Name: isolation and characterization of chimeric human fc-expressing proteins using protein a membrane adsorbers and a streamlined workflow
Uploaded: 2014-01-08T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить г-на Луиса Ф. Дельгадильо (департамент химической и биомолекулярной инженерии, Университет Огайо), г-на Мэтью Х. Уильямса (департамент химической и биомолекулярной инженерии, Университет Огайо) и д-ра Филиберто Седено-Лорана (Brigham and Women's Hospital и Harvard Medical School) за экспертную техническую помощь. Авторы также хотели бы поблагодарить Зимой 2011 CHE 404/BME 504 и осень 2012 CHE 4830/BME 5830 студентов (Департамент химической и биомолекулярной инженерии и биомедицинской инженерной программы, Университет Огайо) за технические консультации и обсуждения. Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (NSF) Основные исследования инструментов грант CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Дерматология Фонд исследований Грант A050422 (SRB), Национальные институты здравоохранения (NIH) NCI грант 1R15CA161830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Постдокторская стипендий F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD), и NIH NCCAM грант R01AT004628 (CJD).

1. Проверить сродство к белку А
<ol><li>Убедитесь, что белок Fc-экспрессии (рекомбинантный синтез белка или IgG антитела, до сих пор называют "белок") имеет приемлемоесродство к белку 14-17 до использования белка мембраны AdSorber, и тест на наличие белка в фондовом растворе(например, клет?...

<ol>
	<li>Gagnon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+trends+in+antibody+purification.">Technology trends in antibody purification.</a> J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).</li><li>Gottschalk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioseparation+in+antibody+manufacturing:+The+good,+the+bad+and+the+ugly.">Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly.</a> Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).</li><li>Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+and+purification+process+development+for+monoclonal+antibody+production.">Recovery and purification process development for monoclonal antibody production.</a> MAbs. 2, 480-499 (2010).</li><li>Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+antibody+purification.">Future of antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).</li><li>Boi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+adsorbers+as+purification+tools+for+monoclonal+antibody+purification.">Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).</li><li>Cuatrecasas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+by+affinity+chromatography.+Derivatizations+of+agarose+and+polyacrylamide+beads.">Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads.</a> J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).</li><li>Shukla, A. A., Gottschalk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+disposable+technologies+for+biopharmaceutical+manufacturing.">Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing.</a> Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).</li><li>Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+a+new+protein+a+affinity+membrane+for+the+primary+recovery+of+antibodies.">Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies.</a> Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).</li><li>Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+immunoglobulins+g+by+protein+a/g+afinity+membrane+chromatography.">Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography.</a> J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).</li><li>Thommes, J., Etzel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatives+to+chromatographic+separations.">Alternatives to chromatographic separations.</a> Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).</li><li>Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+and+simulation+of+affinity+membrane+adsorption.">Modelling and simulation of affinity membrane adsorption.</a> J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).</li><li>van Beijeren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-aided+process+design+of+affinity+membrane+adsorbers:+A+case+study+on+antibodies+capturing.">Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing.</a> Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).</li><li>Lauriere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semidry+electroblotting+system+efficiently+transfers+both+high-+and+low-molecular-weight+proteins+separated+by+sds-page.">A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page.</a> Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).</li><li>Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+antibodies+using+affinity+chromatography.">Purification of antibodies using affinity chromatography.</a> Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).</li><li>Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+a+from+staphylococcus+aureus.+Its+isolation+by+affinity+chromatography+and+its+use+as+an+immunosorbent+for+isolation+of+immunoglobulins.">Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins.</a> FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).</li><li>Hober, S., Nord, K., Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+a+chromatography+for+antibody+purification.">Protein a chromatography for antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).</li><li>Kronvall, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+surface+component+in+group+a,+c,+and+g+streptococci+with+non-immune+reactivity+for+immunoglobulin+g.">A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g.</a> J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).</li><li>Cedeno-Laurent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+nascent+galectin-1+chimeric+molecule+for+studying+the+role+of+leukocyte+galectin-1+ligands+and+immune+disease+modulation.">Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation.</a> J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+t4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+Procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Coomassie+brilliant+blue+g250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrylamide+gels.">The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Cedeno-Laurent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+inhibition+of+galectin-1-binding+carbohydrates+accentuates+antitumor+immunity.">Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity.</a> J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer.">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (33), (2009).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+Bradford+Protein+Assay.">Linearization of the Bradford Protein Assay.</a> J. Vis. Exp. (38), (2010).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analyses+of+all+Influenza+Type+A+Viral+Hemagglutinins+and+Neuraminidases+using+Universal+Antibodies+in+Simple+Slot+Blot+Assays.">Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays.</a> J. Vis. Exp. (50), (2011).</li></ol>

Протокол, описанный в этом, был разработан для быстрой изоляции и характеристики химерного синтеза белка, выражаюго человека Fc (Gal-1hFc), без существенного ущерба для восстановления продукта или завышения стоимости. Ключевыми компонентами обтекаемого рабочего процесса являются белок ме...

