Name: the xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry
Uploaded: 2014-03-11T14:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry Video at JoVE.com

כל החברים של אוניברסיטת וושינגטון במעבדה להנדסה מולקולרית לב סנט לואיס. בורוז ברוכים קרן פרס קריירה בממשק המדעי - 1010299 (לJS).

1. התקנת ציוד ראשונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הבמה ומניפולטור microelectrode על מערכת רטט בידוד (למשל שולחן אוויר) עם כלוב פאראדיי המקיף כדי למנוע רעש חשמלי ומכאני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלחמה שישה כדורי Ag / AgCl לאורכים של שישה סנט?...

<ol>
	<li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+internal+pore+opening+in+KV+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid.">Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).</li><li>Stefani, E., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cut-open+oocyte+voltage-clamp+technique.">Cut-open oocyte voltage-clamp technique.</a> Methods Enzymol. 293, 300-318 (1998).</li><li>Muroi, Y., Chanda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+anesthetics+disrupt+energetic+coupling+between+the+voltage-sensing+segments+of+a+sodium+channel.">Local anesthetics disrupt energetic coupling between the voltage-sensing segments of a sodium channel.</a> J. Gen. Physiol. 133, 1-15 (2009).</li><li>Stefani, E., Toro, L., Perozo, E., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+of+Shaker+K++channels:+I.+Ionic+and+gating+currents.">Gating of Shaker K+ channels: I. Ionic and gating currents.</a> Biophys. J. 66, 996-1010 (1994).</li><li>Wang, S., Liu, S., Morales, M. J., Strauss, H. C., Rasmusson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+the+activation+and+inactivation+kinetics+of+HERG+expressed+in+Xenopus+oocytes.">A quantitative analysis of the activation and inactivation kinetics of HERG expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Physiolt. 502 (Pt 1), 45-60 (1997).</li><li>Neely, A., Garcia-Olivares, J., Voswinkel, S., Horstkott, H., Hidalgo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+active+calcium+channel+beta(1b)+-subunit+by+size-exclusion+chromatography+and+its+role+on+channel+function.">Folding of active calcium channel beta(1b) -subunit by size-exclusion chromatography and its role on channel function.</a> J. Biol. Chem. 279, 21689-21694 (2004).</li><li>Silva, J. R., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensor+movements+describe+slow+inactivation+of+voltage-gated+sodium+channels+I:+wild-type+skeletal+muscle.">Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels I: wild-type skeletal muscle.</a> Na(V)1.4. J. Gen. Physiol. 141, 309-321 (2013).</li><li>Silva, J. R., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensor+movements+describe+slow+inactivation+of+voltage-gated+sodium+channels+II:+a+periodic+paralysis+mutation+in+Na(V)1.4+(L689I).">Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels II: a periodic paralysis mutation in Na(V)1.4 (L689I).</a> J. Gen. Physiol. 141, 323-334 (2013).</li><li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+voltage+clamp+to+record+small,+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li><li>Clare, J. J., Trezise, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Expression and analysis of recombinant ion channels : from structural studies to pharmacological screening. , (2006).</li><li>Cha, A., Zerangue, N., Kavanaugh, M., Bezanilla, F., Susan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in enzymology. 296, 566-578 (1998).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn. , (2006).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+voltage-dependent+conformational+changes+in+the+Shaker+K++channel+with+fluorescence.">Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li><li>Richards, R., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+the+conformational+dynamics+of+membrane+proteins+in+situ+with+site-directed+fluorescence+labeling.">Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Cohen, S., Au, S., Pante, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes.">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li><li>Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silver-silver+chloride+electrode:+a+possible+generator+of+offset+voltages+and+currents.">The silver-silver chloride electrode: a possible generator of offset voltages and currents.</a> J. Neurosci. Methods. 19, 249-255 (1987).</li><li>Gagnon, D. G., Bissonnette, P., Lapointe, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+disulfide+bridge+linking+the+fourth+and+the+seventh+extracellular+loops+of+the+Na+/glucose+cotransporter.">Identification of a disulfide bridge linking the fourth and the seventh extracellular loops of the Na+/glucose cotransporter.</a> J. Gen. Physiol. 127, 145-158 (2006).</li><li>Pantazis, A., Olcese, R., Roberts, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cut-Open Oocyte Voltage-Clamp Technique. In: Roberts G. (Ed.) Encyclopedia of Biophysics: SpringerReference. , (2013).</li></ol>

טכניקת מהדק החתך פתוח וזלין ביצית מתח פער מאפשרת פתרון מהיר של נתונים, רעש נמוך, שליטה מוגברת על פתרון פנימי והרכב פתרון חיצוני, והקלטות יציבים לאורך פרוטוקולים ארוכים יחסית 19. יתרונות אלה שנקבעו בטכניקה זו מלבד המהדק הסטנדרטי שתי אלקטרודות מתח וטכניקות תיקון ?...

