Name: imaging denatured collagen strands in vivo and ex vivo via photo-triggered hybridization of caged collagen mimetic peptides
Uploaded: 2014-01-31T13:00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides at JoVE.com

Forfatterne takker Gilbert Green for teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIAMS / NIH (R01-AR060484) og DOD (W81XWH-12-1-0555) tildelt SMY, og fra NIH (U24 CA92871 og U54 CA151838) tildeles MGP

Alle animalske undersøgelser blev gennemført i overensstemmelse med reglerne i Johns Hopkins Animal Care og brug Udvalg. 1.. Nær infrarød (NIR) fluorescensimagografi af Skeletal Kollagen Remodeling In vivo <ol><li> Foto-aktivering af bur CMP haleveneinjektion <ol><li> Forbered 110 pi bur CMP løsning til hver mus (20-30 g mus vægt): 100 ul opløsning til dosering, med en ekstra 10 pi stødpude for eventuelle tab under overførsel og injektion. Bland 11 pi IR680-Ahx-NB (GPO) 9 stamopløsning (400 uM) med 11 pi 100 m cystein i steril PBS opløsning; derefter bringe det samlede volumen til 110 pi med 1x PBS buffer. Den endelige peptid opløsning indeholder 4 nmol IR680-Ahx-NB (GPO) 9 og 1 nmol cystein i 100 pi 1x PBS-opløsning. </li><li> Langsomt afmeldingw peptid opløsning i en 0,5 ml insulinsprøjte med en gennemsigtig cylinder og en lille gauge (28-30 G) nål, og fjern forsigtigt luftbobler. Tænd UV-lampen lade lampen varme op i 2-5 min. </li><li> Placer peptid-holdige sprøjte direkte under UV-lampe (365 nm,&gt; 25 mW / cm 2) i 5 min for at muliggøre foto-aktivering. </li><li> I mellemtiden, skal du placere musen i en fastholdelsesanlæg under en opvarmet lampe, mærke musen med en permanent markør på halen eller anden identifikation metoder såsom øremærke eller tå tatovering, og desinficere halen med 70% alkohol. </li><li> Umiddelbart efter UV-aktivering, injiceres 100 pi UV-aktiverede IR680-Ahx-NB (GPO) 9 opløsning i halevenen, fortrinsvis ved den bageste del af halen. Anbring musen tilbage i buret efter injektion. </li></ol></li><li> NIR fluorescensimagografi af kollagen remodeling aktivitet <ol><li> Setvarmepladen af ​​billedtromlen seng impulsen billeddanneren til 37 ° C under anvendelse af Pearl Impulse 2.0-software. </li><li> Sæt nøgen eller barberet mus i anæstesi induktion kammer, der indeholder 2% isofluran i oxygen. Kontroller anæstesidybden plan ved manglende musen under håndtering og ved at overvåge frekvensen af ​​respirations (~ 1/sek). </li><li> Når musen er bedøvet, skal du åbne Pearl Imager skuffe, og placere dyret på imaging sengen. Fjern hurtigt næsekeglen stikket, og skub musens snude inde i næsen kegle til at holde musen under anæstesi (2% isofluran i ilt leveret ved 2 l / min gennem næsen kegle) under billeddannende proces. Når musen er på plads, lukke skuffen. </li><li> Når instrumentet angiver &quot;klar&quot; på billedet software panelet, klik på &quot;700-kanal&quot;, &quot;hvide lys&quot; og &quot;85 micron&quot; bokse efterfulgt af &quot;tilegne billedet knappen&quot;. NIR (excitation 685 nm, emission 720 nm) enD Hvid lys fotografier vil derefter blive taget med automatisk fokus og eksponering. </li><li> Når optagelsen er færdig, skal du åbne skuffen, vend musen og hente billeder fra en anden vinkel. Musen kan placeres med sin front (ventrale), tilbage (dorsale) eller siderne vender kameraet. Smalle strimler af tape kan bruges som begrænsninger til at strække sine lemmer for at få den bedste visning af regionen af interesse (f.eks brystkassen, ankler og håndled). </li><li> En ordentlig tid til at observere skelet optagelse af IR680-CMP er mellem 24-96 timer efter injektion (HPI), baseret på den dosis (~ 4 nmol / mus). At erhverve billeder i høj opløsning, ofre musen ved dislokation af halsen, mens under dyb anæstesi efter 72 HPI, fjern skindet (og hår) ved hjælp af kirurgiske pincet og saks, og image ved NIR-fluorescens som beskrevet ovenfor. </li><li> Analyser de erhvervede NIR fluorescens billeder. </li></ol></li></ol> 2. Visualisering af collagener i Ex vivo0; Vævssnit <ol><li> Materiale forberedelse <ol><li> Forbered 1 ml 10% (w / v) BSA-opløsning i deioniseret vand. Tø 1 ml gedeserum i et vandbad ved stuetemperatur. Skær et par stykker af Parafilm i størrelse på cirka 2 cm x 5 cm. </li><li> Forbered 10 ml blokerende buffer ved at blande 500 pi gedeserum, 1 ml 10x PBS og 8,5 ml deioniseret vand. Forbered 5 ml CMP fortyndingsbuffer ved at fortynde 50 pi af 10% (w / v) BSA med 4,45 ml deioniseret vand og 500 pi 10x PBS. </li><li> Fortyndes stamopløsninger af carboxyfluorescein-mærket bur CMP CF NB (GPO) 9 (480 uM), til 5 uM hjælp CMP fortyndingsbuffer. Optimal CMP koncentrationen varierer fra 2,5 til 30 uM, afhængigt af typen af ​​væv og arten af ​​vævsprøver. Et volumen på 100 pi anbefales til farvning et vævssnit slide. Opbevar formuleret CMP solutioner i mørke. </li><li> Lad musen hornhinde vævsobjektglassene tempereres til stuetemperatur. Glassene inkuberes i 1x PBS-buffer i 5 minutter. Musen hornhinden væv, der anvendes i denne demonstration er foranstillet med 4% paraformaldehyd i PBS-opløsning i 1 time, kryopræserveret i Tissue-Tek oktober medium cryosectioned til 8 um tykkelse og monteret på ladede objektglas. </li></ol></li><li> Vævsfarvning og billedbehandling <ol><li> Anbring dine dias i et fugtigt kammer. Til hver slide anvende 0,5 ml blokerende opløsning og inkuber objektglassene i 30 minutter ved stuetemperatur. Den blokerende opløsning fjernes ved at duppe dias på et stykke køkkenrulle. </li><li> Anvend cirka 100 ul CF NB (GPO) 9 løsninger til at dække vævssnit af hvert dias. Glassene inkuberes i 2 min for at tillade CMP løsning til at gennemtrænge vævene. </li><li> Tænd UV-lampen. Når lampen er varmet op, udsætte CMP-dækket væv selvKTIONER til UV-lys i 6 minutter (365 nm ~ 8 mW / cm 2) at afbeskytte bur kystforvaltningsplaner. Efter UV-eksponering, dække vævssnit af hvert objektglas med et stykke parafilm for at forhindre udtørring. Objektglassene anbringes i befugtet kammer og inkubere dem ved 4 ° C i 2 timer. </li><li> Forbered en 1:3000 fortynding af DAPI løsning i 1x PBS. Efter CMP farvning, forsigtigt fjerne Parafilm med en pincet, og duppes dias på et stykke køkkenrulle for at fjerne overskydende CMP løsning. Anvend cirka 100 pi fortyndet DAPI løsninger på hvert væv objektglas og inkuberes i 1 min ved stuetemperatur. </li><li> Efter farvning nedsænke objektglassene i 1x PBS-buffer i en farvning krukke i 5 min. Gentag denne 3x i frisk 1x PBS til at vaske ubundne farvningsmidler. </li><li> Tilføj en dråbe montering medium på vævssnittet og dække den med et glas dækning slip samtidig undgå fældefangst luftbobler. Sæt dias i en pap dias bakke for at beskytte dem mod lys. </li><li>Billede kollagen strenge (FITC Channel) og cellekerner (DAPI kanal) i vævsobjektglassene ved hjælp af en fluorescens mikroskop. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+collagen+strands+by+photo-triggered+triple-helix+hybridization.">Targeting collagen strands by photo-triggered triple-helix hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14767-14772 (2012).</li><li>Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fibrosis:+therapeutic+translation+for+fibrotic+disease.">Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease.</a> Nat. Med. 18, 1028-1040 (2012).</li><li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases:+regulators+of+the+tumor+microenvironment.">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li><li>Costa, A. G., Cusano, N. E., Silva, B. C., Cremers, S., Bilezikian, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+K:+its+skeletal+actions+and+role+as+a+therapeutic+target+in+osteoporosis.">Cathepsin K: its skeletal actions and role as a therapeutic target in osteoporosis.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 7, 447-456 (2011).</li><li>Perentes, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+imaging+of+extracellular+matrix+remodeling+by+tumor-associated+fibroblasts.">et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts.</a> Nat. Methods. 6, 143-145 (2009).</li><li>Breurken, M., Lempens, E. H. M., Meijer, E. W., Merkx, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-synthesis+of+a+protease-activatable+collagen+targeting+probe.">Semi-synthesis of a protease-activatable collagen targeting probe.</a> Chem. Commun. 47, 7998-8000 (2011).</li><li>Wang, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+modification+of+collagen+scaffolds+mediated+by+triple+helical+propensity.">Spatio-temporal modification of collagen scaffolds mediated by triple helical propensity.</a> Biomacromolecules. 9, 1755-1763 (2008).</li><li>B&#228;chinger, H. P., Morris, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+thermal+stability+of+type+II+collagen+in+various+solvents+used+for+reversed-phase+high+performance+chromatography.">Analysis of the thermal stability of type II collagen in various solvents used for reversed-phase high performance chromatography.</a> Matrix. 10, 331-338 (1990).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+collagenous+proteins+by+fluorescently+labeled+collagen+mimetic+peptides.">Direct detection of collagenous proteins by fluorescently labeled collagen mimetic peptides.</a> Bioconjugate Chem. 24, 9-16 (2013).</li><li>Li, Y., Mo, X., Kim, D., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-tethered+collagen+mimetic+peptides+for+studying+heterotrimeric+triple-helical+interactions.">Template-tethered collagen mimetic peptides for studying heterotrimeric triple-helical interactions.</a> Biopolymers. 95, 94-104 (2011).</li><li>Stahl, P. J., Cruz, J. C., Li, Y., Yu, S. M., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-the-resin+N-terminal+modification+of+long+synthetic+peptides.">On-the-resin N-terminal modification of long synthetic peptides.</a> Anal. Biochem. 424, 137-139 (2012).</li><li>Wang, A. Y., Mo, X., Chen, C. S., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+modification+of+collagen+directed+by+collagen+mimetic+peptides.">Facile modification of collagen directed by collagen mimetic peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 4130-4131 (2005).</li><li>Wang, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+growth+factors+on+collagen+scaffolds+mediated+by+polyanionic+collagen+mimetic+peptides+and+its+effect+on+endothelial+cell+morphogenesis.">Immobilization of growth factors on collagen scaffolds mediated by polyanionic collagen mimetic peptides and its effect on endothelial cell morphogenesis.</a> Biomacromolecules. 9, 2929-2936 (2008).</li><li>Mo, X., An, Y. J., Yun, C. S., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-assisted+visualization+of+binding+interactions+between+collagen+mimetic+peptide+and+collagen+fibers.">Nanoparticle-assisted visualization of binding interactions between collagen mimetic peptide and collagen fibers.