Name: simulating pancreatic neuroplasticity: in vitro dual-neuron plasticity assay
Uploaded: 2014-04-14T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay at JoVE.com

Todos os autores contribuíram para a criação e validação do ensaio apresentados e ao projecto do manuscrito.

Todos os procedimentos experimentais em animais no protocolo de seguir as orientações de cuidados de animais da Technische Universität München, Alemanha. 1. Mídia / Extrato de Preparação <ol><li> Homogeneização Tissue A qualidade de homogeneização de tecidos é crítica para a subsequente detecção de alterações neuroplásticas nos neurónios em cultura. Aqui, um homogeneizador é recomendado que permite a dissociação de tecidos sem grande aumento na temperatura do t...

<ol>
	<li>Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+plasticity+in+the+gastrointestinal+tract:+chronic+inflammation,+neurotrophic+signals,+and+hypersensitivity.">Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity.</a> Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).</li><li>Vasina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neuroplasticity+evoked+by+inflammation.">Enteric neuroplasticity evoked by inflammation.</a> Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).</li><li>Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+enteric+nervous+system+during+intestinal+inflammation.">Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation.</a> Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+in+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+induces+neuronal+plasticity.">The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity.</a> Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).</li><li>Schafer, K. H., Mestres, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GDNF-induced+neurite+outgrowth+and+neuronal+survival+in+dissociated+myenteric+plexus+cultures+of+the+rat+small+intestine+decreases+postnatally.">The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally.</a> Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).</li><li>Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+neural+stem+cells+in+the+enteric+nervous+system.">Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system.</a> Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).</li><li>Liebl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+severity+of+neural+invasion+is+associated+with+shortened+survival+in+colon+cancer.">The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).</li><li>Sch&#228;fer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+isolation+of+myenteric+plexus+from+the+newborn+rat+gastrointestinal+tract.">A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).</li><li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor+and+artemin+are+paracrine+mediators+of+pancreatic+neuropathy+in+pancreatic+adenocarcinoma.">Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).</li><li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+in+chronic+pancreatitis+is+mediated+via+the+neurturin/GFRalpha2+axis.">Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).</li><li>Joseph, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li></ol>

O presente protocolo destina-se a ilustrar a metodologia por trás do ensaio neuroplasticidade pancreática in vitro que foi recentemente desenvolvido pelo nosso grupo para estudar os mecanismos de neuroplasticidade na CaP e CP 5. O protocolo envolve um procedimento de três dias, que pode ser facilmente aplicado uma vez o cantor ganhou experiência suficiente no isolamento e cultivo de DRG e MP neurônios. Além disso, representa uma ferramenta valiosa para estudar a reacção concomitante do entér...

Alterações no (GI) morfologia gastrointestinal nervo e densidade chamaram a atenção de gastroenterologistas e patologistas por um longo tempo, mas a sua relevância para a fisiopatologia das doenças GI permanece desconhecida 1-3. De fato, vários distúrbios GI altamente comuns, tais como gastrite, esofagite de refluxo, colite, diverticulite e apendicite estão associados com o aumento da densidade de inervação em áreas de tecidos inflamados 1. No entanto, nenhuma atenção genuína até agora tem sido dada aos mecanismos e significado da neuroplasticidade no trato GI. Não nervos GI morfologicamente alteradas diferem dos nervos normais GI, ou seja, o estado normal do sistema nervoso entérico, em termos da sua função? Quais são as implicações de conteúdo neuropeptídeo / neurotransmissor alterado nos nervos plástico entéricas? A neuroplasticidade periférica sempre implica sinalização alterados para o sistema nervoso central? E onde estão as projeções centrais do extri plásticoNSIC caminhos neurais GI? Uma longa série de questões-chave pode ser facilmente gerada quando se olha para a escassez de nosso conhecimento sobre os aspectos funcionais do GI neuroplasticidade. O estudo do GI neuroplasticidade a nível funcional requer modelos experimentais válidos, reprodutíveis e ainda facilmente aplicáveis. Em uma época de crescente popularidade e aceitação de modelos geneticamente modificados condicionais do mouse (GECoMM), tais em ambientes vivo suportar o potencial para elucidar anteriormente desconhecidas facetas do GI neuroplasticidade de uma forma realista 1. No entanto, o design e produção de GECoMM continua caro, trabalhoso e, principalmente, demorado. Além disso, elas requerem a priori selecção do alvo a ser condicionalmente modulada no rato geneticamente alterado (por exemplo, a sobre-expressão transgénica do factor de crescimento do nervo / NGF em células epiteliais intestinais). Assim, para a design de um GECoMM bem sucedido, os pesquisadores precisam de alguns indicadores (por exemplo, de dados experimentais anteriores) de um alvo de valor, ou seja, a molécula de interesse (aqui NGF) pode pelo menos esperar para exercer alguns efeitos biologicamente relevantes sobre os nervos gastrointestinais. Tais indicadores podem ser facilmente derivadas a partir de modelos in vitro adequados, em que os subtipos de células isoladas a partir do microambiente complexo de um sistema in vivo podem ser co-cultivadas selectivamente de forma heterotípica 4-7. A modulação de alvos moleculares em tal configuração de cultura heterotípico é, em média, tecnicamente menos pesado, mais rápido, e pode, portanto, ajudar na pré-filtragem de alvos válidos para a verificação em estudos in vivo. Recentemente, apresentamos um ensaio in vitro neuroplasticidade, que foi concebido para simular o aumento da densidade neural e hipertrofia de ne intrapancreáticarves em câncer pancreático humano (PCA) e pancreatite crônica (PC) tecidos. Aqui, os neurônios derivados de recém-nascido rato gânglios da raiz dorsal (DRG) ou plexo mioentérico (MP) foram expostos a extratos de tecidos de CaP ressecadas cirurgicamente ou CP tecidos espécimes e comparados com aqueles cultivados em pâncreas humano normal (NP) extratos de tecidos 5. Em vez de extratos de tecidos, também se pode usar sobrenadantes linha celular para estudar o impacto de tipos de células selecionadas em neuroplasticidade. Quando combinados com uma medição morfométrica padronizado, o ensaio neuroplasticidade apresentado permite a avaliação válidas e reprodutível de plasticidade neuronal em resposta a diferentes microambientes pancreáticas. Em particular, permite a simulação de um) neuroplasticidade morfológico, isto é, as alterações no crescimento de neurites, e de tamanho padrão de ramificação neuronal, e 2) a neuroplasticidade funcional, isto é, alterações na excitabilidade de neurónios periféricos. Além disso, não só periférica (isto é, </em&gt; Entérico), mas também central (por exemplo, DRG ou segunda ordem espinal) neurónios pode ser incluído no presente ensaio, para avaliar a sua reacção morfológica e funcional para diferentes teores de tecido gastrointestinal. Neste vídeo tutorial, vamos demonstrar o protocolo técnico para a realização deste ensaio e discutir suas vantagens e fraquezas. Além disso, chamamos a atenção para a aplicabilidade da noção básica deste ensaio para o estudo da neuroplasticidade em qualquer órgão GI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:149px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">P1149</td>
			<td style="width:328px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ornithine/laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2533/L4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">13mm coverslips</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>For use in 24-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dismembranator S</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Beta-III-tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1637</td>
			<td>1:200 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFAP-antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0761</td>
			<td>1:400 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RIPA buffer + protease inhibitor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Quality of B-27 is known to depend on the lot number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin/Metronidazol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Minimal essential medium</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>31095-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>24020133</td>
			<td>Improves collagenase activity when containing Ca/Mg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase type II</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>Obtain lots with at least 200U/mg activity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA 0,25%</td>
			<td>Gibco/Life sciences</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">analySIS docu software</td>
			<td style="width:149px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simulating pancreatic neuroplasticity: in vitro dual-neuron plasticity assay

