Name: in vivo two-photon microscopy of single nerve endings in skin
Uploaded: 2014-08-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier Neurotar Ltd pour l&#39;assistance technique, la Fondation de la CIMO et FGSN d&#39;un soutien financier.

Procédures portant sur des sujets animaux ont été approuvés par le Conseil d&#39;expérimentation animale nationale, de la Finlande. 1 Préparation des animaux pour l&#39;imagerie <ol><li> Anesthésier une souris par intraperitional (IP) injection de kétamine (0,08 mg par poids corporel) et de xylazine (0,01 mg par kg de poids corporel). Vérifiez l&#39;anesthésie avec l&#39;arrière réflexe orteil de pincement. </li><li> Plongez les yeux de l&#39;animal en collyre (Viscotears) pour protéger les yeux d...

<ol>
	<li>Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sensory+transduction+in+the+skin.">Mechanisms of sensory transduction in the skin.</a> Nature. 445, 858-865 (2007).</li><li>Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+epidermal+nerves+in+diabetic+neuropathy.">Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy.</a> Neurology. 47, 1042-1048 (1996).</li><li>Wu, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morton's+interdigital+neuroma:+a+clinical+review+of+its+etiology,+treatment,+and+results.">Morton's interdigital neuroma: a clinical review of its etiology, treatment, and results.</a> J. Foot Ankle Surg. 35, 112-119 (1996).</li><li>Lauria, G., Lombardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+biopsy:+a+new+tool+for+diagnosing+peripheral+neuropathy.">Skin biopsy: a new tool for diagnosing peripheral neuropathy.</a> BMJ. 334, 1159-1162 (2007).</li><li>Cheng, C., Guo, G. F., Martinez, J. A., Singh, V., Zochodne, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+plasticity+of+axons+within+a+cutaneous+milieu.">Dynamic plasticity of axons within a cutaneous milieu.</a> J. Neurosci. 30, 14735-14744 (2010).</li><li>Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+Imaging+of+Leukocyte+Homing+and+Migration+in+vivo.">Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo.</a> J Vis Exp. (46), e2062 (2010).</li><li>Sacconi, L., O'Connor, R. P., Jasaitis, A., Masi, A., Buffelli, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+of+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery of cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).</li><li>Robinson, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+injury+to+peripheral+nerves.">Traumatic injury to peripheral nerves.</a> Muscle Nerve. 23, 863-873 (2000).</li><li>Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Marinkovic, P., Reuter, M. S., Brill, M. S., Godinho, L., Kerschensteiner, M., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 4296-4301 (2012).</li><li>Amit, S., Yaron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+systems+for+in+vivo+monitoring+and+microenvironmental+investigations+of+diabetic+neuropathy+in+a+murine+model.">Novel systems for in vivo monitoring and microenvironmental investigations of diabetic neuropathy in a murine model.</a> J Neural Transm. 119, 1317-1325 (2012).</li><li>Yu, H., Fischer, G., Jia, G., Reiser, J., Park, F., Hogan, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transfer+into+the+dorsal+root+ganglion+of+adult+rats.">Lentiviral gene transfer into the dorsal root ganglion of adult rats.</a> Mol Pain. 7, 63 (2011).</li><li>Yuryev, M., Khiroug, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+longitudinal+investigation+of+individual+nerve+endings+in+the+skin+of+anesthetized+mice+using+in+vivo+two-photon+microscopy.">Dynamic longitudinal investigation of individual nerve endings in the skin of anesthetized mice using in vivo two-photon microscopy.</a> J Biomed Opt. 17, 046007 (2012).</li></ol>

Dans ce protocole vidéo, nous démontrons le procédé de formation d&#39;image longitudinal à deux photons non-invasive de terminaisons nerveuses individuelles. La dynamique de l&#39;innervation de la peau est affectée dans des maladies telles que le psoriasis et la neuropathie périphérique 2, et dans les lésions traumatiques 9. L&#39;imagerie à deux photons permet une analyse détaillée des structures de fibres nerveuses dans la matrice de collagène. L&#39;ut...