טכניקות הידוק מתח מיוחדות תאפשר ההקלטה של ​​זרמים יוניים בפוטנציאל קרום מבוקר. שימוש נרחב מהדק שתי אלקטרודות מתח (TEVC) וטכניקות תיקון מהדק לספק מידע אלקטרו אמין על המאפיינים של תעלות יונים רבות. עם זאת, שתי שיטות אלה יש חסרונות שמונעים הרכישה של נתונים מהימנים לערוצים במהירות מתח מגודרת נתרן וערוצים להפעלה מהירה אחרים בממברנות כגון אלה של ביציות Xenopus. מעבדות Bezanilla וסטפאני וכתוצאה מכך פיתחו את טכניקת החיתוך פתוח מהדק מתח פער זלין (COVG) לביציות 2. הטכניקה כבר מיושמת באופן נרחב כדי להקליט, Na +, K +, וCa 2 ערוצים + 3-8. במהלך הקלטת COVG, קרום ביצית-לבטא חלבון Heterologous מחולק לשלושה אזורים. הנתונים הנוכחיים היוניים נרשם מהאזור העליון של הביצית כאמבטיה המקיפה את האזור העליון מהודקת לפוטנציאל פקודה, אשר ניתן לשנות בקלות ובמהירות. האזור האמצעי שומרים נגד זרמי זליגה על ידי שהדק את אותו פוטנציאל כמו של האזור העליון 9. האזור התחתון הוא שבו פתיחת ביצית (לחתוך פתוח) מתרחשת באמצעות השימוש בפתרון saponin או צינורית. כימי או פתיחה ידנית של הקרום באזור התחתון מאפשרת שליטה של ​​הפוטנציאל הפנימי, שהוא הידק לאדמה, והופך את רציף התא הפנימי עם פתרון התא התחתון. טפטוף של פתרונות לתא התחתון ניתן להתאים את המאפיינים של הסביבה הפנימית, ואילו מטבע פתרון בתא העליון משנה את הסביבה החיצונית. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51040/51040fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51040/51040fig1.jpg" width="500px" /> איור 1. ביצית Cut-Open תרשים התקנת מתח-קלאמפ אמבט. () למעלהלמטה תצוגה של שלוש האמבטיות מופרדות אחד מהשני. ממדיהם של התאים לCOVG מוצגים באיור. (ב) להציג צד של התקנת האמבטיות בעמדת בדיקה. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51040/51040fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> היתרונות של טכניקת COVG כוללים רעש נמוך הנוכחי (1 NA ב3 קילוהרץ), שליטה על הרכב היוני של מדיה החיצונית, היכולת לווסת את התקשורת הפנימית, ברזולוציה זמן מהיר (20-100 המתמיד של דעיכה של μsec זמן קיבולת חולפת), והקלטות יציבים במשך כמה שעות 9. החסרונות הם שזה דורש ציוד מיוחד וקשה יותר לביצוע בהשוואה לשני הידוק מתח האלקטרודה (TEVC) 10. בעוד גישת COVG דורשת ציוד מיוחד מאוד ואלמנטים פרוצדורליים מורכבים, זה יכול לאפשר לרכישת valuנתונים אלקטרו מסוגלים. נתונים אלה, כגון gating זרמים עם קינטיקה מהירה וזרמי זנב 4, ניתן להקליט בלי חלק מהנושאים הקשורים לפרוטוקולי הידוק מתח אחרים, כולל ערוץ מוזנח. שינויים קלים להתקנת COVG יכולים לאפשר את השימוש בבקרי הטמפרטורה וfluorometry מהדק מתח (VCF). הכללתם של אלמנטי fluorometry מהדק מתח בתוך ההרכבה COVG יכול להגדיל את תפוקת נתונים על ידי המקנה את היכולת לעקוב אחר שינויי קונפורמציה חלבון בעת הקלטת 11-13 הנוכחי בו זמנית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="515">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">External Solution</td>
			<td style="width:131px;">Brand</td>
			<td style="width:72px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:124px;">[Final], weight, or volume</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:72px;">M2004</td>
			<td style="width:124px;">25mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">MES Sodium Salt</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:72px;">M5057</td>
			<td style="width:124px;">90mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">HEPES</td>
			<td style="width:131px;">Research Products International</td>
			<td style="width:72px;">H75030</td>
			<td style="width:124px;">20mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Calcium hydroxide</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:72px;">239232</td>
			<td style="width:124px;">2mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">MES Hydrate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:72px;">M8250</td>
			<td style="width:124px;">variable (pH to 7.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Internal Solution</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:72px;">M2004</td>
			<td style="width:124px;">105mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">MES Sodium Salt</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:72px;">M5057</td>
			<td style="width:124px;">10mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">HEPES</td>
			<td style="width:131px;">Research Products International</td>
			<td style="width:72px;">H75030</td>
			<td style="width:124px;">20mM</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:189px;">Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:72px;">E4378</td>
			<td style="width:124px;">2mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">MES Hydrate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:72px;">M8250</td>
			<td style="width:124px;">variable (pH to 7.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Depolarizing Solution</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">KCl</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:72px;">221473</td>
			<td style="width:124px;">110mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:72px;">M8266</td>
			<td style="width:124px;">1.5mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:131px;">Caisson</td>
			<td style="width:72px;">C021</td>
			<td style="width:124px;">0.8mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">HEPES</td>
			<td style="width:131px;">Research Products International</td>
			<td style="width:72px;">H75030</td>
			<td style="width:124px;">10mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Pipet Solution</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">KCl</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:72px;">221473</td>
			<td style="width:124px;">3M</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:189px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:189px;">Saponin Solution</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Saponin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:72px;">47036</td>
			<td style="width:124px;">0.125g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Internal Solution</td>
			<td style="width:131px;">See above</td>
			<td style="width:72px;"></td>
			<td style="width:124px;">50mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Agar Bridge Solution</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:72px;">M2004</td>
			<td style="width:124px;">100ml of 1M</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">HEPES</td>
			<td style="width:131px;">Research Products International</td>
			<td style="width:72px;">H75030</td>
			<td style="width:124px;">1.2g</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">MES Hydrate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:72px;">M8250</td>
			<td style="width:124px;">variable (pH to 7.4)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">Granulated Agar</td>
			<td style="width:131px;">Research Products International</td>
			<td style="width:72px;">A20250</td>
			<td align="right" style="width:124px;">3%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">NMDG Storage Solution</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">NMDG, HEPES, MES Hydrate solution</td>
			<td style="width:131px;">see above</td>
			<td style="width:72px;"></td>
			<td style="width:124px;">40ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Water</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
			<td style="width:124px;">60ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:149px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:144px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:285px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:149px;">High Performance Oocyte Clamp</td>
			<td style="width:148px;">Dagan</td>
			<td style="width:144px;">CA-1B</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:149px;">Data Acquisition System</td>
