Name: isolation and characterization of chimeric human fc-expressing proteins using protein a membrane adsorbers and a streamlined workflow
Uploaded: 2014-01-08T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow at JoVE.com

लेखक विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए श्री लुइस एफ डेलगैडिलो (रासायनिक और बायोमॉलिकुलर इंजीनियरिंग, ओहियो विश्वविद्यालय), श्री मैथ्यू एच विलियम्स (रासायनिक और बायोमॉलिक्यूलर इंजीनियरिंग विभाग, ओहियो विश्वविद्यालय) और डॉ फिलिबर्टो सेडेनो-लॉरेंट (ब्रिघम और महिला अस्पताल और हार्वर्ड मेडिकल स्कूल) को विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं । लेखकों को भी तकनीकी सलाह और चर्चा के लिए शीतकालीन २०११ चे 404/BME ५०४ और पतन २०१२ चे 4830/BME ५८३० छात्रों (रासायनिक और जैव आणविक इंजीनियरिंग और जैव चिकित्सा इंजीनियरिंग कार्यक्रम, ओहियो विश्वविद्यालय के विभाग) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को नेशनल साइंस फाउंडेशन (एनएसएफ) मेजर रिसर्च इंस्ट्रूमेंटेशन ग्रांट सीबीईटी-1039869 (एमएमबी), एनएसएफ सीबीईटी-1106118 (एमएमबी), डर्मेटोलॉजी फाउंडेशन रिसर्च ग्रांट ए050422 (एसआरबी), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) एनसीआई ग्रांट 1R15CA161 द्वारा समर्थित किया गया था । 830-01 (एमएमबी), एनआईएच किर्श्स्टीन-एनआरएसए पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप F32CA144219-01A1 (एसआरबी), एनआईएच/एनसीआई R01CA173610 (CJD), और NIH NCCAM अनुदान R01AT004628 (CJD) ।

1. प्रोटीन ए के लिए आत्मीयता सत्यापित करें
<ol><li>सत्यापित करें कि एफसी-एक्सप्रेसिंग प्रोटीन (रीकॉम्बिनेंट फ्यूजन प्रोटीन या आईजीजी एंटीबॉडी, इसके बाद "प्रोटीन" के रूप में संदर्भित) प्रोटीन ए14-17 प्रोट?...

<ol>
	<li>Gagnon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+trends+in+antibody+purification.">Technology trends in antibody purification.</a> J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).</li><li>Gottschalk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioseparation+in+antibody+manufacturing:+The+good,+the+bad+and+the+ugly.">Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly.</a> Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).</li><li>Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+and+purification+process+development+for+monoclonal+antibody+production.">Recovery and purification process development for monoclonal antibody production.</a> MAbs. 2, 480-499 (2010).</li><li>Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+antibody+purification.">Future of antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).</li><li>Boi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+adsorbers+as+purification+tools+for+monoclonal+antibody+purification.">Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).</li><li>Cuatrecasas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+by+affinity+chromatography.+Derivatizations+of+agarose+and+polyacrylamide+beads.">Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads.</a> J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).</li><li>Shukla, A. A., Gottschalk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+disposable+technologies+for+biopharmaceutical+manufacturing.">Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing.</a> Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).</li><li>Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+a+new+protein+a+affinity+membrane+for+the+primary+recovery+of+antibodies.">Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies.</a> Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).</li><li>Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+immunoglobulins+g+by+protein+a/g+afinity+membrane+chromatography.">Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography.</a> J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).</li><li>Thommes, J., Etzel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatives+to+chromatographic+separations.">Alternatives to chromatographic separations.</a> Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).</li><li>Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+and+simulation+of+affinity+membrane+adsorption.">Modelling and simulation of affinity membrane adsorption.</a> J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).</li><li>van Beijeren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-aided+process+design+of+affinity+membrane+adsorbers:+A+case+study+on+antibodies+capturing.">Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing.</a> Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).</li><li>Lauriere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semidry+electroblotting+system+efficiently+transfers+both+high-+and+low-molecular-weight+proteins+separated+by+sds-page.">A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page.</a> Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).</li><li>Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+antibodies+using+affinity+chromatography.">Purification of antibodies using affinity chromatography.</a> Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).</li><li>Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+a+from+staphylococcus+aureus.+Its+isolation+by+affinity+chromatography+and+its+use+as+an+immunosorbent+for+isolation+of+immunoglobulins.">Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins.</a> FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).</li><li>Hober, S., Nord, K., Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+a+chromatography+for+antibody+purification.">Protein a chromatography for antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).</li><li>Kronvall, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+surface+component+in+group+a,+c,+and+g+streptococci+with+non-immune+reactivity+for+immunoglobulin+g.">A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g.</a> J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).</li><li>Cedeno-Laurent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+nascent+galectin-1+chimeric+molecule+for+studying+the+role+of+leukocyte+galectin-1+ligands+and+immune+disease+modulation.">Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation.</a> J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+t4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+Procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Coomassie+brilliant+blue+g250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrylamide+gels.">The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Cedeno-Laurent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+inhibition+of+galectin-1-binding+carbohydrates+accentuates+antitumor+immunity.">Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity.</a> J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer.">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (33), (2009).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+Bradford+Protein+Assay.">Linearization of the Bradford Protein Assay.</a> J. Vis. Exp. (38), (2010).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analyses+of+all+Influenza+Type+A+Viral+Hemagglutinins+and+Neuraminidases+using+Universal+Antibodies+in+Simple+Slot+Blot+Assays.">Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays.</a> J. Vis. Exp. (50), (2011).</li></ol>

