Name: isolation and characterization of chimeric human fc-expressing proteins using protein a membrane adsorbers and a streamlined workflow
Uploaded: 2014-01-08T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow at JoVE.com

Los autores desean dar las gracias al Sr. Luis F. Delgadillo (Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular, Universidad de Ohio), al Sr. Matthew H. Williams (Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular, Universidad de Ohio) y al Dr. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women's Hospital y Harvard Medical School) por su asistencia técnica experta. Los autores también desean agradecer a los estudiantes de invierno de 2011 CHE 404/BME 504 y otoño de 2012 CHE 4830/BME 5830 (Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular y Programa de Ingeniería Biomédica, Universidad de Ohio) por su asesoramiento técnico y discusión. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias (NSF) Mayor Instrumentación de Investigación CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), Institutos Nacionales de Salud (NIH) NCI subvención 1R15CA161830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Beca Postdoctoral F32CA144219-01A1 (SRB), NIH / NCI R01CA173610 (CJD), y NIH NCCAM subvención R01AT004628 (CJD).

1. Verificar la afinidad por la proteína A
<ol><li>Verificar que la proteína que expresa Fc (proteína de fusión recombinante o anticuerpo IgG, hasta ahora denominada "proteína") tiene una afinidad aceptable por la proteína A14-17 antes de usar el adsorbente de membrana de la proteína A, y probar la presencia de la proteína en la solución madre (por ejemplo, sobrenadante de cultivo celular clarificado por centrifugación a 1.000 x g durante 5 min a células suspendidas de pellets). Utilice c...

<ol>
	<li>Gagnon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+trends+in+antibody+purification.">Technology trends in antibody purification.</a> J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).</li><li>Gottschalk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioseparation+in+antibody+manufacturing:+The+good,+the+bad+and+the+ugly.">Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly.</a> Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).</li><li>Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+and+purification+process+development+for+monoclonal+antibody+production.">Recovery and purification process development for monoclonal antibody production.</a> MAbs. 2, 480-499 (2010).</li><li>Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+antibody+purification.">Future of antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).</li><li>Boi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+adsorbers+as+purification+tools+for+monoclonal+antibody+purification.">Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).</li><li>Cuatrecasas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+by+affinity+chromatography.+Derivatizations+of+agarose+and+polyacrylamide+beads.">Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads.</a> J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).</li><li>Shukla, A. 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P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+immunoglobulins+g+by+protein+a/g+afinity+membrane+chromatography.">Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography.</a> J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).</li><li>Thommes, J., Etzel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatives+to+chromatographic+separations.">Alternatives to chromatographic separations.</a> Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).</li><li>Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. 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Pap. 62, 458-463 (2008).</li><li>Lauriere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semidry+electroblotting+system+efficiently+transfers+both+high-+and+low-molecular-weight+proteins+separated+by+sds-page.">A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page.</a> Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).</li><li>Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+antibodies+using+affinity+chromatography.">Purification of antibodies using affinity chromatography.</a> Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).</li><li>Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+a+from+staphylococcus+aureus.+Its+isolation+by+affinity+chromatography+and+its+use+as+an+immunosorbent+for+isolation+of+immunoglobulins.">Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins.</a> FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).</li><li>Hober, S., Nord, K., Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+a+chromatography+for+antibody+purification.">Protein a chromatography for antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).</li><li>Kronvall, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+surface+component+in+group+a,+c,+and+g+streptococci+with+non-immune+reactivity+for+immunoglobulin+g.">A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g.</a> J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).</li><li>Cedeno-Laurent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+nascent+galectin-1+chimeric+molecule+for+studying+the+role+of+leukocyte+galectin-1+ligands+and+immune+disease+modulation.">Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation.</a> J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+t4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+Procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Coomassie+brilliant+blue+g250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrylamide+gels.">The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Cedeno-Laurent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+inhibition+of+galectin-1-binding+carbohydrates+accentuates+antitumor+immunity.">Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity.</a> J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer.">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (33), (2009).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+Bradford+Protein+Assay.">Linearization of the Bradford Protein Assay.</a> J. Vis. Exp. (38), (2010).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analyses+of+all+Influenza+Type+A+Viral+Hemagglutinins+and+Neuraminidases+using+Universal+Antibodies+in+Simple+Slot+Blot+Assays.">Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays.</a> J. Vis. Exp. (50), (2011).</li></ol>

El protocolo descrito en este documento fue desarrollado para aislar y caracterizar rápidamente una proteína quimérica de fusión que expresa fc humano (Gal-1hFc), sin comprometer significativamente la recuperación del producto o inflar el costo. Los componentes clave del flujo de trabajo optimizado son un adsorbente de membrana de proteína A para el aislamiento, y la transferencia de semisel y el inmunoblotting asistido por vacío para la caracterización por western blotting.
La dismin...

