Name: imaging inlc secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen listeria monocytogenes
Uploaded: 2013-09-19T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes at JoVE.com

Forskning i P. Cossart laboratorium stöds av Pasteurinstitutet, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233.348), Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), Louis-Jeantet Foundation och Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK är en mottagare av ett stipendium från Pasteur-Paris University International Doctoral Program / Institut Carnot Maladies Infectieuses. Vi tackar Jason Mercer för att optimera cell transfektion protokollet.

1. Förberedelser för Cell-och bakteriekulturer, Transfektionsexperiment Verktyg och Primära antikroppar <ol><li> Bered en färsk agarplatta för att isolera enskilda L. monocytogenes kolonier från en bakterie-glycerollager (50% glycerol/50% mättat bakteriell flytande odling över natten) som hölls vid -80 ° C. <ol><li> Med hjälp av en aluminiumställ (förvaras vid -80 ° C) för att transportera en frusen bakterie glycerol lager, strimma bakterier på en Brain Heart Infusion (BHI) agarplatta. </li><l...

<ol>
	<li>Pizarro-Cerd&#225;, J., K&#252;hbacher, A., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+Listeria+monocytogenes+in+mammalian+epithelial+cells:+an+updated+view.">Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).</li><li>Mackaness, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+resistance+to+infection.">Cellular resistance to infection.</a> Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).</li><li>Tilney, L. G., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments+and+the+growth,+movement,+and+spread+of+the+intracellular+bacterial+parasite,+Listeria+monocytogenes.">Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes.</a> Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).</li><li>Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+structural+gene+encoding+the+SH-activated+hemolysin+of+Listeria+monocytogenes:+listeriolysin+O+is+homologous+to+streptolysin+O+and+pneumolysin.">Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin.</a> Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).</li><li>Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+L.+monocytogenes+into+cells+is+mediated+by+internalin,+a+repeat+protein+reminiscent+of+surface+antigens+from+gram-positive+cocci.">Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci.</a> Cell. 65, 1127-1141 (1991).</li><li>Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+control+of+Listeria+monocytogenes+virulence+factors+by+a+gene+that+is+autoregulated.">Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated.</a> Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).</li><li>Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L.+monocytogenes-induced+actin+assembly+requires+the+actA+gene+product,+a+surface+protein.">L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein.</a> Cell. 68, 521-52 (1992).</li><li>Glaser, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+Listeria+species.">Comparative genomics of Listeria species.</a> Science. 294, 849-852 (2001).</li><li>Toledo-Arana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Listeria+transcriptional+landscape:+from+saprophytism+to+virulence.">The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence.</a> Nature. 459, 950-956 (2009).</li><li>Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+landscape+of+host-pathogen+interactions+with+the+bacterium+Listeria+monocytogenes.">Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).</li><li>Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -. M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+is+the+receptor+for+internalin,+a+surface+protein+required+for+entry+of+L.+monocytogenes+into+epithelial+cells.">E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells.</a> Cell. 84, 923-932 (1996).</li><li>Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=InIB-dependent+internalization+of+Listeria+is+mediated+by+the+Met+receptor+tyrosine+kinase.">InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase.</a> Cell. 103, 501-510 (2000).</li><li>Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+alpha-and+beta-catenins+in+bacterial+uptake.">A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).</li><li>Ireton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+phosphoinositide+3-kinase+in+bacterial+invasion.">A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion.</a> Science. 274, 780-782 (1996).</li><li>Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Listeria+monocytogenes+protein+InlB+is+an+agonist+of+mammalian+phosphoinositide+3-kinase.">The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).</li><li>Pizarro-Cerd&#225;, J., Jonqui&#232;res, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+protein+patterns+associated+with+Listeria+monocytogenes+InlA-+or+InlB+phagosomes.">Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes.</a> Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).</li><li>Pizarro-Cerd&#225;, J., Payrastre, B., Wang, Y. -. J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+phosphatidylinositol+4-kinases+promote+Listeria+monocytogenes+entry+into+target+cells.">Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells.</a> Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).</li><li>Hamon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modifications+induced+by+a+family+of+bacterial+toxins.">Histone modifications induced by a family of bacterial toxins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).</li><li>Ribet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+impairs+SUMOylation+for+efficient+infection.">Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection.</a> Nature. 464, 1192-1195 (2010).</li><li>R&#228;met, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli.">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416, 644-648 (2002).</li><li>Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li><li>Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen.">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).</li><li>Ripio, M. T., Dom&#237;nguez-Bernal, G., Lara, M., Su&#225;rez, M., Vazquez-Boland, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gly145Ser+substitution+in+the+transcriptional+activator+PrfA+causes+constitutive+overexpression+of+virulence+factors+in+Listeria+monocytogenes.">A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes.</a> Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).</li><li>Rajabian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+virulence+factor+InlC+perturbs+apical+cell+junctions+and+promotes+cell-to-cell+spread+of+Listeria.">The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria.</a> Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).</li><li>Gouin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Listeria+monocytogenes+InlC+protein+interferes+with+innate+immune+responses+by+targeting+the+I&#954;B+kinase+subinit+IKK&#945;.">The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the I&#954;B kinase subinit IKK&#945;.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).</li><li>Pizarro-Cerd&#225;, J., Lecuit, M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+analysing+invasion+of+mammalian+cells+by+bacterial+pathogens:+the+Listeria+monocytogenes+system.">Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system.</a> Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).</li><li>Snijder, B., Sacher, R., R&#228;m&#246;, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection.">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li></ol>

