Name: simulating pancreatic neuroplasticity: in vitro dual-neuron plasticity assay
Uploaded: 2014-04-14T17:00:00
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Tutti gli autori hanno contribuito alla creazione e la validazione del test presentato e al progetto del manoscritto.

Tutte le procedure sperimentali animali nel protocollo seguono le linee guida per la cura degli animali della Technische Universität München, Germania. 1. Media / Estratto di preparazione <ol><li> Tissue omogeneizzazione La qualità di omogeneizzazione tessuto è fondamentale per la successiva rivelazione di alterazioni neuroplastici nei neuroni in coltura. Qui, un omogeneizzatore è raccomandato che consente dissociazione tessuto senza grande aumento della temperatura del tessuto...

<ol>
	<li>Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+plasticity+in+the+gastrointestinal+tract:+chronic+inflammation,+neurotrophic+signals,+and+hypersensitivity.">Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity.</a> Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).</li><li>Vasina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neuroplasticity+evoked+by+inflammation.">Enteric neuroplasticity evoked by inflammation.</a> Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).</li><li>Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+enteric+nervous+system+during+intestinal+inflammation.">Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation.</a> Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+in+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+induces+neuronal+plasticity.">The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity.</a> Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).</li><li>Schafer, K. H., Mestres, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GDNF-induced+neurite+outgrowth+and+neuronal+survival+in+dissociated+myenteric+plexus+cultures+of+the+rat+small+intestine+decreases+postnatally.">The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally.</a> Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).</li><li>Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+neural+stem+cells+in+the+enteric+nervous+system.">Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system.</a> Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).</li><li>Liebl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+severity+of+neural+invasion+is+associated+with+shortened+survival+in+colon+cancer.">The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).</li><li>Sch&#228;fer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+isolation+of+myenteric+plexus+from+the+newborn+rat+gastrointestinal+tract.">A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).</li><li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+artemin+are+paracrine+mediators+of+pancreatic+neuropathy+in+pancreatic+adenocarcinoma.">Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+in+chronic+pancreatitis+is+mediated+via+the+neurturin/GFRalpha2+axis.">Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).</li><li>Joseph, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li></ol>

Il presente protocollo ha lo scopo di illustrare la metodologia alla base del pancreas test neuroplasticità in vitro che è stato sviluppato recentemente dal nostro gruppo per studiare i meccanismi di neuroplasticità in PCa e CP 5. Il protocollo prevede una procedura in tre giorni, che può essere facilmente applicato una volta l&#39;artista ha maturato un&#39;esperienza sufficiente per l&#39;isolamento e la cultura del DRG e MP neuroni. Inoltre, esso rappresenta un valido strumento per studiare la...