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2267-2270 (2006).</li><li>Chan, T. R., Stahl, P. J., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-bound+VEGF+mimetic+peptides:+design+and+endothelial+cell+activation+in+collagen+scaffolds.">Matrix-bound VEGF mimetic peptides: design and endothelial cell activation in collagen scaffolds.</a> Adv. Funct. Mater. 21, 4252-4262 (2011).</li><li>van Hagen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+radiolabelled+cyclic+DTPA-RGD+analogue+for+tumour+imaging+and+radionuclide+therapy.">Evaluation of a radiolabelled cyclic DTPA-RGD analogue for tumour imaging and radionuclide therapy.</a> Int. J. Cancer. 90, 186-198 (2000).</li><li>Boudko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleation+and+propagation+of+the+collagen+triple+helix+in+single-chain+and+trimerized+peptides:+transition+from+third+to+first+order+kinetics.">Nucleation and propagation of the collagen triple helix in single-chain and trimerized peptides: transition from third to first order kinetics.</a> J. Mol. Biol. 317, 459-470 (2002).</li><li>Ackerman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+dependence+of+the+folding+of+collagen-like+peptides.">Sequence dependence of the folding of collagen-like peptides.</a> J. Biol. Chem. 274, 7668-7673 (1999).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li><li>Brodsky, B., Persikov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+the+collagen+triple+helix.">Molecular structure of the collagen triple helix.</a> Adv. Prot. Chem. 70, 301-339 (2005).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Som det kan ses i denne protokol, levering af CMP er ligetil, da UV-aktivering af bur kystforvaltningsplaner er den eneste yderligere skridt til fælles haleveneinjektion protokoller 19. Det centrale er at injicere peptid sonder i en uncaged og metastable single-streng tilstand. Buret gruppe forhindrer CMP fra saml-selv og binding til kollagener (figur 2B), indtil den fjernes ved UV-lys på hvilket tidspunkt CMP begynder at folde ind i triple helix. Formulering injektion indeholder cystein, som hurtigt kan reagere med det spaltede bur gruppe under UV-bestråling for at minimere toksicitet. Talrige mus med forskellige stammer (f.eks SKH-1 og DR-1) er blevet testet ved hjælp af denne formulering, og vi ikke afsløre eventuelle adfærdsmæssige eller andre sundhedsmæssige defekter i disse mus op til seks måneder. Hvis injektionen ikke følger umiddelbart efter UV-eksponering, vil kystforvaltningsplaner fold i homotrimert tredobbelte spiraler, som ikke har nogen hybridisering kapacitet. Figur 2C viser et ekstremt tilfælde, hvor før injektion de kystforvaltningsplaner var fuldt samles igen i tredobbelte spiraler med lang forsinkelse tid (&gt; 2 dage). For at omgå dette problem, bør CMP løsning udarbejdes i relativt lav koncentration (f.eks ~ 40 uM), og injiceret i musene umiddelbart efter UV-decaging. På grund af den langsomme triple helix folde satsen for kystforvaltningsplaner i fortyndede betingelser (halv tid refoldning:&gt; 50 min) og den korte UV-eksponering og injektion tid (5 ~ 7 min i alt), de fleste af de kystforvaltningsplaner ind i blodbanen i single- streng form, når denne protokol følges. Når injiceret, kystforvaltningsplaner forventes at forblive som enkelt-strenge, da koncentrationen er reduceret med en faktor 20 i blodet pulje, hvilket fører til dramatisk reduktion i reassembling kurs 18.. Hvis indsprøjtningen forsinkes (fx på grund af håndtering af dyr), og der er mistanke om homotrimert genfoldning kan de delvist samlede peptider igen ved opvarmning til over 7076; C til adskille