El aislamiento de anticuerpos y proteínas recombinantes que expresan fragmentos de inmunoglobulina G (IgG) Fc de sobrenadantes de cultivos celulares y soluciones celulares diluidas se puede lograr utilizando cromatografía de afinidad de proteínas A. En los laboratorios de ciencia básica e ingeniería y en la industria, las columnas empaquetadas con agarosa recubierta de proteína A porosa, vidrio o perlas poliméricas se utilizan más comúnmente para la cromatografía de afinidad, a pesar de los altos costos financieros y los largos tiempos de procesamiento1-3. Es muy apreciado que la cromatografía de afinidad representa el mayor gasto y cuello de botella de procesamiento tanto en entornos de laboratorio como industriales2,4. Como resultado, se han desarrollado numerosas mejoras para disminuir el costo y el tiempo de procesamiento sin sacrificar la recuperación general del producto del tren de proceso1,2,5-7. Particularmente prometedor para el aislamiento de anticuerpos y otras proteínas que expresan Fc es la cromatografía de afinidad utilizando un adsorbente de membrana de proteína A2,5,7-10. Mientras que la captura de Fc en cromatografía de columna está limitada por difusión (esdecir, la proteína que expresa Fc debe difundirse dentro y a través de los poros internos para alcanzar la mayoría de la proteína A) con alta caída de presión a través de la columna, el transporte de masa en los adsorbers de membrana es impulsado por la convección a granel, lo que resulta en la evitación de las limitaciones de difusión8,9,11,12. Además, la caída de presión a través del adsorbente de membrana es baja, lo que permite tasas de flujo de perfusión más rápidas en comparación con las columnas empaquetadas con perlas8,9,11,12. Por lo tanto, para el aislamiento a escala de laboratorio, se predice que la cromatografía de membrana reducirá el tiempo de aislamiento en varias horas y aumentará la captura del producto en comparación con la cromatografía de columna. Además, se han propuesto modelos matemáticos para la adsorción de IgG en adsorbentes de membrana8,9,11,12,permitiendo así a los usuarios finales predecir el rendimiento en el laboratorio.
Otro cuello de botella en los laboratorios de ciencia básica e ingeniería es la caracterización de la proteína que expresa Fc. Sin embargo, la selección de métodos apropiados para completar los ensayos de caracterización, como las manchas occidentales, puede reducir en gran medida el tiempo dedicado a las pruebas de productos. Por ejemplo, la transferencia de semisido en un sistema tampón discontinuo puede lograr la transferencia electroforética de proteínas de un gel SDS-PAGE a una membrana de polivinilo difluoridina (PVDF) en cuestión de minutos, en lugar de 1-2 horas en la transferencia del tanque (húmedo) en un sistema tampón continuo13.
Un protocolo rápido, barato, y eficaz para aislar y para caracterizar una proteína quimérica de la fusión que expresa un fragmento del Fc de IgG humano se describe adjunto. La mayoría de los equipos están fácilmente disponibles en los laboratorios estándar de ciencias biomédicas básicas, biología, química y (bio)ingeniería química, y todos los reactivos están disponibles comercialmente. Aunque se generaron resultados representativos a partir del aislamiento y caracterización de una proteína de fusión quimérica Murina Galectina-1/Humana Fc (Gal-1hFc), el protocolo simplificado se puede aplicar al aislamiento de otras moléculas que poseen un fragmento Fc, como anticuerpos, fragmentos Fc ellos mismos, u otras proteínas de fusión Fc. Nuestras mejoras disminuyeron drásticamente el tiempo de procesamiento (tan solo 4 horas, pero más típicamente ~ 9 horas, en comparación con más de 20 horas de trabajo) mientras lograba una recuperación del producto similar o mejorada en comparación con los métodos estándar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="822">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml)&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sartorius-Stedim</td>
			<td style="width:147px;">93PRAP06HB-12--A</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml</td>
			<td style="width:191px;">Millipore</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td>Use 15 ml volume if needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Sterile vacuum filter unit, 0.22 &#181;m, 500 ml</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">10 ml Syringes with Luer Lock tips</td>
			<td>BD</td>
			<td>301604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">30 ml Syringes with&#160; Luer Lock tips</td>
			<td>BD</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>WU-95903-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Snap i.d. antibody collection tray</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>WBAVDABTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Snap i.d. single well blot holder</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>WBAVDBH01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Elution buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Tris, ultra pure</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>819623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:313px;">DPBS with Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Human Fc</td>
			<td>Bethyl Research Laboratories</td>
			<td>&#160;P80-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Anti-human Fc-APC</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>109136170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Anti-human Fc-AP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-5018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Alkaline phosphatase substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:147px;">S3841</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene)</td>
			<td>BD</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-2226</td>
			<td style="width:173px;">A peristaltic pump is also acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Protein gel electrophoresis system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>552BR094876</td>
			<td style="width:173px;">Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Semidry blotter&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td style="width:147px;">690BR006163</td>
			<td style="width:173px;">Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:313px;">SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system</td>
			<td style="width:191px;">EMD Millipore</td>
			<td>WBAVDBASE</td>
			<td style="width:173px;">An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of chimeric human fc-expressing proteins using protein a membrane adsorbers and a streamlined workflow