Terminaisons nerveuses cutanées subissent des changements dynamiques sous différents états physiopathologiques. Les fibres nerveuses peuvent passer par le processus de dégénérescence et de régénération ou de restructuration dans le cadre de maladies telles que la neuropathie périphérique 2 ou Morton neurinome 3. Après un traumatisme, une partie importante de terminaisons nerveuses dynamique dans la peau est réinnervation de la zone endommagée. Cependant, l&#39;approche commune pour enquêter sur les terminaisons nerveuses est ex vivo histologique sectionnement qui manque d&#39;informations en temps réel sur les processus en cours 4. En utilisant des marqueurs fluorescents génétiquement codés, il est possible de suivre les terminaisons nerveuses de la peau d&#39;animaux vivants, obtenant ainsi une information riche et beaucoup plus pertinentes sur les changements structurels. L&#39;étude des terminaisons nerveuses cutanées est possible en utilisant la microscopie à fluorescence classique, cependant, la forte dispersion de la lumière du tissu cutané compromet fortement la qualitédes données acquises 5. La microscopie multiphotonique permet l&#39;acquisition d&#39;images à haute résolution dans les tissus fortement de diffusion en raison de la somme non-linéaire de l&#39;énergie des photons de lumière d&#39;excitation résultant des émissions de fluorescence seulement du point focal de l&#39;objectif. Cet effet conduit à une forte augmentation de la profondeur de pénétration et une amélioration de rapport signal sur bruit de la mesure, dans les tissus de la peau 6. En utilisant le même laser pour l&#39;imagerie, il est possible de produire dissection sélective des fibres nerveuses 7. Dans le protocole suivant, nous montrons le procédé d&#39;imagerie longitudinal de terminaisons nerveuses cutanées in vivo dans des souris transgéniques reporter associé à une lésion sélective au laser disponible dans le commerce en utilisant le système de microscope multiphotonique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1231">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Round cover glass&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:119px;">72296-05</td>
			<td style="width:687px;">5 mm diameter #1.5 thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eye drops Viscotears</td>
			<td style="width:209px;">Novartis</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2mg/g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Superglue Loctite 401</td>
			<td style="width:209px;">Henkel</td>
			<td>135429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketaminol</td>
			<td style="width:209px;">Intervet</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 &#181;g per gramm of animal weight)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rompun</td>
			<td style="width:209px;">Bayer Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 &#181;g per gramm of animal weight)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:687px;">Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol 70%</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Distilled water or Milli-Q water</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringes 1ml&#160;</td>
			<td style="width:209px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">30G 1/2&#34; needles</td>
			<td style="width:209px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic packaging material</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Could be purchaized from general hardware store</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FV-1000MPE microscope</td>
			<td style="width:209px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">FV-1000MPE</td>
			<td>Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">25X XLPlan objective</td>
			<td style="width:209px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">XLPLN 25XWMP</td>
			<td>Water imersion objective optimized for multiphoton imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mai-Tai DeepSee laser (2W)</td>
			<td style="width:209px;">SpectraPhysics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Heating pad</td>
			<td style="width:209px;">Supertech</td>
			<td style="width:119px;">TMP-5b</td>
			<td>Heating pad with a temperature controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metal ring fixator</td>
			<td style="width:209px;">Neurotar Ltd.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td style="width:209px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thy1-YFPH mice strain</td>
			<td style="width:209px;">JaxLab</td>
			<td style="width:119px;">003782</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo two-photon microscopy of single nerve endings in skin

Les terminaisons nerveuses de la peau sont impliqués dans des processus physiologiques tels que la détection d&#39;une aussi dans des processus pathologiques tels que la douleur neuropathique 2. Leur positionnement proche de la surface facilite l&#39;imagerie microscopique de terminaisons nerveuses de la peau chez l&#39;animal intact vivant. En utilisant la microscopie multiphotonique, il est possible d&#39;obtenir des images fines à surmonter le problème de la forte dispersion de la lumière du tissu cutané. Reporter souris transgéniques qui expriment EYFP sous le contrôle de Thy-1 promoteur dans les neurones (y compris la périphérie des neurones sensoriels) sont bien adaptés pour les études longitudinales de chaque terminaisons nerveuses sur des périodes de temps prolongées jusqu&#39;à plusieurs mois, voire toute une vie. En outre, en utilisant le même laser femtoseconde comme pour l&#39;imagerie, il est possible de produire des lésions hautement sélectifs des fibres nerveuses pour les études de la restructuration de fibres nerveuses. Ici, nous présentons un protocole simple et fiable pour multiphotonique longitudinale en imagerie in vivo etmicrochirurgie au laser sur la souris terminaisons nerveuses de la peau.

Selon la méthode décrite, il est possible de suivre la même fibre après la lésion et à l&#39;étude de la dégradation des terminaisons nerveuses endommagées (figure 1). Acquisition de la pile à l&#39;épaisseur de 120 à 150 um est généralement approprié pour l&#39;imagerie répétitive pendant plusieurs jours afin de maintenir l&#39;ensemble de fibres dans le champ de vision. La lésion peut généralement être réalisée de façon concise lorsque le matériau ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin at JoVE.com

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo microscopie à deux photons de terminaisons nerveuses dans la peau simples

Le protocole pour l&#39;imagerie dynamique longitudinale et lésion laser sélectif de terminaisons nerveuses chez des souris transgéniques reporter est présente.

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

Dans l&#39;imagerie in vivo de la moelle épinière de souris utilisant microscopie à deux photons

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Recherche

Neurosciences

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d&#39;enregistrement de neurones identifiés<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Utilisation de neuro-imagerie fonctionnelle par ultrasons rupture de la barrière hémato-encéphalique et le manganèse-IRM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Imagerie biphotonique d&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Deux-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des épines dendritiques dans le cortex de souris utilisant un crâne-Diluée Préparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultanée à deux photons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie d&#39;entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Quantification de l&#39;architecture vasculaire cérébral en utilisant la microscopie à deux photons dans un modèle de souris de la neuro-inflammation induite par le VIH

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Surveillance optique de Living Nerve Terminal Marquer follicule pileux lancéolées Endings du<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Souris oreille peau

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging de neurones corticaux en souris néonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...