Name: imaging denatured collagen strands in vivo and ex vivo via photo-triggered hybridization of caged collagen mimetic peptides
Uploaded: 2014-01-31T13:00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides at JoVE.com

Les auteurs remercient Gilbert vert pour l&#39;assistance technique. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIAMS / NIH (R01-AR060484) et le DOD (W81XWH-12-1-0555) décerné SMR, et des NIH (U24 CA92871 et CA151838 U54) attribués à MGP

Toutes les études sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les règlements du Comité de soin et l&#39;utilisation des animaux Johns Hopkins. Une. Proche infrarouge (NIR) de l&#39;imagerie de fluorescence squelettique remodelage du collagène in vivo <ol><li> Photo-activation de l&#39;injection dans la veine de la CMP et la queue en cage <ol><li> Préparer 110 ul d&#39;une solution de CMP à cage pour chaque souris (20-30 g de poids de souris): 100 ul d&#39;une solution pour le dosage, avec un coussin d&#39;appoint 10 ul de la perte possible pendant le transfert et l&#39;injection. Mélanger 11 pi de IR680-Ahx-NB (GPO) 9 solution stock (400 M) avec 11 ul de 100 uM cystéine dans une solution de PBS stérile, puis porter le volume total à 110 ul avec du tampon PBS 1x. La solution finale de peptides contient 4 nmol de IR680-Ahx-NB (GPO) 9 et 1 nmol de cystéine dans 100 ul de solution PBS 1x. </li><li> Lentement withdraw la solution de peptide dans une seringue de 0,5 ml d&#39;insuline avec un corps transparent et un petit écartement (28 à 30 G) aiguille, et soigneusement enlever les bulles d&#39;air. Allumez la lampe UV pour que la lampe se réchauffer pendant 2-5 min. </li><li> Placer la seringue contenant un peptide, directement sous la lampe UV (365 nm,&gt; 25 mW / cm 2) pendant 5 minutes pour permettre à la photo-activation. </li><li> Pendant ce temps, placer la souris dans un dispositif de retenue sous une lampe chauffée; étiqueter la souris avec un marqueur permanent sur la queue ou d&#39;autres méthodes d&#39;identification comme étiquette d&#39;oreille ou un orteil tatouage, et désinfecter la queue avec 70% d&#39;alcool. </li><li> Immédiatement après l&#39;activation UV, injecter 100 ml de activé UV IR680-Ahx-NB (GPO) 9 solution dans la veine de la queue, de préférence à la partie postérieure de la queue. Placez la souris vers la cage après l&#39;injection. </li></ol></li><li> NIR imagerie de fluorescence d&#39;activité de remodelage du collagène <ol><li> Setla plaque de chauffage du lit de formation d&#39;image de l&#39;imageur impulsion à 37 ° C en utilisant des perles Impulse logiciel 2.0. </li><li> Mettez la souris nude ou rasé dans la chambre d&#39;anesthésie d&#39;induction contenant 2% d&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène. Vérifiez la profondeur de l&#39;anesthésie plan par le manque de mouvement de la souris lors de la manipulation et de contrôle de la fréquence de respiration (~ 1/sec). </li><li> Après la souris est anesthésiée, ouvrir le tiroir perle de l&#39;imageur, et placer l&#39;animal sur le lit d&#39;imagerie. Enlever rapidement la fiche de cône de nez, et faites glisser le museau de la souris à l&#39;intérieur du cône de nez de garder la souris sous anesthésie (par 2% d&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène délivré à 2 L / min à travers le cône de nez) pendant le processus d&#39;imagerie. Une fois que la souris est en place, fermer le tiroir. </li><li> Lorsque l&#39;appareil indique «prêt» sur le panneau de logiciels de l&#39;image, cliquez sur le &quot;canal 700&quot;, &quot;lumière blanche&quot; et &quot;85 microns&quot; boîtes suivi par le bouton &quot;acquérir l&#39;image&quot;. NIR (excitation 685 nm, émission 720 nm) uned photographies lumineuses blanches seront ensuite prises avec mise au point automatique et l&#39;exposition. </li><li> Lorsque l&#39;enregistrement est terminé, ouvrez le tiroir, mettez la souris, et acquérir des images sous un autre angle. La souris peut être placé avec sa face avant (ventral), arrière (dorsale) ou sur les côtés face à la caméra. D&#39;étroites bandes de ruban peuvent être utilisés comme dispositifs de retenue pour étirer ses membres à obtenir la meilleure vue de la région d&#39;intérêt (par exemple, la cage thoracique, les chevilles, les poignets et). </li><li> Un bon moment pour observer la fixation osseuse du IR680-CMP est entre 24-96 h injection de poste (HPI), sur la base du dosage (~ 4 nmol / souris). Pour acquérir des images haute résolution, sacrifier la souris par dislocation cervicale sous anesthésie profonde après 72 hpi, enlever la peau (et les cheveux) à l&#39;aide de pinces et ciseaux chirurgicaux, et de l&#39;image par fluorescence NIR comme décrit ci-dessus. </li><li> Analyser les images de fluorescence NIR acquis. </li></ol></li></ol> 