Alterazioni nei gastrointestinale (GI) morfologia del nervo e la densità hanno catturato l&#39;attenzione di gastroenterologi e patologi per molto tempo, ma la loro rilevanza per la fisiopatologia delle malattie gastrointestinali rimane sconosciuta 1-3. Infatti, alcuni disturbi gastrointestinali molto comuni come la gastrite, esofagite da reflusso, colite, diverticolite e appendicite sono associati ad un aumento della densità innervazione nelle aree di tessuto infiammato 1. Tuttavia, nessuna vera attenzione è stata finora versati ai meccanismi e significato della neuroplasticità nel tratto GI. Sei nervi GI morfologicamente alterati differiscono dalle normali nervi GI, cioè lo stato normale del sistema nervoso enterico, in termini della loro funzione? Quali sono le implicazioni di alterata contenuti neuropeptide / neurotrasmettitore nei nervi enterici di plastica? Fa neuroplasticità periferica comporta sempre la segnalazione alterata al sistema nervoso centrale? E dove sono le proiezioni centrali di Extri plasticaNSIC percorsi neurali GI? Una lunga serie di questioni fondamentali possono essere facilmente generati quando si guarda la scarsità delle nostre conoscenze sugli aspetti funzionali di GI neuroplasticità. Lo studio di GI neuroplasticità a livello funzionale richiede modelli sperimentali validi, riproducibili e ancora facilmente applicabili. In un&#39;epoca di crescente popolarità e l&#39;accettazione di modelli geneticamente condizionato mouse (GECoMM), come nelle impostazioni vivo portano il potenziale per chiarire gli aspetti sconosciuti di GI neuroplasticità in modo realistico 1. Tuttavia, la progettazione e la produzione di GECoMM resta costoso, alta intensità di lavoro e, soprattutto, in termini di tempo. Inoltre, essi richiedono a priori selezione del bersaglio da condizionale modulato nel topo geneticamente alterato (ad es transgenico sovraespressione del fattore di crescita nervoso / NGF in cellule epiteliali enterici). Quindi, per il design di un GECoMM di successo, i ricercatori hanno bisogno di alcuni indicatori (ad esempio, dati sperimentali precedenti) di un obiettivo utile, vale a dire che la molecola di interesse (qui NGF) può almeno aspettare di esercitare alcuni effetti biologicamente rilevanti sui nervi GI. Tali indicatori possono essere facilmente derivate da adeguata in modelli in vitro in cui sottotipi di cellule isolate dal complesso microambiente di un sistema in vivo possono essere selettivamente co-coltivate in maniera eterotipica 4-7. La modulazione di bersagli molecolari in un tale ambiente cultura eterotipica è in media tecnicamente meno ingombrante, più veloce, e può quindi aiutare nella prefiltraggio degli obiettivi validi per la verifica in studi in vivo. Recentemente, abbiamo presentato un test in vitro neuroplasticità in cui è stato progettato per simulare la maggiore densità neurale e ipertrofia delle ne intrapancreaticarves nel cancro del pancreas umano (PCA) e pancreatite cronica (CP) tessuti. Qui, i neuroni derivati ​​da neonato di ratto gangli spinali (DRG) o plesso mioenterico (MP) sono stati esposti a estratti di tessuto da PCa chirurgicamente asportato o CP tessuti esemplari e rispetto a quelle coltivate in normali pancreas umano (NP) estratti di tessuto 5. Invece di estratti di tessuto, si può anche utilizzare supernatanti della linea cellulare di studiare l&#39;impatto di tipi cellulari selezionati TG. Quando combinato con una misurazione morfometrica standardizzato, il saggio neuroplasticità presentata consente di valutare valido e riproducibile di plasticità neuronale in risposta a diversi microambienti pancreatiche. In particolare, esso consente la simulazione di 1) neuroplasticity morfologica, cioè i cambiamenti nella crescita dei neuriti, ramificazione e dimensione neuronale, e 2) neuroplasticity funzionale, cioè alterazioni nella eccitabilità dei neuroni periferici. Inoltre, non solo periferica ( </em&gt; Enterico), ma anche centrale (es. DRG o spinale secondo ordine) neuroni possono essere incluse nella presente saggio per valutare la loro reazione morfologica e funzionale a diversi contenuti di tessuto GI. Nel presente tutorial video, dimostriamo il protocollo tecnico per l&#39;esecuzione di questo saggio e discutere i suoi vantaggi e debolezze. Inoltre, attiriamo l&#39;attenzione sulla applicabilità del concetto di base di questo test allo studio della neuroplasticità in qualsiasi organo GI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P1149</td>
			<td style="width:328px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ornithine/laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2533/L4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13mm coverslips</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>For use in 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dismembranator S</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Beta-III-tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1637</td>
			<td>1:200 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFAP-antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0761</td>
			<td>1:400 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RIPA buffer + protease inhibitor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Quality of B-27 is known to depend on the lot number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin/Metronidazol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Minimal essential medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>31095-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>24020133</td>
			<td>Improves collagenase activity when containing Ca/Mg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>Obtain lots with at least 200U/mg activity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA 0,25%</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">analySIS docu software</td>
			<td style="width:149px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simulating pancreatic neuroplasticity: in vitro dual-neuron plasticity assay

Neuroplasticità è una caratteristica intrinseca del sistema e gastrointestinale (GI) innervazione nervoso enterico in condizioni patologiche. Tuttavia, il ruolo fisiopatologico delle neuroplasticità nei disturbi gastrointestinali rimane sconosciuto. Nuovi modelli sperimentali che consentono la simulazione e la modulazione di GI neuroplasticità possono consentire maggiore apprezzamento per il contributo della neuroplasticità in particolare le malattie gastrointestinali come il cancro del pancreas (PCA) e pancreatite cronica (CP). Qui vi presentiamo un protocollo per la simulazione della neuroplasticità del pancreas in condizioni in vitro utilizzando neonato gangli delle radici dorsali di ratto (DRG) e plesso mioenterico (MP) neuroni. Questo approccio dual-neurone permette non solo il controllo di entrambi neuroplasticità organo intrinseca ed estrinseca-, ma rappresenta anche un valido strumento per valutare la morfologia neuronale e gliale e di elettrofisiologia. Inoltre, consente la modulazione funzionale dei contenuti del microambiente forniti per studiare la loro IMPACt sulla neuroplasticità. Una volta stabilito, il presente saggio neuroplasticity porta il potenziale di essere applicabile allo studio della neuroplasticità in qualsiasi organo GI.

Neuroplasticità morfologica Nella fascia di età indicata di ratti neonati (P2-12) e le densità di semina, MP e DRG neuroni già costruiscono reti neuronali dense dopo 48 ore (Figura 2A). Confronto di densità neurite tra neuroni coltivati ​​in CaP, CP, e estratti NP rivela maggiore densità neuriti dei neuroni DRG PCA o estratti CP rispetto estratti NP (Figura 2A) 5. Abbiamo particolarmente preferiamo i neuroni MP per misure su sin...

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Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Plasticità neuronale è una caratteristica del tratto gastrointestinale (GI) sempre più riconosciuta, ma non sufficientemente compreso. Qui, nell&#39;esempio di disturbi pancreatici umani, presentiamo un neuroplasticity saggio in vitro per lo studio della plasticità neuronale nel tratto GI a livello sia morfologica e funzionale.

Simulazione pancreatica neuroplasticità:<em&gt; In Vitro</em&gt; Dual-neurone Plasticità Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

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