Name: imaging inlc secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen listeria monocytogenes
Uploaded: 2013-09-19T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes at JoVE.com

La investigación en el laboratorio de P. Cossart es apoyado por el Instituto Pasteur, el Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale, el Instituto Nacional de Investigación Agronómica, ERC Advanced Grant (233.348), la Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), la Fundación Louis-Jeantet y la Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK es un beneficiario de una beca de la Universidad de París-Pasteur Internacional de Doctorado del programa / Institut Carnot Maladies infectieuses. Damos las gracias a Jason Mercer para la optimización del protocolo de transfección celular.

1. Preparación de Celular y bacterianas Culturas, Herramientas de transfección y Anticuerpos primarios <ol><li> Preparar una placa de agar fresco para aislar individuo L. monocytogenes colonias a partir de un stock de glicerol bacteriana (50% glycerol/50% saturada cultivo de una noche de líquido bacteriano) mantuvo a -80 ° C. <ol><li> El uso de un bastidor de aluminio (se mantiene a -80 ° C) para el transporte de un Congelados glicerol bacteriana de valores, las bacterias del rayado en una infusión de c...

<ol>
	<li>Pizarro-Cerd&#225;, J., K&#252;hbacher, A., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+Listeria+monocytogenes+in+mammalian+epithelial+cells:+an+updated+view.">Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).</li><li>Mackaness, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+resistance+to+infection.">Cellular resistance to infection.</a> Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).</li><li>Tilney, L. G., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments+and+the+growth,+movement,+and+spread+of+the+intracellular+bacterial+parasite,+Listeria+monocytogenes.">Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes.</a> Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).</li><li>Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+structural+gene+encoding+the+SH-activated+hemolysin+of+Listeria+monocytogenes:+listeriolysin+O+is+homologous+to+streptolysin+O+and+pneumolysin.">Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin.</a> Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).</li><li>Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+L.+monocytogenes+into+cells+is+mediated+by+internalin,+a+repeat+protein+reminiscent+of+surface+antigens+from+gram-positive+cocci.">Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci.</a> Cell. 65, 1127-1141 (1991).</li><li>Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+control+of+Listeria+monocytogenes+virulence+factors+by+a+gene+that+is+autoregulated.">Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated.</a> Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).</li><li>Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L.+monocytogenes-induced+actin+assembly+requires+the+actA+gene+product,+a+surface+protein.">L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein.</a> Cell. 68, 521-52 (1992).</li><li>Glaser, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+Listeria+species.">Comparative genomics of Listeria species.</a> Science. 294, 849-852 (2001).</li><li>Toledo-Arana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Listeria+transcriptional+landscape:+from+saprophytism+to+virulence.">The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence.</a> Nature. 459, 950-956 (2009).</li><li>Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+landscape+of+host-pathogen+interactions+with+the+bacterium+Listeria+monocytogenes.">Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).</li><li>Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -. M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+is+the+receptor+for+internalin,+a+surface+protein+required+for+entry+of+L.+monocytogenes+into+epithelial+cells.">E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells.</a> Cell. 84, 923-932 (1996).</li><li>Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=InIB-dependent+internalization+of+Listeria+is+mediated+by+the+Met+receptor+tyrosine+kinase.">InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase.</a> Cell. 103, 501-510 (2000).</li><li>Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+alpha-and+beta-catenins+in+bacterial+uptake.">A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).</li><li>Ireton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+phosphoinositide+3-kinase+in+bacterial+invasion.">A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion.</a> Science. 274, 780-782 (1996).</li><li>Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Listeria+monocytogenes+protein+InlB+is+an+agonist+of+mammalian+phosphoinositide+3-kinase.">The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).</li><li>Pizarro-Cerd&#225;, J., Jonqui&#232;res, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+protein+patterns+associated+with+Listeria+monocytogenes+InlA-+or+InlB+phagosomes.">Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes.</a> Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).</li><li>Pizarro-Cerd&#225;, J., Payrastre, B., Wang, Y. -. J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+phosphatidylinositol+4-kinases+promote+Listeria+monocytogenes+entry+into+target+cells.">Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells.</a> Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).</li><li>Hamon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modifications+induced+by+a+family+of+bacterial+toxins.">Histone modifications induced by a family of bacterial toxins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).</li><li>Ribet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+impairs+SUMOylation+for+efficient+infection.">Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection.</a> Nature. 464, 1192-1195 (2010).</li><li>R&#228;met, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli.">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416, 644-648 (2002).</li><li>Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li><li>Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen.">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).</li><li>Ripio, M. T., Dom&#237;nguez-Bernal, G., Lara, M., Su&#225;rez, M., Vazquez-Boland, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gly145Ser+substitution+in+the+transcriptional+activator+PrfA+causes+constitutive+overexpression+of+virulence+factors+in+Listeria+monocytogenes.">A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes.</a> Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).</li><li>Rajabian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+virulence+factor+InlC+perturbs+apical+cell+junctions+and+promotes+cell-to-cell+spread+of+Listeria.">The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria.</a> Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).</li><li>Gouin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Listeria+monocytogenes+InlC+protein+interferes+with+innate+immune+responses+by+targeting+the+I&#954;B+kinase+subinit+IKK&#945;.">The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the I&#954;B kinase subinit IKK&#945;.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).</li><li>Pizarro-Cerd&#225;, J., Lecuit, M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+analysing+invasion+of+mammalian+cells+by+bacterial+pathogens:+the+Listeria+monocytogenes+system.">Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system.</a> Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).</li><li>Snijder, B., Sacher, R., R&#228;m&#246;, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection.">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li></ol>