			<td style="width:148px;">Axon CNS</td>
			<td style="width:144px;">&#160;Digidata 1440A</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:149px;">Oscilloscope</td>
			<td style="width:148px;">Tektronix&#160;</td>
			<td style="width:144px;">TDS 210</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:149px;">Rack Power Filter</td>
			<td style="width:148px;">APC&#160;</td>
			<td style="width:144px;">G5</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:149px;">Heating/Cooling Bath Temperature Controller</td>
			<td style="width:148px;">Dagan</td>
			<td style="width:144px;">HCC-100A</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:149px;">PC</td>
			<td style="width:148px;">Dell</td>
			<td style="width:144px;">Optiplex 990</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:149px;">pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software</td>
			<td style="width:148px;">Molecular Devices, LLC</td>
			<td style="width:144px;">pCLAMP10.3</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:149px;">TMC Vibration Control TableTop Platform</td>
			<td style="width:148px;">TMC</td>
			<td style="width:144px;">64 SERIES</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:149px;">TMC Vibration Control Air Table</td>
			<td style="width:148px;">TMC</td>
			<td style="width:144px;"><a name="RANGE!C10">20 Series&#160;</a></td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:149px;">V1/I Electrode Data Collector</td>
			<td style="width:148px;">Dagan</td>
			<td style="width:144px;">part of CA-1B</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:149px;">MX10L Micromanipulator</td>
			<td style="width:148px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:144px;">MX10L</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:149px;">Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors)</td>
			<td style="width:148px;">Dagan</td>
			<td style="width:144px;">part of CA-1B</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:149px;">Microscope</td>
			<td style="width:148px;">Omano</td>
			<td style="width:144px;">OM2300S-JW11</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:149px;">Temperature Control Bath</td>
			<td style="width:148px;">Custom or Dagan</td>
			<td style="width:144px;">Custom or HE-204C</td>
			<td style="width:285px;">Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:149px;">Custom AgCl Pellet Container</td>
			<td style="width:148px;">Custom</td>
			<td style="width:144px;">Custom</td>
			<td style="width:285px;">Custom machined</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:149px;">Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm</td>
			<td style="width:148px;">Warner</td>
			<td style="width:144px;">E-206</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:149px;">External Oocyte Bath</td>
			<td style="width:148px;">Custom or Dagan</td>
			<td style="width:144px;">Custom or CC-1-T-LB</td>
			<td style="width:285px;">Custom machined or purchased from Dagan</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:149px;">Internal Oocyte Bath</td>
			<td style="width:148px;">Custom or Dagan</td>
			<td style="width:144px;">Custom or CC-TG-ND</td>
			<td style="width:285px;">Custom machined or purchased from Dagan</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:149px;">Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes</td>
			<td style="width:148px;">Warner</td>
			<td style="width:144px;">G150T-4</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:149px;">Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath</td>
			<td style="width:148px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:144px;">SD-1280P</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:149px;">Fiber-Lite</td>
			<td style="width:148px;">Dolan-Jenner</td>
			<td style="width:144px;">LMI-600</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:149px;">Regular Bleach</td>
			<td style="width:148px;">Clorox</td>
			<td style="width:144px;">470174-764</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:149px;">Xenopus laevis Oocytes</td>
			<td style="width:148px;">Nasco</td>
			<td style="width:144px;">LM535M (sexually mature females)</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:149px;">90 Na+ External Solution</td>
			<td style="width:148px;">See Solutions sheet</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:149px;">10 Na+ Internal Solution</td>
			<td style="width:148px;">See Solutions sheet</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:149px;">3 M KCL</td>
			<td style="width:148px;">See Solutions sheet</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:149px;">Saponin</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:144px;">47036</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:149px;">NMDG Storage Solution</td>
			<td style="width:148px;">See Solutions sheet</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:149px;">5mL transfer pipets</td>
			<td style="width:148px;">SciMart</td>
			<td style="width:144px;">GS-52</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:149px;">Modified KCl electrode injector</td>
			<td style="width:148px;">BD</td>
			<td style="width:144px;">309659</td>
			<td style="width:285px;">Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:149px;">Microvaccum</td>
			<td style="width:148px;">Custom</td>
			<td style="width:144px;">Custom</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:149px;">Forceps</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td style="width:144px;">63040-458</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:149px;">Oocyte Handling Tools (Pipette Pump)</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td style="width:144px;">53502-222</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:149px;">Deionized Water Squirt Bottle</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td style="width:144px;">16649-911</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:149px;">Vaseline Petroleum Jelly</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:144px;">19-086-291&#160;</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:149px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:149px;">Additional Materials Required for VCF Recordings:</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:149px;">VCF Microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikon</td>
			<td style="width:144px;">Eclipse FN1</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:149px;">Nikon CFI APO 40XW NIR Objective</td>
			<td style="width:148px;">Nikon</td>
			<td style="width:144px;">N40X-NIR</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:149px;">X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes</td>
			<td style="width:148px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:144px;">MT500-586</td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:149px;">External VCF Oocyte Bath</td>
			<td style="width:148px;">Custom</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td style="width:285px;">Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:149px;">Internal VCF Oocyte Bath</td>
			<td style="width:148px;">Custom</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td style="width:285px;">Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:149px;">Modified Temperature Control Bath</td>
			<td style="width:148px;">Custom</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td style="width:285px;">Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry

פער זלין ביצית החתך פתוח (COVG) טכניקת מהדק מתח מאפשרת ניתוח של מאפייני אלקטרו והקינטית של תעלות יונים Heterologous בביציות. הקלטות מהגדרת החתך פתוח הן שימושיות במיוחד לפתרון זרמים נמוכים gating הגודל, הפעלה נוכחית יונית מהירה, ושחרור משרות. היתרונות העיקריים על פני מהדק מתח שתי אלקטרודות טכניקה (TEVC) כוללים מהירות מוגברת מהדק, יחס אות לרעש משופר, והיכולת לווסת את תאית וסביבה תאית. כאן, אנחנו מעסיקים ערוץ נתרן לב האנושי (HNA V 1.5), הביע ב ביציות Xenopus, כדי להדגים את הגדרת החתך פתוח ופרוטוקול, כמו גם שינויים דרושים כדי להוסיף את יכולת fluorometry מהדק מתח. המאפיינים של ערוצים מהירים להפעלת יון, כגון HNA V 1.5, לא ניתן לפתור באופן מלא ליד טמפרטורת חדר באמצעות TEVC, באשרשעות השלמות של קרום הביצית הוא הידק, מה שהופך את בקרת מתח קשה. עם זאת, בטכניקת החיתוך פתוח, בידוד של רק חלק קטן מקרום התא מאפשר להידוק המהיר יידרש לרשום במדויק קינטיקה מהירה תוך מניעת ערוץ מוזנח הקשורים לטכניקות תיקון מהדק. בשילוב עם טכניקת COVG, קינטיקה ערוץ יון ומאפייני אלקטרו ניתן assayed נוסף באמצעות fluorometry מהדק מתח, שבו תנועת חלבון היא מעקב באמצעות נטיית ציסטאין של fluorophores מיושם extracellularly, החדרה של חלבוני ניאון מקודדים גנטי, או שילוב של חומצות אמינו לא טבעיות לאזור של עניין 1. נתונים נוספים זה מניב מידע קינטית על שחלופי קונפורמציה מתח תלוי של החלבון באמצעות שינויים בmicroenvironment המקיף את מולקולת הניאון.