kystforvaltningsplaner til enkelt-strenge, efterfulgt af hurtig afkøling og injektion. Selvom mindre praktisk, også sådan varme-dissocierede kystforvaltningsplaner viser forventede resultater af in vivo målretning (Figur 2D). I denne demonstration, blev nøgne mus anvendes til NIR fluorescensimagografi, fordi op til 50% af NIR-signalet kan blive blokeret af hår. Når du arbejder med hår musemodeller (især dem med sorte hår), anbefaler vi, barbering musen i området af interesse forud for billeddannelse ved hjælp af en elektrisk barbermaskine eller hår remover. I figur 1 er der falske positive signaler fra dyrets bughulen, som er forårsaget af autofluorescens af chlorophyler i dyrets kost. Sådanne baggrund signaler kan være betydeligt nedsat ved at skifte musen til oprensede diæter cirka 4 dage før billeddannelse. Som det ses i figur 1 og 2A, der er stærke CMP optræk i halen spin-e. Derfor, for at undgå artefakter som følge af ufuldkommen haleveneinjektioner, anbefaler vi at injicere ved den bageste del af halen, så injektionsstedet ikke er fanget i fluorescens billedet. Det mærkede CMP muliggør målretning og billeddannelse af bestemte steder collagen remodeling in vivo, som er vanskelige at påvise med andre metoder. For eksempel er de ELISA-baserede blod og urin assays er følsomme over for spaltede kollagen telopeptid-fragmenter, men metoden kan ikke lokalisere kilden til collagenet omsætning, fordi den er rettet mod opløselige antigener. De væsentligste begrænsninger i in vivo imaging teknik med NIR mærkede kystforvaltningsplaner er dybde-of-penetration dæmpning og afkøling af proksimale samlet røde celler som hæmoglobin er et endogent quencher på 680/710 nm NIR farvestoffer. Fremtidige anvendelser af CMP in vivo imaging omfatter SPECT eller PET-billeddannelse ved hjælp kystforvaltningsplaner mærket med direkte gamma-emitterende radionuklider eller med positron emitters for diagnostiske for sygdomstilstande, der involverer kollagen remodeling (fx osteoporose, arthritis, aterosklerose og fibrose). Disse radioaktivt mærkede CMP analoger vil fjerne begrænsningerne af signaltab pga. vævsdybde og tilstedeværelse af puljede røde celler, og vil give kvantitative målinger af syge væv. Hertil kommer, at relativt sent billedbehandling tid (fx 48-96 HPI) som følge af langsom binding og clearance af kystforvaltningsplaner kan gøre det vanskeligt at følge hurtige ændringer i collagen remodeling. En sådan begrænsning kan overvindes ved yderligere engineering af de bindende kinetik og affinitet CMP billeddannende agenter. Da CMP binder til denaturerede collagener, der har lidt struktur, CMP-baserede kollagen imaging er et supplement til anden harmonisk generation mikroskopi som kun billedfiler kollagen fibre 5. Når farvning vævssnit med fluorescens mærkede kystforvaltningsplaner, fandt vi det gavnligt at inkubereprøverne i UV-aktiverede peptid løsninger ved 4 ° C, idet den tredobbelte spiralformede hybridisering lettes ved lavere temperatur 1,20. Det blev også konstateret, at nedsænke dias i frisk PBS-buffer i en farvning krukke er den mest effektive måde at vaske ubundne kystforvaltningsplaner, som virker meget bedre end blot pipettering vaskebuffere over prøverne. CMP-collagen streng hybridisering er meget specifik og robust, og derfor den simple farvningsprotokol præsenteres i denne video kan let modificeres til costaining yderligere biomarkører, og til at identificere forringede kollagener i ufikserede vævssnit. Dette er en effektiv og praktisk alternativ til at bruge anti-kollagen antistoffer til påvisning af fiber kollagener i forskellige histologiske prøver.