Изоляция антител и рекомбинантных белков, выражаюющих иммуноглобулин G (IgG) Fc фрагменты из клеточной культуры supernatants и разбавления облизатических клеточных растворов может быть достигнуто с помощью белка сродство хроматографии. В фундаментальных научно-технических лабораториях и промышленности, колонны упакованы с пористым белком Агароза, стекло, или полимерные бусы чаще всего используются для сродства хроматографии, несмотря на высокие финансовые затраты и длительноевремя обработки 1-3. Это хорошо оценили, что сродство хроматографии представляет собой крупнейший счет и обработка узкое место в лабораторных ипромышленных условиях 2,4. В результате, многочисленные улучшения были разработаны для снижения затрат и времени обработки без ущерба для общего восстановления продуктаот процесса поезд 1,2,5-7. Особенно перспективным для изоляции антител и других белков, выражаюющих Fc, является сродство хроматографии с использованием белка мембраны А adorber2,5,7-10. В то время как fc захвата в колонке хроматографии диффузии ограничено(т.е. Fc-экспрессии белка должны диффузии в и через внутренние поры, чтобы достичь большинства белка А) с высоким давлением падение по всей колонке, массовый транспорт в мембранных адсорберов приводит к массовой конвекции, в результатечего избежать диффузии ограничения 8,9,11,12. Кроме того, падение давления через мембрану adorber является низким, что позволяет быстрее перфузии скорости потока по сравнению с бисером упакованыколонны 8,9,11,12. Таким образом, для изоляции лабораторных масштабах, мембранная хроматография, по прогнозам, сократит время изоляции на несколько часов и увеличит улавливание продукта по сравнению с колонкой хроматографии. Кроме того, математические модели для IgG adorption в мембранных адсорбенахбыли предложены 8,9,11,12, что позволяет конечных пользователей прогнозировать производительность в лаборатории.
Еще одним узким местом в фундаментальных научно-технических лабораториях является характеристика белка Fc-expressing. Тем не менее, выбор соответствующих методов для завершения анализа характеристик, таких западных помарки, может значительно сократить время, затученные на тестирование продукта. Например, полудровый переход в прерывистой буферной системе может выполнить электрофоретический перенос белков из геля SDS-PAGE в мембрану поливинила дифторидина (PVDF) в считанные минуты, в отличие от 1-2 часов в баке (мокрый) передачи в непрерывной буфернойсистеме 13.
Быстрый, недорогой и эффективный протокол, чтобы изолировать и охарактеризовать химерный синтез белка, выражаюго Fc фрагмент человека IgG описывается здесь. Большинство оборудования легкодоступно в стандартных базовых биомедицинских науках, биологии, химии и (био) лабораториях химической инженерии, и все реагенты доступны на коммерческой основе. Хотя репрезентативные результаты были получены в результате изоляции и характеристики murine galectin-1/human Fc химерного белка синтеза (Gal-1hFc), обтекаемый протокол может быть применен к изоляции других молекул, обладающих фрагментом Fc, таких как антитела, сами фрагменты Fc или другие белки синтеза Fc. Наши улучшения значительно сократили время обработки (всего за 4 часа, но, как правило, на 9 часов, по сравнению с 20 часами работы) при одновременном достижении аналогичного или улучшенного восстановления продукта по сравнению со стандартными методами.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="822">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml)&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sartorius-Stedim</td>
			<td style="width:147px;">93PRAP06HB-12--A</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml</td>
			<td style="width:191px;">Millipore</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td>Use 15 ml volume if needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Sterile vacuum filter unit, 0.22 &#181;m, 500 ml</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">10 ml Syringes with Luer Lock tips</td>
			<td>BD</td>
			<td>301604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">30 ml Syringes with&#160; Luer Lock tips</td>
			<td>BD</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>WU-95903-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Snap i.d. antibody collection tray</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>WBAVDABTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Snap i.d. single well blot holder</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>WBAVDBH01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Elution buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Tris, ultra pure</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>819623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:313px;">DPBS with Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Human Fc</td>
			<td>Bethyl Research Laboratories</td>
			<td>&#160;P80-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Anti-human Fc-APC</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>109136170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Anti-human Fc-AP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-5018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Alkaline phosphatase substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:147px;">S3841</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene)</td>
			<td>BD</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-2226</td>
			<td style="width:173px;">A peristaltic pump is also acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Protein gel electrophoresis system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>552BR094876</td>
			<td style="width:173px;">Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Semidry blotter&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td style="width:147px;">690BR006163</td>
			<td style="width:173px;">Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:313px;">SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system</td>
			<td style="width:191px;">EMD Millipore</td>
			<td>WBAVDBASE</td>
			<td style="width:173px;">An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of chimeric human fc-expressing proteins using protein a membrane adsorbers and a streamlined workflow