Varios parámetros son críticos para el éxito de nuestro protocolo InlC-detección, incluyendo el uso de líneas de células sanas que muestran un citoplasma suficientemente grande para permitir una detección inequívoca de la señal de InlC. En el ensayo se presentan en este artículo se propone el uso de células HeLa CCL2, que son particularmente muy adecuado para nuestro ensayo debido a la extensión de su espacio citosólico; otros clones de HeLa tales como células HeLa Kioto muestran un citoplasma más pequeñ...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/51043">Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes</a>. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:
Andreas K&#252;hbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerd&#225;1,2,3 
1Unit&#233; des Interactions Bact&#233;ries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020
to
Andreas K&#252;hbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerd&#225;1,2,3 
1Unit&#233; des Interactions Bact&#233;ries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Z&#252;rich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel
The acknowledgments where update from:
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Sant&eacute; et de la Recherche M&eacute;dicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.
to
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Sant&eacute; et de la Recherche M&eacute;dicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

A correction to author list has been made for the article Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication.

Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

La bacteria Gram positiva Listeria monocytogenes es un patógeno transmitido por los alimentos que invade las células huésped, interrumpe su vacuola internalización y se replica en el citoplasma de las células huésped 1. L. monocytogenes facilidad de manipulación en el contexto de laboratorio (rápido crecimiento, baja toxicidad para los individuos sanos) asociado con la persistencia de rasgos de virulencia bacterianas observadas en modelos celulares y animales (actividad hemolítica, leucocitosis) permite su uso inicial en la década de 1960 como un modelo importante para el estudio de parasitismo intracelular y para el establecimiento de los fundamentos teóricos de la inmunidad celular contra la infección 2. A finales de 1980 y principios de 1990, la disección del ciclo intracelular bacteriano 3, así como la caracterización molecular de la virulencia bacteriana más importante factores de 4-7 favoreció el uso de L. monocytogenes como una herramienta clave molecular para la manipulación y el pernoy de las funciones de la célula huésped. La presencia de no virulenta (L. innocua) y (Listeria monocytogenes) especies virulentas en el género Listeria allanaron el camino para estudios genómicos comparativos 8 que, junto con la reciente creación de la completa L. monocytogenes transcriptoma 9, han aumentado nuestra comprensión de la evolución de la L. monocytogenes como un patógeno humano y como un sistema modelo para estudios de infección 10. L. monocytogenes induce su internalización en las células huésped en la interacción de las proteínas de la superficie bacteriana INLA y InlB con sus receptores de células huésped E-cadherina y Met, respectivamente 11-12. Estudios basados ​​en la candidata inicial condujeron a la identificación del enlace cateninas-actina α / β como un componente importante de la vía InlA-13 y la invasión de la fosfoinosítido 3-quinasa (PI 3-K) como un efector crítico de la InlB- casca invasión dependientede 14-15. Ensayos proteómicos y basados ​​funcional posteriormente permitieron la identificación de nuevos elementos del citoesqueleto y 16 segundos mensajeros lipídicos 17 requeridos para la invasión de la célula huésped. Estudios transcripcionales 18 y proteómica cuantitativa basada en la espectrometría de masas 19 se han esclarecido algunos puntos en relación con la activación de cascadas de señalización de acogida y la represión de la respuesta inmune durante la L. monocytogenes infección. La biología de sistemas se acerca basado en la inactivación de los grandes conjuntos de genes (kinomes, genomas completos) por pequeños ARN de interferencia (siRNA) silenciamiento se han abierto recientemente nuevas vías para el análisis de la serie mundial de las cascadas de señalización en el contexto de las funciones celulares específicas, incluyendo la fagocitosis y internalización patógeno 20. Pantallas siRNA del genoma completo han realizado anteriormente para investigar cascadas celulares requeridos para la infección de L. monocytogenes en fagocítica Drosophila </eM&gt; células S2 21-22, pero este tipo de análisis no ha sido realizado en las células no fagocíticas, que representan objetivos críticos para la infección in vivo. Hemos optimizado un protocolo para la detección microscópica de las etapas tardías de la infección por L. monocytogenes que es adecuado para siRNA estudios de alto rendimiento de la entrada de bacterias dentro de las células epiteliales. Nuestro ensayo se aprovecha de una L. altamente invasiva monocytogenes cepa que presenta una mutación puntual en PrfA, el principal regulador de la transcripción de L. monocytogenes factores de virulencia 6: esta mutación (llamado PrfA *) hace que PrfA constitutivamente activa 23 y conduce a un aumento de la expresión de las proteínas de invasión inlA y InlB, por lo tanto, favorecer la entrada de bacterias en células no fagocíticas de lo contrario pobremente infectados. Nuestra lectura para la infección se basa en la detección de la acumulación citosólica de la secretada InlC proteína bacteriana: esta molécula esun efector pleiotrópica que se expresa preferentemente por intra-citoplasmática L. monocytogenes 9 y que participa no sólo en la célula de células-a-bacteriana propagan 24 pero que también modula las respuestas inmunes del huésped 25. El marcaje fluorescente de la secreción de InlC por bacterias intracelulares no sólo permite distinguir claramente infectado a partir de células no infectadas, sino que también representa una lectura de punto final que se puede utilizar para diseccionar posteriormente infección en sus diferentes pasos: entrada, de escape vacuolar, citosólica bacteriana la proliferación y propagación de célula a célula. Este protocolo basado en microscopía-puede estar acoplado a las pantallas de siRNA por lo tanto, para estudiar las vías celulares implicadas en la infección de células huésped por L. monocytogenes.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto Brain Heart Infusion</td>
			<td>BD</td>
			<td>237500</td>
			<td>For liquid BHI preparation</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>Supplement to liquid BHI for BHI agar plates </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>51830-500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>61965-026</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma </td>
			<td>G1397-10ML</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Formaldehyde (16%)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>Prepare fresh before each experiment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Rabbit Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11035</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phalloidin Dy647</td>
			<td>Dyomics</td>
			<td>647-33</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>siRNA Scramble</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001810-10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>siRNA Met</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-003156-00-0005</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 384-well microscopy cell culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3985</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AxioObserver Z1 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>431007 9901</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Metamorph analysis software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>4000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CellProfiler analysis software</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>Public software available at <a href="http://www.cellprofiler.org/" target="_blank">http://www.cellprofiler.org/</a></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

