</td>
			<td style="width:191px;">EMD Millipore</td>
			<td>WBAVDBASE</td>
			<td style="width:173px;">An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of chimeric human fc-expressing proteins using protein a membrane adsorbers and a streamlined workflow

La purification à l’échelle du laboratoire à l’échelle industrielle des biomolécules des surnageants de culture cellulaire et des solutions cellulaires lysées peut être réalisée à l’aide de la chromatographie d’affinité. Bien que la chromatographie d’affinité utilisant des billes d’agarose A poreuses emballées dans des colonnes soit sans doute la méthode la plus courante d’isolement à l’échelle du laboratoire d’anticorps et de protéines recombinantes exprimant des fragments fc d’IgG, cela peut être un processus long et coûteux. Les contraintes de temps et financières sont particulièrement intimidantes dans les petits laboratoires de sciences fondamentales qui doivent récupérer des centaines de microgrammes à des quantités de milligrammes de protéines à partir de solutions diluées, mais qui n’ont pas accès à des systèmes d’administration de liquides à haute pression et / ou à du personnel spécialisé dans les bioséparations. De plus, la quantification et la caractérisation des produits peuvent également allonger excessivement le temps de traitement sur plusieurs jours de travail et gonfler les dépenses (consommables, salaires, etc.). Par conséquent, un protocole rapide, peu coûteux, mais efficace est nécessaire pour l’isolement à l’échelle de laboratoire et la caractérisation des anticorps et d’autres protéines possédant un fragment de Fc. À cette fin, nous avons conçu un protocole qui peut être complété par un personnel technique à expérience limitée en moins de 9 heures (environ une journée de travail) et aussi rapidement que 4 heures, par opposition aux méthodes traditionnelles qui exigent plus de 20 heures de travail. La plupart des équipements requis sont facilement disponibles dans les laboratoires standard de science biomédicale, de biochimie et de génie (bio)chimique, et tous les réactifs sont disponibles dans le commerce. Pour démontrer ce protocole, on présente des résultats représentatifs dans lesquels galectin-1 murin chimérique fusionné au Fc humain (Gal-1hFc) du surnageant de culture cellulaire utilisant un adsorbeur de membrane de la protéine A. Gal-1hFc purifié a été quantifié utilisant une procédure occidentale accélérée d’analyse buvarde et caractérisé utilisant la cytométrie d’écoulement. Le flux de travail rationalisé peut être modifié pour d’autres protéines exprimant fc, telles que les anticorps, et/ou modifié pour intégrer d’autres méthodes de quantification et de caractérisation.

Le protocole simplifié pour l’isolement et la caractérisation des protéines exprimant Fc est couramment utilisé pour traiter la galectine-1 murine chimérique fusionnée au Fc humain (Gal-1hFc) à partir de surnageants dilués de culture cellulaire. L’organigramme de la figure 2 illustre le flux de travail et l’heure de chaque étape du protocole. Pour un lot typique de 300 ml de surnageant, le temps de traitement total est d’environ 9 heures lorsque le test facultatif de cytométrie en flux ...

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Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Par rapport à la chromatographie d’affinité traditionnelle utilisant des colonnes remplies de perles d’agarose de protéine A, les adsorbeurs membranaires de protéine A peuvent accélérer considérablement l’isolement à l’échelle du laboratoire des anticorps et d’autres protéines exprimant des fragments Fc. Des méthodes d’analyse et de quantification appropriées peuvent accélérer davantage le traitement des protéines, permettant d’isoler et de caractériser en une journée de travail, au lieu de plus de 20 heures de travail.

Isolation et caractérisation de protéines humaines chimériques exprimant fc à l’aide d’adsorbeurs membranaires de protéine a et d’un flux de travail rationalisé

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

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