Лабораторный масштаб до промышленной очистки биомолекул от супернатантов клеточной культуры и лизированных клеточных растворов может быть выполнен с помощью хроматографии сродства. Хотя сродство хроматографии с использованием пористого белка Агароза бисер упакованы в колонки, возможно, наиболее распространенным методом лабораторного масштаба изоляции антител и рекомбинантных белков, выражают Fc фрагменты IgG, это может быть трудоемким и дорогостоящим процессом. Время и финансовые ограничения особенно огромны в небольших базовых научных лабораториях, которые должны восстановить сотни микрограммов до миллиграммовых количеств белка из разбавленных растворов, но не имеют доступа к системам доставки жидкостей высокого давления и/или персоналу, опыту в биоразделение. Кроме того, количественная оценка и характеристика продукции могут также чрезмерно удлинять время обработки в течение нескольких рабочих дней и завышать расходы (расходные расходы, заработная плата и т.д.). Таким образом, быстрый, недорогой, но эффективный протокол необходим для лабораторной изоляции масштаба и характеристики антител и других белков, обладающих фрагментом Fc. С этой целью мы разработали протокол, который может быть завершен ограниченным опытом технического персонала менее чем за 9 часов (примерно один рабочий день) и так же быстро, как 4 часа, в отличие от традиционных методов, которые требуют 20 часов работы. Большинство необходимого оборудования легкодоступно в стандартных биомедицинских науках, биохимии и (био) лабораториях химической инженерии, и все реагенты доступны на коммерческой основе. Чтобы продемонстрировать этот протокол, репрезентативные результаты представлены, в которых химерин галектин-1 сливается с человеком Fc (Gal-1hFc) из клеточной культуры супернатант был изолирован с помощью белка мембраны AdSorber. Очищенный Gal-1hFc был количественно оценен с помощью ускоренной процедуры анализа западного blotting и характеризовался использованием цитометрии потока. Оптимизированный рабочий процесс может быть изменен для других белков, выражаюющих Fc, таких как антитела, и/или изменен для включения альтернативных методов количественной оценки и характеристики.

Оптимизированный протокол для изоляции и характеристики Fc-экспрессирующих белков обычно используется для обработки химерин-галектин-1, слитый с человеческим Fc (Gal-1hFc) из разбавленных супернатантов клеточной культуры. Диаграмма потока на рисунке 2 иллюстрирует рабочий процесс...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow at JoVE.com

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

По сравнению с традиционной хроматографией сродства с использованием белка агароза бисероубитарные колонки, мембранные адсорберы белка A могут значительно ускорить лабораторно-масштабную изоляцию антител и других фрагмент-экспрессионных белков Fc. Надлежащие методы анализа и количественной оценки могут еще больше ускорить обработку белка, что позволит завершить изоляцию/характеристику за один рабочий день, а не за 20 часов работы.

Изоляция и характеристика химерных человеческих fc-выражать протеины используя протеин Адсорберы мембраны и обтекаемый рабочий процесс

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Создание двумерных рисунком Подложки для конфайнмента белков и клеточных

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Обнаружение и изоляция циркулирующих клеток меланомы использованием Фотоакустическая флоуметрии

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Мембрана-SPINE: Биохимический инструмента для выявления белок-белковых взаимодействий мембранных белков<em&gt; В Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Синтез интеин-опосредованной искусственного белка гидрогеля

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Характеристика сложных систем по постановке эксперимента подхода: Переходный Белок Expression табачными в качестве примера

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Выражение, изоляция, и очистка растворимых и нерастворимых Биотинилированные белков для нервной ткани Регенерация

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Свечение резонанс переноса энергии по изучению конформационных изменений мембранных белков выражается в клетках млекопитающих

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Производственные, характеристики и потенциальные возможности использования в 3D тканевой инженерии человека пищевода слизистой модели

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Биомеханическое Характеристика мягких тканей человека с помощью отступов и испытания на растяжение

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Изготовление и характеристика фантомы оптических ткани, содержащие макроструктуры

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...