imaging inlc secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen listeria monocytogenes

Patógenos bacterianos intracelulares pueden ser concebidos como herramientas moleculares para disecar cascadas de señalización celular debido a su capacidad para manipular exquisitamente y subvertir las funciones celulares que se requieren para la infección de tejidos diana del huésped. Entre estos agentes patógenos bacterianos, Listeria monocytogenes es un microorganismo Gram positiva que se ha utilizado como un paradigma para el parasitismo intracelular en la caracterización de la respuesta inmune celular, y que ha desempeñado un papel decisivo en el descubrimiento de las vías moleculares que controlan la dinámica del citoesqueleto y de la membrana de la trata. En este artículo se describe un ensayo microscópico robusta para la detección de las etapas de la infección celular tardías de L. monocytogenes basan en el etiquetado fluorescente de InlC, una proteína secretada bacteriana que se acumula en el citoplasma de las células infectadas; este ensayo se puede acoplar a las pequeñas pantallas de ARN de alto rendimiento de interferencia automatizados con el fin de carbonizarterizar vías de señalización celular implicadas en la altura o hacia abajo-regulación de la infección.

Etiquetado fluorescente de citoplasmática InlC proporciona una lectura robusta para la infección de células por L. monocytogenes, como se ilustra en la Figura 1: la célula central en la micrografía es altamente infectadas por la cepa P14.PrfA * 23 como se puede observar en la imagen de contraste de fase (puntas de flecha, Figura 1A) y se confirma por la señal DAPI donde bacterias individuales se pueden distinguir con claridad (fig. 1B). La tinc...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes at JoVE.com

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes es un patógeno bacteriano Gram positiva utilizado frecuentemente como un modelo importante para el estudio de parasitismo intracelular. Imágenes tardías L. monocytogenes etapas de infección en el contexto de los pequeños ARN de interferencia pantallas permite el estudio global de las vías celulares requeridos para la infección bacteriana de las células huésped diana.

Imaging InlC secreción de investigar la infección celular por el patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Utilizando imágenes bioluminiscentes encargado de investigar la sinergia entre Streptococcus pneumoniae Y el Virus de la Influenza en ratones lactantes

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Investigación

Inmunología e Infección

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

La invasión de las células humanas por un patógeno bacteriano

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

La medición de la carga bacteriana y la respuesta inmune en ratones infectados con Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

El insecto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como un modelo de infección poderosa para investigar la patogénesis bacteriana

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

La transmisión oral de<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; En ratones a través de la ingestión de alimentos contaminados

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

La separación automatizada de<em&gt; C. elegans</em&gt; Variablemente colonizada por un patógeno bacteriano

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Evaluación De La Invasión Bacteriana De Las Células Cardíacas En Cultivo Y Colonización Del Corazón En Ratones Infectados Usando Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

La purificación del ARN intracelularmente Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; En los macrófagos

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Responses

La infección experimental con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como un modelo para el estudio de host Respuestas interferón gamma

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...