यहां वर्णित प्रोटोकॉल को तेजी से अलग करने और मानव एफसी (Gal-1hFc) को व्यक्त करने वाले एक चिमरिक फ्यूजन प्रोटीन की विशेषता के लिए विकसित किया गया था, जिसमें उत्पाद वसूली या फुलाने की लागत से काफी समझौता किया ग?...

एंटीबोडी और रीकॉम्बिनेंट प्रोटीन का अलगाव कोशिका संस्कृति सुपरनेटेंट और पतला lysed सेल समाधान से इम्यूनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) एफसी के टुकड़ों को व्यक्त करने के लिए प्रोटीन ए आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है। बुनियादी विज्ञान और इंजीनियरिंग प्रयोगशालाओं और उद्योग में, असुरक्षित प्रोटीन ए-लेपित एगर उठे, ग्लास या पॉलीमेरिक मोतियों से भरे स्तंभों का उपयोग आमतौर पर आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी के लिए किया जाता है, उच्च वित्तीय लागत और लंबी प्रसंस्करण समय1-3के बावजूद। यह अच्छी तरह से सराहना की है कि आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी प्रयोगशाला और औद्योगिक सेटिंग्स2,4दोनों में सबसे बड़ा खर्च और प्रसंस्करण बाधा का प्रतिनिधित्व करता है। नतीजतन, प्रक्रिया ट्रेन1,2,5-7से समग्र उत्पाद वसूली का त्याग किए बिना लागत और प्रसंस्करण समय को कम करने के लिए कई सुधार विकसित किए गए हैं। विशेष रूप से एंटीबॉडी और अन्य एफसी-व्यक्त प्रोटीन के अलगाव के लिए वादा करने वाला प्रोटीन ए झिल्ली सोखंबर2,5,7-10का उपयोग करके आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी है। जबकि कॉलम क्रोमेटोग्राफी में एफसी कैप्चर प्रसार-सीमित है(यानी एफसी-व्यक्त प्रोटीन को आंतरिक छिद्रों के माध्यम से और आंतरिक छिद्रों के माध्यम से फैलाना चाहिए प्रोटीन ए के बहुमत तक पहुंचने के लिए) कॉलम में उच्च दबाव ड्रॉप के साथ, झिल्ली adsorbers में बड़े पैमाने पर परिवहन थोक संवहन द्वारा संचालित है, जिसके परिणामस्वरूप प्रसार सीमाओं8,9,11,12से बचने के लिए। इसके अलावा, झिल्ली एसोर्बर में दबाव में गिरावट कम है, जिससे मनका-पैक कॉलम8,9,11,12की तुलना में तेजी से परफ्यूजन प्रवाह दरों की अनुमति मिलती है। इस प्रकार, प्रयोगशाला पैमाने पर अलगाव के लिए, झिल्ली क्रोमेटोग्राफी कई घंटों तक अलगाव के समय को कम करने और कॉलम क्रोमेटोग्राफी की तुलना में उत्पाद कैप्चर को बढ़ाने की भविष्यवाणी की गई है। इसके अलावा, झिल्ली सोखों में आईजीजी सोखना के लिए गणितीय मॉडल8,9,11,12प्रस्तावित किए गए हैं, इस प्रकार अंतिम उपयोगकर्ताओं को प्रयोगशाला में प्रदर्शन की भविष्यवाणी करने की अनुमति दी गई है।
बुनियादी विज्ञान और इंजीनियरिंग प्रयोगशालाओं में एक और अड़चन एफसी व्यक्त प्रोटीन का लक्षण वर्णन है । हालांकि, लक्षण वर्णन परख को पूरा करने के लिए उचित तरीकों का चयन, ऐसे पश्चिमी धब्बे, उत्पाद परीक्षण पर बिताए गए समय को बहुत कम कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, एक असतत बफर सिस्टम में सेमीड्री ट्रांसफर एक एसडीएस-पेज जेल से प्रोटीन के इलेक्ट्रोफोरेटिक हस्तांतरण को मिनटों के एक मामले में पॉलीविनाइल डिफ्लोरिडीन (पीवीडीएफ) झिल्ली में पूरा कर सकता है, जैसा कि एक सतत बफर सिस्टम 13 में टैंक (गीला) हस्तांतरण में1-2घंटा के विपरीत है।
मानव आईजीजी के एफसी टुकड़े को व्यक्त करने वाले एक चिमरिक फ्यूजन प्रोटीन को अलग करने और इसके लिए एक तेजी से, सस्ती और प्रभावी प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। अधिकांश उपकरण मानक बुनियादी जैव चिकित्सा विज्ञान, जीव विज्ञान, रसायन विज्ञान, और (जैव) रासायनिक इंजीनियरिंग प्रयोगशालाओं में आसानी से उपलब्ध है, और सभी अभिकर्मक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। हालांकि प्रतिनिधि परिणाम एक मुरीन गैलेक्टिन-1/मानव एफसी चिमरिक फ्यूजन प्रोटीन (लड़की-1hFc) के अलगाव और लक्षण वर्णन से उत्पन्न हुए