איור 4 מציג את השינוי בחדירות של הביצית כפתרון saponin מוחל על החלק התחתון של הביצית. איור 5 מדגים את שער חליפין פתרון תאיים על ידי דיפוזיה הבאה permeabilization saponin. 20-40 דקות נדרשות להגיע למצב יציב 2,18. עקבות מופע א...

Watch this Scientific Journal Video about The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry Video at JoVE.com

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry Video (Video) | JoVE

גישת פער זלין החתך פתוח משמשת להשגת הקלטות רעש נמוכות של זרמים יוניים וgating מתעלות יונים מתח תלוי מבוטאים בביציות Xenopus עם רזולוציה גבוהה של קינטיקה ערוץ מהר. עם שינוי קל, fluorometry מהדק מתח יכול להיות מצמידים את פרוטוקול ביצית החתך פתוח.

<em&gt; Xenopus</em&gt; טכניקת ביצית Cut-פתוח וזלין גאפ מתח מהדק עם Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes Video (Video) | JoVE

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method Video (Video) | JoVE

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis Video (Video) | JoVE

רקמות קביעת שווי שימוש בבעלי חיים להשתלות (ACT) Assay ב Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation Video (Video) | JoVE

הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment Video (Video) | JoVE

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis Video (Video) | JoVE

ביצית אחת bisulfite mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts Video (Video) | JoVE

חקר מחסום הניזק לדנ&quot;א באמצעות<em&gt; Xenopus</em&gt; תמציות ביצה

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging Video (Video) | JoVE

מדידת תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; שינויים בזרע אנושי באמצעות ארבע טכניקות: fluorometry הקונבנציונלי, הפסיק fluorometry זרימה, cytometry זרימה והדמיה תא יחיד

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4 Video (Video) | JoVE

Luminometric ושמרים<em&gt; Xenopus</em&gt; ביצית בחינות אלקטרו של Mechanosensitivity המולקולרי של TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment Video (Video) | JoVE

Xenopus laevis כמודל לזיהוי תרגום ירידת ערך

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...