Kollagen, den mest rigelige protein i pattedyr, spiller en kritisk rolle i væv udvikling og regeneration ved at støtte proliferation og differentiering af cellerne. Mens fibrøse collagener (f.eks type I, II), i bindevæv giver mekanisk styrke til vævene, netværket-lignende collagen (type IV) danner basis stillads af basalmembranen, hvor celler vedhæfte og danner organiserede væv. Kollagen remodeling involverer både collagen nedbrydning (af proteaser) og syntese (fremmes af vækstfaktorer). Selvom collagen remodeling, for eksempel i knogler, er en del af det normale væv fornyelsesproces, overskydende remodeling aktivitet eller dens forekomst i unormale steder, typisk indikerer sårheling respons på en skade eller kronisk patologiske tilstande som kræft, knogleskørhed, gigt og fibrose 1-4. Evnen til direkte billede kollagener undergår remodeling in vivo kan føre til forståelse af de fremskridt,ion af disse sygdomme, samt nye diagnostik og terapi. For eksempel kan billeddannelse, giver oplysninger om sværhedsgraden og placeringen af ​​de sygdomme, og kan også anvendes til at vurdere effektiviteten af ​​nye terapeutiske midler. Multiphoton laserscanning mikroskopi og anden harmonisk generation er blevet anvendt på billedet fibrillære collagener til overvågning ekstracellulær matrix remodellering i tumor i levende mus 5.. Denne teknik kræver imidlertid dyr, der skal monteres med gennemsigtige dorsal skinfold kamre, som er en invasiv procedure. Direkte og noninvasiv imaging af collagen remodeling vil drage fordel af en sonde, der specifikt er rettet mod collagen undergår remodeling. En sådan sonde er svært at forberede sig, da det er nødvendigt at skelne mellem de remodeling collagener fra de intakte og modne kollagener, der er rigelige i normale væv 6. Kollagen består af ekstremt sjældne proteinstruktur kaldet triple helix, som erspaltes af proteaser, såsom matrixmetalloproteinaser (MMP) i collagen remodeling. De spaltede kollagenfragmenter mister deres tredobbelte spiralformede struktur og blive ufoldede strenge (gelatine), som yderligere fordøjes af uspecifikke proteaser 1. Det blev for nylig opdaget, at kollagen mimetiske peptid (CMP), som har tilbøjelighed til at folde i tredobbelt helixstruktur specifikt kan målrette kollagen strenge, der adskilles fra den tredobbelte spiralformede tilstand ved enten varmedenaturering eller ved enzymatisk nedbrydning 1,7. Bindingen er primært drevet af triple-helix hybridisering mellem monomere kystforvaltningsplaner og denaturerede kollagen tråde. Fordi kystforvaltningsplaner selv samle ind homotrimert tredobbelte spiraler ved stuetemperatur med lille drivkraft for kollagen hybridisering et bur CMP [(GPO) 4 NB GPO (GPO) 4, der er udpeget som NB (GPO) 9 O: hydroxyprolin] blev udviklet , som indeholder en foto-spaltelig nitrobenzylgruppe (NB) er fastgjort til den centrale glycin i peptidet. Den NB bur gruppe sterisk forhindrer CMP folde ind i triple helix endnu, fjernelse af buret gruppe ved UV-bestråling straks udløser den tredobbelte spiralformede foldning og collagen hybridisering 1.. Når monomere kystforvaltningsplaner mærket med nær infrarød (NIR) fluorophores er systemisk leveres til at modellere mus, kan de specifikt målrette og tillade in vivo billeddannelse af denaturerede collagener i væv, der gennemgår normal (f.eks knogle og brusk) og patologiske (f.eks tumorer) remodeling 1 . Fluorescensmærkede kystforvaltningsplaner kan også anvendes til billeddannelse af collagener i histologiske vævssnit. I histologisk undersøgelse, der er høstet væv ofte konserveret ved fiksering til at holde de cellulære komponenter og samlet vævsmorfologi fra forringelse. Fastgørelseselementerne procedurer, der omfatter varme og behandling med organiske opløsningsmidler, og kemiske tværs linking reagenser (f.eks paraformaldehyd) denaturere den tredobbelte spiralformede struktur af collagen 8. Denne denaturering genererer websteder for CMP hybridisering. Det er blevet vist, at fluorescensmærkede kystforvaltningsplaner specifikt kan binde til collagener i faste vævssnit (f.eks hud, hornhinde, og ben) endnu mere effektivt end et anti-collagen-antistof, hvilket tillod facile identifikation af patologiske tilstande i fibrotiske levervæv 9. CMP er rettet denatureret kollagen strenge indeholdende aminosyresekvensen af ​​tredobbelte spiralformede motiver, der er fælles for alle typer af collagener. Derfor CMP kan betragtes som en bredspektret collagen farvning agent. Her præsenterer vi detaljerede eksperimentelle procedurer for i) billeddannelse denaturerede kollagen strenge in vivo og ii) visualisere collagener i ex vivo vævssnit ved hjælp af fluorescens-mærkede bur kystforvaltningsplaner. Et