थे, सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल अन्य अणुओं के अलगाव पर लागू किया जा सकता है, जिनके पास एक एफसी टुकड़ा होता है, जैसे एंटीबॉडी, एफसी टुकड़े खुद, या अन्य एफसी फ्यूजन प्रोटीन। मानक तरीकों की तुलना में समान या बेहतर उत्पाद वसूली को प्राप्त करते समय हमारे सुधारों ने नाटकीय रूप से प्रसंस्करण समय (4 घंटे के रूप में कुछ लेकिन अधिक आम तौर पर ~ 9 घंटे, 20 + कार्य घंटों की तुलना में) में कमी आई है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="822">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml)&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sartorius-Stedim</td>
			<td style="width:147px;">93PRAP06HB-12--A</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml</td>
			<td style="width:191px;">Millipore</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td>Use 15 ml volume if needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Sterile vacuum filter unit, 0.22 &#181;m, 500 ml</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">10 ml Syringes with Luer Lock tips</td>
			<td>BD</td>
			<td>301604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">30 ml Syringes with&#160; Luer Lock tips</td>
			<td>BD</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>WU-95903-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Snap i.d. antibody collection tray</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>WBAVDABTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Snap i.d. single well blot holder</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>WBAVDBH01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Elution buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Tris, ultra pure</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>819623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:313px;">DPBS with Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Human Fc</td>
			<td>Bethyl Research Laboratories</td>
			<td>&#160;P80-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Anti-human Fc-APC</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>109136170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Anti-human Fc-AP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-5018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Alkaline phosphatase substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:147px;">S3841</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene)</td>
			<td>BD</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-2226</td>
			<td style="width:173px;">A peristaltic pump is also acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Protein gel electrophoresis system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>552BR094876</td>
			<td style="width:173px;">Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Semidry blotter&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td style="width:147px;">690BR006163</td>
			<td style="width:173px;">Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:313px;">SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system</td>
			<td style="width:191px;">EMD Millipore</td>
			<td>WBAVDBASE</td>
			<td style="width:173px;">An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of chimeric human fc-expressing proteins using protein a membrane adsorbers and a streamlined workflow