A neuroplasticidade é uma característica inerente do sistema e gastrointestinal (GI) inervação nervoso entérico em condições patológicas. No entanto, o papel fisiopatológico neuroplasticidade em doenças GI permanece desconhecido. Novos modelos experimentais que permitem a simulação e modulação da GI neuroplasticidade pode permitir apreciação aprimorada da contribuição da neuroplasticidade em doenças gastrointestinais particulares, tais como o câncer de pâncreas (PCA) e pancreatite crônica (PC). Aqui, apresentamos um protocolo para a simulação da neuroplasticidade pancreático em condições in vitro, utilizando-nascido gânglios rato dorsal root (DRG) e plexo mioentérico (PM) neurônios. Esta abordagem dual-neurônio não só permite a monitorização de ambos neuroplasticidade órgão intrínseca e extrínseca, como também representa uma ferramenta valiosa para avaliar a morfologia neuronal e glial e eletrofisiologia. Além disso, permite a modulação funcional de conteúdos microenvironmental fornecidos para o estudo de sua Impact em neuroplasticidade. Uma vez estabelecido, o ensaio neuroplasticidade presente traz o potencial de ser aplicável ao estudo de qualquer órgão em neuroplasticidade GI.

Neuroplasticidade morfológica Na faixa etária indicada de ratos recém-nascidos (P2-12) e as densidades de semeadura, MP e DRG neurônios já construir redes neuronais densas após 48 horas (Figura 2A). Comparação da densidade neurite entre os neurônios cultivados em CaP, PB e extratos NP revela maior densidade de neurônios DRG neurite em CaP ou extratos CP do que em extrato NP (Figura 2A) 5. Nós particularmente prefiro neurônios ...

Watch this Scientific Journal Video about Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay at JoVE.com

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Plasticidade neuronal é uma característica cada vez mais reconhecida, mas não suficientemente entendido do gastrointestinal (GI). Aqui, no exemplo de desordens pancreáticas humanas, apresentamos um ensaio neuroplasticidade in vitro para o estudo da plasticidade neuronal no tracto gastrointestinal, a nível tanto morfológica e funcional.

Simulando pâncreas Neuroplasticidade:<em&gt; In Vitro</em&gt; Dual-neurônio Plasticidade Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Medicina

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

Desenvolvimento de um ambiente de jogo de áudio baseada Virtual para ajudar com habilidades de navegação em Cegos

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

A Murine Model of Cervical Spinal Cord Injury to Study Post-lesional Respiratory Neuroplasticity

Um modelo murino de Spinal Cord Injury do colo do útero para o Estudo de pós-lesional respiratória Neuroplasticidade

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Multieletrodos Recordings Matriz de Human epiléptica pós-operatória Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Avaliando Encefalopatia Espongiforme Transmissível Espécies Barreiras com uma<em&gt; In Vitro</em&gt; Prion Conversão Protein Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Estudar o cancro do pâncreas Stem características celulares para desenvolver estratégias Novo tratamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

A High-content In Vitro Pancreatic Islet ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Replication Discovery Platform

A-alta conteúdo<em&gt; In Vitro</em&gt; Replicação plataforma de descoberta de células-β das ilhotas pancreáticas

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Inchaço na Organóides intestinal induzida por forscolina: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio para a Avaliação de Medicamentos Response na Fibrose Cística Os pacientes

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

Aplicação de anastomose to-end em robótica pancreatectomia Central

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Intraportal transplante de ilhotas pancreáticas no modelo de Mouse

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...