Flera parametrar är avgörande för att lyckas med vår INLC-upptäckt-protokollet, inklusive användning av friska cellinjer visar en tillräckligt stor cytoplasma för att möjliggöra en entydig detektion av INLC signalen. I analysen presenterar vi i denna artikel föreslår vi användning av HeLa CCL2 celler, som är särskilt väl lämpade för vår analys på grund av förlängning av deras cytosolic utrymme, andra HeLa-kloner såsom HeLa Kyoto celler visa ett mindre cytoplasman men kan användas med vårt infekt...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/51043">Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes</a>. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:
Andreas K&#252;hbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerd&#225;1,2,3 
1Unit&#233; des Interactions Bact&#233;ries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020
to
Andreas K&#252;hbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerd&#225;1,2,3 
1Unit&#233; des Interactions Bact&#233;ries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Z&#252;rich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel
The acknowledgments where update from:
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Sant&eacute; et de la Recherche M&eacute;dicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.
to
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Sant&eacute; et de la Recherche M&eacute;dicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

A correction to author list has been made for the article Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication.

Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Den grampositiva bakterien Listeria monocytogenes är en livsmedelsburen patogen som invaderar värdceller, stör dess intemalisering vakuolen och replikerar i cytoplasman i värdceller 1. L. monocytogenes enkel manipulation i laboratoriet sammanhang (snabb tillväxt, låg toxicitet för friska individer) i samband med ihållande bakteriella virulens drag som observerats i cell-och djurmodeller (hemolytisk aktivitet, leukocytos) får den tas i bruk på 1960-talet som en viktig modell för studier av intracellulär parasitism och för upprättandet av de teoretiska grunderna för cellulär immunitet mot infektion 2. I slutet av 1980 och början av 1990, dissektionen av den bakteriella intracellulära cykel 3 samt molekylär karakterisering av de viktigaste bakteriella virulensfaktorer 4-7 gynnade användningen av L. monocytogenes som en viktig molekylär verktyg för manipulering och study av värdcellfunktioner. Förekomsten av avirulenta (L. innocua) och virulenta (L. monocytogenes) arter i Listeria släktet banade väg för jämförande iska studier 8 som, tillsammans med den nyligen inrättade komplett V. monocytogenes transkriptom 9, har ökat vår förståelse av evolutionen av L. monocytogenes som en mänsklig patogen och som ett modellsystem för infektionsstudier 10. L. monocytogenes inducerar sin interna i värdceller vid interaktion av de bakteriella ytproteiner INLA och INLB med sina värdcellreceptorer E-cadherin och Met, respektive 11-12. Initiala kandidatbaserade studier ledde till identifieringen av α / β catenins-aktin länk som en viktig komponent i INLA-invasionen vägen 13 och fosfoinositid 3-kinas (PI 3-K) som en kritisk effektor av INLB- beroende invasion cascfrån 14 till 15. Proteomik och funktionell-baserade analyser därefter tillåts identifiering av nya cytoskelettala elementen 16 och lipid andra budbärare 17 som erfordras för värdcellinvasion. Transkriptionella studier 18 och masspektrometri-baserad kvantitativa proteomik 19 har nyligen kasta nytt ljus angående aktivering av värdsignaleringskaskader och undertryckande av immunsvar under L. monocytogenes-infektion. Systembiologiska metoder baserade på inaktivering av stora uppsättningar av gener (kinomes, kompletta genom) med små störande RNA (siRNA) ljuddämpning har nyligen öppnat nya vägar för analys av globala värd signaleringskaskader i samband med specifika cellulära funktioner, inklusive fagocytos och patogen interna 20. Genomvid siRNA skärmar har tidigare utförts för att undersöka cellulära kaskader som krävs för infektion av L. monocytogenes i fagocytiska Drosophila </em&gt; S2 celler 21-22, men denna typ av analys har inte utförts på icke-fagocyterande celler, som utgör viktiga mål för infektion in vivo. Vi har optimerat ett protokoll för mikroskopisk upptäcka sena stadier av infektion av L. monocytogenes som är anpassade för hög genomströmning siRNA studier av bakteriell inresa inom epitelceller. Vår analys tar fördel av en mycket invasiva L. monocytogenes stam som uppvisar en punktmutation i PrfA, den huvudsakliga transkriptionsregulator av L. monocytogenes virulensfaktorer 6: denna mutation (uppkallad PrfA *) återger PrfA konstitutivt aktiv 23 och leder till ett ökat uttryck av invasionen proteiner INLA och INLB därför gynnar bakteriell inträde i annars dåligt infekterade icke-fagocytiska celler. Vår avläsning för infektion är baserad på upptäckten av den cytosoliska ackumuleringen av det utsöndrade bakteriella proteinet INLC: Denna molekyl ären pleiotropisk effekt uttrycks företrädesvis genom intra-cytoplasmatisk L. monocytogenes 9 och som deltar inte bara i det bakteriella cell-till-cell sprids 24 men som även modulerar värdimmunsvar 25. Den fluorescerande märkning av INLC utsöndring av intracellulära bakterier inte bara gör det möjligt att tydligt skilja infekterade från icke-infekterade celler, men utgör också en slutpunkt avläsning som kan användas för att senare dissekera infektion i dess olika steg: inresa, vakuolär flykt, cytosoliskt bakterie proliferation och cell-till-cell-spridning. Denna mikroskopebaserat protokoll kan kopplas till siRNA skärmar därför att studera cellulära vägar som är involverade i infektion av värdceller av L. monocytogenes.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto Brain Heart Infusion</td>
			<td>BD</td>
			<td>237500</td>
			<td>For liquid BHI preparation</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>Supplement to liquid BHI for BHI agar plates </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>51830-500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>61965-026</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma </td>
			<td>G1397-10ML</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Formaldehyde (16%)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>Prepare fresh before each experiment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Rabbit Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11035</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phalloidin Dy647</td>
			<td>Dyomics</td>
			<td>647-33</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>siRNA Scramble</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001810-10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>siRNA Met</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-003156-00-0005</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 384-well microscopy cell culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3985</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AxioObserver Z1 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>431007 9901</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Metamorph analysis software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>4000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CellProfiler analysis software</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>Public software available at <a href="http://www.cellprofiler.org/" target="_blank">http://www.cellprofiler.org/</a></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