प्रयोगशाला पैमाने से औद्योगिक पैमाने पर कोशिका संस्कृति सुपरनेटेंट और lysed सेल समाधान से जैव अणुओं के शुद्धिकरण को आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है। जबकि असुरक्षित प्रोटीन का उपयोग कर आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी एक agarose मोती कॉलम में पैक यकीनन एंटीबॉडी और recombinant इग्ग के एफसी टुकड़े व्यक्त प्रोटीन के प्रयोगशाला पैमाने पर अलगाव की सबसे आम विधि है, यह एक समय लेने वाली और महंगी प्रक्रिया हो सकती है । समय और वित्तीय बाधाओं को विशेष रूप से छोटे बुनियादी विज्ञान प्रयोगशालाओं में कठिन है कि तनु समाधान से प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा के लिए माइक्रोग्राम के सैकड़ों ठीक करना चाहिए, अभी तक उच्च दबाव तरल वितरण प्रणाली और/या bioseparations में विशेषज्ञता के साथ कर्मियों के लिए उपयोग की कमी है । इसके अलावा, उत्पाद मात्राकरण और लक्षण वर्णन भी कई कार्यदिवसों में प्रसंस्करण समय को जरूरत से ज्यादा लंबा कर सकता है और खर्चों (उपभोग्य सामग्री, मजदूरी, आदि)को बढ़ा सकता है। इसलिए, प्रयोगशाला पैमाने पर अलगाव और एंटीबॉडी और एफसी टुकड़ा रखने वाले अन्य प्रोटीन के लक्षण वर्णन के लिए एक तेज, सस्ती, अभी तक प्रभावी प्रोटोकॉल की आवश्यकता है। इस उद्देश्य के लिए, हमने एक प्रोटोकॉल तैयार किया है जिसे सीमित अनुभव वाले तकनीकी कर्मचारियों द्वारा 9 घंटे (लगभग एक वर्कडे) से कम और 4 घंटे के रूप में जल्दी से पूरा किया जा सकता है, जैसा कि पारंपरिक तरीकों की मांग 20 + काम के घंटे के विपरीत है। अधिकांश आवश्यक उपकरण मानक जैव चिकित्सा विज्ञान, जैव रसायन, और (जैव) रासायनिक इंजीनियरिंग प्रयोगशालाओं में आसानी से उपलब्ध हैं, और सभी अभिकर्मक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। इस प्रोटोकॉल को प्रदर्शित करने के लिए, प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत किए जाते हैं जिसमें कोशिका संस्कृति सुपरनेट से मानव एफसी (गल-1एचएफसी) को फ्यूज किए गए चिमरिक मुरीन गैलेक्टिन-1 को प्रोटीन ए झिल्ली एसोर्बर का उपयोग करके अलग किया गया था। शुद्ध लड़की-1hFc एक तेजी से पश्चिमी दाग विश्लेषण प्रक्रिया का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया गया था और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग कर विशेषता । सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह को अन्य एफसी-व्यक्त प्रोटीन, जैसे एंटीबॉडी, और/या वैकल्पिक मात्राकरण और लक्षण वर्णन विधियों को शामिल करने के लिए बदल के लिए संशोधित किया जा सकता है ।

एफसी-व्यक्त प्रोटीन के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल का उपयोग नियमित रूप से पतला सेल संस्कृति सुपरनेटेंट से मानव एफसी (गल-1एचएफसी) से जुड़े चिमरिक मुरीन गैलेक्टिन-1 को संसाधित करने ?...

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Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

प्रोटीन ए एगर उठे मनका से भरे स्तंभों का उपयोग करके पारंपरिक आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी की तुलना में, प्रोटीन ए झिल्ली एसोर्बर एंटीबॉडी और अन्य एफसी टुकड़ा-व्यक्त प्रोटीन के प्रयोगशाला-पैमाने पर अलगाव को काफी गति दे सकता है। उचित विश्लेषण और मात्राकरण विधियों से प्रोटीन प्रसंस्करण में और तेजी आ सकती है, जिससे अलगाव/लक्षण वर्णन को 20 + कार्य घंटों के बजाय एक कार्यदिवस में पूरा किया जा सकता है ।

प्रोटीन ए झिल्ली एसोर्बर और एक सुव्यवस्थित वर्कफ्लो का उपयोग करके चिमरिक ह्यूमन एफसी-व्यक्त प्रोटीन का अलगाव और लक्षण वर्णन

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

प्रोटीन और सेल बन्दिश के लिए दो आयामी नमूनों Substrates बनाना

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

और परिसंचारी मेलेनोमा कोशिकाओं का उपयोग Photoacoustic Flowmetry की जांच अलगाव

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

झिल्ली रीढ़: झिल्ली प्रोटीन के प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान के लिए एक जैव रासायनिक उपकरण<em&gt; में Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

एक Intein की मध्यस्थता कृत्रिम प्रोटीन hydrogel के संश्लेषण

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

एक केस स्टडी के रूप में तंबाकू में क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति: प्रयोगों दृष्टिकोण की डिजाइन का उपयोग कर परिसर सिस्टम की विशेषता

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

तंत्रिका ऊतक उत्थान के लिए घुलनशील और अघुलनशील Biotinylated प्रोटीन की अभिव्यक्ति, अलगाव, और शोधन

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त झिल्ली प्रोटीन में गठनात्मक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए स्थानांतरण

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

एक 3 डी ऊतक इंजीनियर मानव इसोफेजियल mucosal मॉडल का उत्पादन, लक्षण और क्षमता का उपयोग करता

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

मानव मुलायम ऊतकों की biomechanical विशेषता खरोज और तन्य परीक्षण का उपयोग

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Macrostructure युक्त ऑप्टिकल ऊतक प्रेतों के निर्माण और लक्षण वर्णन

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...