NIR tag, IR680 blev konjugeret til det bur CMP for levende billeddannelse, while carboxyfluorescein (CF) blev anvendt i vævsfarvning arbejde for dens forenelighed med standard fluorescens mikroskoper. Denne protokol fokuserer på imaging anvendelse af kystforvaltningsplaner som relateret til collagen remodeling. Metoder til CMP syntese kan findes i tidligere rapporter 1,7,9-15. I denne video rapport blev billeddannelse skelet væv i normale mus og vævssnit af mus hornhinde valgt til demonstration, men de metoder, der præsenteres her let kan anvendes til mange patologier og biologiske modeller, der involverer collagen remodeling (f.eks tumorer, sårheling), som samt næsten enhver foranstillet vævsprøve, som indeholder kollagener.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IRdye 680RD Maleimide (IR680)</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">929-71050</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5(6)-Carboxyfluorescein</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">21877-5G-F</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:123px;">Advanced Chemtech</td>
			<td style="width:137px;">YC2200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:123px;">Butler Veterinary Supply</td>
			<td style="width:137px;">4/4/5260</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat Serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">G9023-10ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A9647</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:123px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:137px;">10236276001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluoroshield mounting medium</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">F6182-20ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:643px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringes</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:137px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV lamp</td>
			<td style="width:123px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:137px;">1447T17</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Pearl impulse imager</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">9400</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Surgical forceps and scissors</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EasyDip slide staining system</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;">M900-12B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">20-place cardboard microscope slide tray</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:123px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">12-545-c</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;">Eclipse TE2000-E</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging denatured collagen strands in vivo and ex vivo via photo-triggered hybridization of caged collagen mimetic peptides

Kollagen er en væsentlig strukturel komponent af den ekstracellulære matrix, der understøtter vævsdannelse og vedligeholdelse. Selvom collagen remodeling er en integreret del af den normale væv fornyelse, er overdreven mængde remodeling aktivitet er involveret i tumorer, gigt og mange andre patologiske tilstande. I collagen remodeling, er den tredobbelte spiralformede struktur kollagenmolekyler forstyrret af proteaser i det ekstracellulære miljø. Desuden er collagener til stede i mange histologiske vævsprøver delvist denatureret ved fikseringen og præservering. Derfor kan disse denatureret kollagen tråde tjene som effektive mål for biologisk billeddannelse. Vi har tidligere udviklet et bur kollagen mimetisk peptid (CMP), der kan være tilgængeligt udløses til at hybridisere med denaturerede kollagen strenge ved dannelse af tredobbelt skruelinjeformet struktur, der er unik for collagener. De overordnede mål for denne procedure er i) billedet denaturerede kollagen strenge resulting fra normale remodeling aktiviteter in vivo, og ii) at visualisere kollagener i ex vivo vævssnit ved hjælp af foto-udløst bur kystforvaltningsplaner. For at opnå en effektiv hybridisering og vellykket in vivo og ex vivo imaging, fluorescensmærkede bur kystforvaltningsplaner er enten foto-aktiverede umiddelbart før intravenøs injektion, eller er direkte aktiveret på vævssnit. Normal skelet kollagen remolding i nøgne mus og collagener i foranstillede mus hornhinden vævssnit afbildes i denne procedure. De billeddannende metode baseret på CMP-collagen hybridisering teknologi præsenteres her, kan føre til en dybere forståelse af vævsremodellering proces, samt tillade udvikling af nye diagnostiske metoder til sygdomme forbundet med høj collagen remodeling aktivitet.

