Name: simulating pancreatic neuroplasticity: in vitro dual-neuron plasticity assay
Uploaded: 2014-04-14T17:00:00
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Tous les auteurs ont contribué à la création et la validation de l&#39;essai présenté et le projet du manuscrit.

Tous les animaux des procédures expérimentales dans le protocole suivent les directives de protection des animaux de la Technische Universität München, Allemagne. 1. Médias / Préparation Extrait <ol><li> homogénéisation tissulaire La qualité de l&#39;homogénéisation du tissu est essentielle à la détection ultérieure d&#39;altérations neuroplastiques dans les neurones en culture. Ici, il est recommandé un homogénéisateur qui permet la dissociation des tissus sans au...

<ol>
	<li>Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+plasticity+in+the+gastrointestinal+tract:+chronic+inflammation,+neurotrophic+signals,+and+hypersensitivity.">Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity.</a> Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).</li><li>Vasina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neuroplasticity+evoked+by+inflammation.">Enteric neuroplasticity evoked by inflammation.</a> Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).</li><li>Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+enteric+nervous+system+during+intestinal+inflammation.">Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation.</a> Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+in+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+induces+neuronal+plasticity.">The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity.</a> Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).</li><li>Schafer, K. H., Mestres, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GDNF-induced+neurite+outgrowth+and+neuronal+survival+in+dissociated+myenteric+plexus+cultures+of+the+rat+small+intestine+decreases+postnatally.">The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally.</a> Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).</li><li>Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+neural+stem+cells+in+the+enteric+nervous+system.">Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system.</a> Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).</li><li>Liebl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+severity+of+neural+invasion+is+associated+with+shortened+survival+in+colon+cancer.">The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).</li><li>Sch&#228;fer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+isolation+of+myenteric+plexus+from+the+newborn+rat+gastrointestinal+tract.">A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).</li><li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+artemin+are+paracrine+mediators+of+pancreatic+neuropathy+in+pancreatic+adenocarcinoma.">Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+in+chronic+pancreatitis+is+mediated+via+the+neurturin/GFRalpha2+axis.">Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).</li><li>Joseph, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li></ol>

Le présent protocole est destiné à illustrer la méthodologie derrière le dosage de la neuroplasticité du pancréas in vitro qui a été récemment développée par notre groupe pour étudier les mécanismes de la plasticité synaptique dans CaP et CP 5. Le protocole implique une procédure de trois jours qui peut facilement être appliqué une fois l&#39;artiste a acquis une expérience suffisante dans l&#39;isolement et la culture de neurones DRG et MP. En outre, il représente un outil préci...