La purificación a escala de laboratorio a escala industrial de biomoléculas de sobrenadantes de cultivos celulares y soluciones celulares lisadas se puede lograr mediante cromatografía de afinidad. Mientras que la cromatografía de afinidad utilizando perlas de agarosa de proteína A porosa empaquetadas en columnas es posiblemente el método más común de aislamiento a escala de laboratorio de anticuerpos y proteínas recombinantes que expresan fragmentos de Fc de IgG, puede ser un proceso lento y costoso. Las limitaciones de tiempo y financieras son especialmente desalentadoras en pequeños laboratorios de ciencias básicas que deben recuperar cientos de microgramos a cantidades de miligramos de proteína de soluciones diluidas, pero carecen de acceso a sistemas de administración de líquidos de alta presión y / o personal con experiencia en bioseparaciones. Además, la cuantificación y caracterización del producto también puede alargar excesivamente el tiempo de procesamiento durante varios días de trabajo e inflar los gastos (consumibles, salarios, etc.). Por lo tanto, se necesita un protocolo rápido, económico pero efectivo para el aislamiento a escala de laboratorio y la caracterización de anticuerpos y otras proteínas que poseen un fragmento de Fc. Con este fin, hemos ideado un protocolo que puede ser completado por personal técnico de experiencia limitada en menos de 9 horas (aproximadamente un día de trabajo) y tan rápido como 4 horas, en comparación con los métodos tradicionales que exigen más de 20 horas de trabajo. La mayoría del equipo requerido está fácilmente disponible en los laboratorios estándar de ciencia biomédica, bioquímica e ingeniería (bio)química, y todos los reactivos están disponibles comercialmente. Para demostrar este protocolo, los resultados representativos se presentan en los cuales el galectin-1 murine quimérico fundido al Fc humano (Gal-1hFc) del sobrenadante del cultivo celular fue aislado usando un adsorber de la membrana de la proteína A. Gal-1hFc purificado fue cuantificado usando un procedimiento occidental apresurado del análisis que borraba y caracterizado usando cytometry de flujo. El flujo de trabajo optimizado puede modificarse para otras proteínas que expresan Fc, como los anticuerpos, y/o alterarse para incorporar métodos alternativos de cuantificación y caracterización.

El protocolo simplificado para el aislamiento y la caracterización de las proteínas que expresan Fc se utiliza rutinariamente para procesar la galectina murina quimérica-1 fusionada a Fc humano (Gal-1hFc) a partir de sobrenadantes de cultivo celular diluidos. El diagrama de flujo de la figura 2 ilustra el flujo de trabajo y la hora de cada paso del protocolo. Para un lote típico de 300 ml de sobrenadante, el tiempo total de procesamiento es de aproximadamente 9 horas cuando se realiza la prueba opcio...

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Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

En comparación con la cromatografía de afinidad tradicional utilizando columnas empaquetadas de cuentas de agarosa de proteína A, los adsorbentes de membrana de proteína A pueden acelerar significativamente el aislamiento a escala de laboratorio de anticuerpos y otras proteínas que expresan fragmentos de Fc. Los métodos apropiados de análisis y cuantificación pueden acelerar aún más el procesamiento de proteínas, lo que permite que el aislamiento / caracterización se complete en un día de trabajo, en lugar de más de 20 horas de trabajo.

Aislamiento Y Caracterización De Proteínas Quiméricas Humanas Que Expresan Fc Usando Adsorbentes De Membrana De Proteína A Y Un Flujo de Trabajo Optimizado

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

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