Figur 1 viser et typisk resultat af, hvor tilgængeligt udløses IR680-Ahx-(GPO) 9 fordeler i en sund kvindelig SKH1 nøgen mus efter 24-96 timer efter injektion. Det viser tydeligt, CMP ophobning i skelettet efter 24 HPI, på hvilket tidspunkt de fleste af ubundne peptider stort set er blevet ryddet. Fremgangsmåden ifølge CMP hybridisere med remodeling kollagen strenge forekommer relativt langsomt, specielt i kontrast til andre peptid billeddannelse sonder (f.eks RGD 16). Det mest sandsynlige er, på grund af den langsomme foldning på collagen triple helix 17,18. Men når hybridiseret CMP tråde er stærkt bundet til collagene væv, som kun lille reduktion signal ses efter 24 hpi (figur 1). På 96 HPI, NIR fluorescens billede af musen efter fjernelse hud viser klart skelet optagelse af IR680-Ahx-(GPO) 9 i rygsøjle og ribben, samt inden for knæ, ankler,håndled og lavere mandibles (figur 2A). I ex vivo vævsfarvning, foto-udløst fluorescens-mærkede bur kystforvaltningsplaner specifikt hybridisere til denatureret kollagen strenge i vævssnit. I figur 3 CMP farvning tydeligt afslører de fine parallelle collagenfibriller i hornhindestromaet, der viser dets anvendelse som en collagen specifik farvning agent. <img alt="Figur 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1.jpg" /> Figur 1.. Serial NIR fluorescens billeder af en nøgen mus intravenøst ​​med foto-decaged IR680-Ahx-(GPO) 9 viser optagelse i knogler i løbet af fire dage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width = &quot;4tommer&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2.jpg&quot; /&gt; Figur 2. NIR fluorescens billeder af mus administreret med foto-decaged IR680-Ahx-(GPO) 9 (A), bur IR680-Ahx-NB (GPO) 9 uden UV-eksponering (B), på forhånd, før triple-helix [IR680-Ahx-(GPO kan kun observeres) 9] 3 (C), eller varme-dissocierede single-streng IR680-Ahx-(GPO) 9 (D) ved 96 HPI efter fjernelse hud. Skeletal målretning af CMP i A og D. NIR fluorescenssignaler er vist i regnbue skala. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3.jpg" /> Figur 3. Fluorescens micrographs af en mus corneal vævssnit præfiks i paraformaldehyd og farvet med DAPI og foto-udløst CF (GPO) 9. anvendelse af protokol 2, viser tætte kollagent stroma (plettet af CMP, i grønt) samt cellulære epitel og endotel (farvet ved DAPI, i blå ) (skala bar: 100 mM).

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides at JoVE.com

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Denne procedure in vivo nær-IR fluorescensimagografi af kollagen remodeling aktiviteter i mus såvel som ex vivo-farvning af collagener i vævssnit ved hjælp af bur kollagen mimetiske peptider, der kan være tilgængeligt udløses til at hybridisere med denaturerede kollagen strenge viser.

Imaging Denatureret Kollagen Strands<em&gt; In vivo</em&gt; Og<em&gt; Ex vivo</em&gt; Via Photo-udløst Hybridisering af Caged Collagen mimetiske peptider

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Ex vivo Mimicry for normale og unormale menneskelige hematopoiese

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Virale Nanopartikler for<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Syntese af Native, Fibrøst Long Mellemrum og Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

En forbedret metode til forberedelse af type I kollagen fra hud

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse af Cell Migration inden for en tre-dimensionel kollagenmatrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Engineering 3D Cellularized kollagengeler for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Planar Gradient Diffusion System til Undersøg Chemotaxis i en 3D kollaqenmatrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Udviklet 3D Silke-collagen-baserede model for polariseret nervevæv

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Layer-by-lags kollagenaflejring i mikrofluidapparater for Microtissue Stabilisering

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...