imaging inlc secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen listeria monocytogenes

Bakteriella intracellulära patogener kan uppfattas som molekylära verktyg för att dissekera cellulära signaleringskaskader på grund av deras förmåga att utsökt manipulera och undergräva cellfunktioner som krävs för infektion av värd målvävnader. Bland dessa bakteriella patogener, är Listeria monocytogenes en grampositiv mikroorganism, som har använts som ett paradigm för intracellulär parasitism i karakteriseringen av cellulära immunsvar, och som har spelat instrument roller i upptäckten av molekylära vägar som kontrollerar cytoskelettala och membran trafficking dynamik. I den här artikeln beskriver vi en robust mikroskopisk analys för detektion av sena cellulär infektionsstadier L. monocytogenes baseras på den fluorescerande märkningen av INLC, ett utsöndrat bakteriellt protein som ackumuleras i cytoplasman hos infekterade celler; denna analys kan kopplas till automatiserade hög genomströmning små störande RNA-skärmar för att förkolnaacterize cellulära signalvägar som är involverade i upp-eller nedreglering av infektion.

Fluorescerande märkning av cytoplasma INLC ger en robust avläsning för cell infektion av L. monocytogenes, såsom illustreras i Figur 1: den centrala cellen i mikrofoto är starkt infekterade av stammen P14.PrfA * 23 som det kan observeras i faskontrastbilden (pilspetsar, Figur 1A) och det bekräftas genom DAPI-signal där enskilda bakterier kan tydligt urskiljas (Figur 1B). Den INLC färgning (lagras till DAPI-färgning i figur 1C) visar hur denn...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes at JoVE.com

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes är en grampositiv bakteriell patogen som ofta används som en viktig modell för studier av intracellulär parasitism. Imaging sent L. monocytogenes infektionsstadier inom ramen för små interfererande RNA-skärmar tillåter den globala undersökning av cellulära vägar som behövs för bakteriell infektion i målgruppvärdceller.

Imaging INLC Sekre att undersöka Cellular Infektion av bakteriell patogen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Använda Bioluminescent Imaging för att undersöka synergi mellan Streptococcus pneumoniae Och influensa A-virus i modersmjölksersättning Möss

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Invasion av mänskliga celler genom en bakteriell patogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Att mäta bakteriehalten och immunsvar hos möss som blivit infekterade med Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Insekten<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Som en kraftfull infektion modell för att undersöka bakteriell patogenes

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Muntlig överföring av<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; I möss via Intag av förorenad mat

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automatiserad Separation av<em&gt; C. elegans</em&gt; Steglös koloniseras av en bakteriell patogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Bedömning av bakteriell invasion av hjärtceller i kultur och hjärtkolonisering hos infekterade möss med hjälp av Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Rening från Intracellulärt Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; I makrofagceller

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Responses

Experimentell infektion med<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Som modell för att studera värd Interferon-y Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...