Altérations de la gastro-intestinale (GI) morphologie de nerf et de la densité ont attiré l&#39;attention des gastro-entérologues et les médecins depuis longtemps, mais leur pertinence pour la physiopathologie de maladies gastro-intestinales reste inconnue 1-3. En effet, plusieurs troubles digestifs très courantes telles que la gastrite, oesophagite par reflux, la colite, la diverticulite, l&#39;appendicite et sont associés à une augmentation de densité d&#39;innervation dans les zones de tissu enflammés 1. Cependant, aucune véritable attention a jusqu&#39;ici été accordée aux mécanismes et la signification de la neuroplasticité dans le tractus gastro-intestinal. Ne nerfs GI morphologiquement modifiées diffèrent des nerfs GI normales, c&#39;est à dire l&#39;état normal du système nerveux entérique, en termes de leur fonction? Quelles sont les implications de contenu modifié neuropeptide / neurotransmetteur dans les nerfs entériques plastique? Est-ce que la neuroplasticité périphérique n&#39;entraîne toujours signalisation modifié pour le système nerveux central? Et où sont les projections centrales de extri plastiqueNSIC voies gastro-neurones? Une longue série de ces questions clés peut être facilement généré lors de la recherche à la rareté de nos connaissances sur les aspects fonctionnels de la GI neuroplasticité. L&#39;étude de GI neuroplasticité au niveau fonctionnel nécessite des modèles expérimentaux valides, reproductibles et encore facilement applicables. Dans l&#39;ère de la popularité et l&#39;acceptation de modèles génétiquement modifiés de souris conditionnelles (GECoMM), comme dans les milieux in vivo portent le potentiel pour élucider facettes jusque-là inconnues de GI neuroplasticité dans un mode réaliste 1. Cependant, la conception et la production de GECoMM reste coûteuse, main-d&#39;œuvre et, surtout, beaucoup de temps. De plus, ils nécessitent la sélection a priori de la cible à condition modulée chez la souris génétiquement modifiée (par exemple, de la surexpression transgénique de facteur de croissance nerveuse / NGF dans les cellules épithéliales intestinales). Ainsi, pour le DESign d&#39;un GECoMM succès, les chercheurs ont besoin de certains indicateurs (par exemple, les données expérimentales précédentes) d&#39;une cible valable, à savoir que la molécule d&#39;intérêt (ici NGF) peut au moins s&#39;attendre à exercer certains effets biologiques pertinents sur les nerfs de GI. De tels indicateurs peuvent facilement être obtenus à partir adéquate des modèles in vitro, dans lequel les sous-types de cellules isolées à partir du micro-environnement complexe d&#39;un système in vivo peuvent être co-cultivées de façon sélective d&#39;une manière hétérotypique 7.4. La modulation de cibles moléculaires dans un tel contexte de culture hétérotypique est en moyenne techniquement moins lourde, plus rapide, et peut donc aider à la pré-filtrage des cibles intéressantes pour la vérification dans les études in vivo. Récemment, nous avons présenté un test in vitro de la plasticité synaptique dans lequel a été conçu pour simuler la densité neuronale accrue et une hypertrophie de ne intrapancréatiquerves dans le cancer pancréatique humaine (cancer de la prostate) et pancréatite chronique (PC) tissus. Ici, les neurones dérivés de nouveau-né dorsale de rat ganglions de la racine (DRG) ou plexus myentérique (MP) ont été exposées à des extraits de tissus de cancer de la prostate subi une résection chirurgicale ou CP tissus spécimens et comparées à celles cultivées dans du pancréas humain normal (NP) des extraits de tissu 5. Au lieu d&#39;extraits de tissus, on peut aussi utiliser surnageants de lignées cellulaires pour étudier l&#39;impact de différents types de cellules sélectionnées sur la neuroplasticité. Lorsqu&#39;il est combiné avec une mesure morphométrique normalisé, le dosage de la neuroplasticité présentée permet une évaluation valide et reproductible de la plasticité neuronale en réponse à différents micro-environnements du pancréas. En particulier, elle permet la simulation d&#39;une) neuroplasticité morphologique, c&#39;est à dire l&#39;évolution de la croissance des neurites, motif de ramification et de la taille des neurones, et 2) la plasticité synaptique fonctionnelle, c&#39;est à dire des altérations de l&#39;excitabilité des neurones périphériques. En outre, non seulement périphérique (c.-à- </em&gt; Entérique), mais aussi central (par exemple la moelle DRG ou second ordre) des neurones peut être inclus dans le présent dosage pour évaluer leur réaction morphologique et fonctionnelle à des contenus différents de tissu gastro-intestinal. Dans le tutoriel vidéo présente, nous démontrons le protocole technique pour la réalisation de ce test et de discuter de ses avantages et ses faiblesses. En outre, nous attirons l&#39;attention sur l&#39;applicabilité de la notion de base de cette analyse à l&#39;étude de la plasticité synaptique dans n&#39;importe quel organe de GI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P1149</td>
			<td style="width:328px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ornithine/laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2533/L4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13mm coverslips</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>For use in 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dismembranator S</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Beta-III-tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1637</td>
			<td>1:200 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFAP-antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0761</td>
			<td>1:400 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RIPA buffer + protease inhibitor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Quality of B-27 is known to depend on the lot number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin/Metronidazol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Minimal essential medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>31095-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>24020133</td>
			<td>Improves collagenase activity when containing Ca/Mg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>Obtain lots with at least 200U/mg activity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA 0,25%</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">analySIS docu software</td>
			<td style="width:149px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simulating pancreatic neuroplasticity: in vitro dual-neuron plasticity assay

Neuroplasticité est une caractéristique inhérente du système et gastro-intestinal (GI) innervation nerveux entérique dans des conditions pathologiques. Cependant, le rôle physiopathologique de la neuroplasticité dans les troubles gastro-intestinaux reste inconnue. Modèles expérimentaux nouveaux qui permettent la simulation et la modulation de GI neuroplasticité peuvent permettre une meilleure appréciation de la contribution de la neuroplasticité en particulier les maladies gastro-intestinales telles que le cancer du pancréas (CaP) et pancréatite chronique (PC). Ici, nous présentons un protocole pour la simulation de la neuroplasticité du pancréas dans des conditions in vitro utilisant des nouveau-nés dorsale de rat ganglions de la racine (DRG) et plexus myentérique (MP) neurones. Cette double approche permet non seulement neurone suivi de deux neuroplasticité organe intrinsèque et extrinsèque, mais représente également un outil précieux pour évaluer la morphologie des neurones et des cellules gliales et l&#39;électrophysiologie. De plus, il permet la modulation fonctionnelle des matières microenvironnement fournis pour l&#39;étude de leur impact sur la neuroplasticité. Une fois établi, le dosage de la neuroplasticité porte présente le potentiel d&#39;être applicable à l&#39;étude de la plasticité synaptique dans un organe digestif.

Neuroplasticité morphologique Dans l&#39;intervalle indiqué par âge de rats nouveau-nés (P2-12) et les densités de semis, les neurones MP et DRG construisent déjà des réseaux neuronaux denses après 48 heures (figure 2A). Comparaison de la densité des neurites entre les neurones cultivés en PCa, CP, et des extraits NP révèle une plus grande densité des neurites des neurones DRG en PCa ou extraits de CP dans des extraits de NP (Figure 2A)</strong...

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Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Plasticité neuronale est une caractéristique de plus en plus reconnue, mais mal compris de la gastro-intestinal (GI). Ici, dans l&#39;exemple de troubles pancréatiques humaines, nous présentons un dosage in vitro de la plasticité synaptique pour l&#39;étude de la plasticité neuronale dans le tractus gastro-intestinal à la fois au niveau morphologique et fonctionnelle.

Simulation pancréatique neuroplasticité:<em&gt; In Vitro</em&gt; Double-neurone Plasticité Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

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