2. Visualisation des collagènes dans Ex vivoCoupes de tissus; 0 <ol><li> Préparation du matériel <ol><li> Préparer 1 ml de 10% (p / v) de solution de BSA dans de l&#39;eau désionisée. Décongeler 1 ml de sérum de chèvre dans un bain d&#39;eau à température ambiante. Couper quelques morceaux de Parafilm de la taille d&#39;environ 2 cm x 5 cm. </li><li> Préparer 10 ml de tampon de blocage en mélangeant 500 pl de sérum de chèvre, 1 ml de PBS et 10 x 8,5 ml d&#39;eau désionisée. Préparer 5 ml de tampon de dilution CMP en diluant 50 ul de 10% (p / v) de BSA avec 4,45 ml d&#39;eau désionisée et 500 ul de PBS 10x. </li><li> Diluer les solutions mères de carboxyfluorescéine marqué en cage CMP, CF NB (GPO) 9 (480 M), à 5 uM en utilisant le tampon de dilution CMP. Concentration optimale CMP varie de 2,5 à 30 uM, en fonction du type de tissus, et de la nature des échantillons de tissus. Un volume de 100 ul est recommandé pour une coloration tissulaire section diapositive. Rangez la solut CMP formuléions dans l&#39;obscurité. </li><li> Laissez lames de tissu de la cornée de la souris s&#39;équilibrer à la température ambiante. Incuber les lames dans du tampon PBS 1x pendant 5 min. Les tissus de la cornée de souris utilisées dans cette démonstration ont été précédé de paraformaldéhyde 4% dans une solution de PBS pendant 1 heure, cryoconservés dans Tissue-Tek octobre moyen, cryosectioned à 8 um d&#39;épaisseur, et montées sur des lames de verre chargées. </li></ol></li><li> Le marquage des tissus et de l&#39;imagerie <ol><li> Placer les lames dans une chambre humide. Pour chaque lame, appliquer 0,5 ml d&#39;une solution de blocage et incuber les lames pendant 30 min à température ambiante. Retirer la solution de blocage en tamponnant les lames sur une serviette en papier. </li><li> Appliquer environ 100 pi de CF NB (GPO) 9 solutions pour couvrir les sections de tissu de chaque diapositive. Incuber les lames pendant 2 min pour permettre à la solution de CMP à imprégner les tissus. </li><li> Allumer la lampe UV. Lorsque la lampe est réchauffé, exposer le tissu CMP-couverte soictions à la lumière UV pendant 6 min (365 nm, ~ 8 mW / cm 2) à déprotéger les CMP cage. Après l&#39;exposition aux UV, couvrir les sections de tissu de chaque lame avec un morceau de Parafilm pour éviter le dessèchement. Placer les lames dans la chambre humide et incuber à 4 ° C pendant 2 heures. </li><li> Préparer une dilution de 1:3,000 de solution DAPI en 1x PBS. Après CMP coloration, retirez délicatement le Parafilm avec une pince, et effacer les diapositives sur une serviette en papier pour enlever l&#39;excès de solution CMP. Appliquer environ 100 ul de solution de DAPI dilué à chaque diapositive de tissu et incuber pendant 1 minute à température ambiante. </li><li> Après coloration, plonger les lames dans un tampon PBS 1x dans un bocal de coloration pendant 5 min. Répétez cette 3x frais 1x PBS à laver agents de coloration non liés. </li><li> Ajouter une goutte de milieu de montage sur la section de tissu et le couvrir avec une lamelle de verre, tout en évitant la formation de bulles. Mettre les lames sur un plateau coulissant en carton pour les protéger de la lumière. </li><li>Image, les brins de collagène (canal FITC) et les noyaux cellulaires (canal DAPI) dans les lames de tissus à l&#39;aide d&#39;un microscope à fluorescence. </li></ol></li></ol>

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	<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+collagen+strands+by+photo-triggered+triple-helix+hybridization.">Targeting collagen strands by photo-triggered triple-helix hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14767-14772 (2012).</li><li>Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fibrosis:+therapeutic+translation+for+fibrotic+disease.">Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease.</a> Nat. Med. 18, 1028-1040 (2012).</li><li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases:+regulators+of+the+tumor+microenvironment.">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li><li>Costa, A. G., Cusano, N. E., Silva, B. C., Cremers, S., Bilezikian, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+K:+its+skeletal+actions+and+role+as+a+therapeutic+target+in+osteoporosis.">Cathepsin K: its skeletal actions and role as a therapeutic target in osteoporosis.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 7, 447-456 (2011).</li><li>Perentes, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+imaging+of+extracellular+matrix+remodeling+by+tumor-associated+fibroblasts.">et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts.</a> Nat. Methods. 6, 143-145 (2009).</li><li>Breurken, M., Lempens, E. H. M., Meijer, E. W., Merkx, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-synthesis+of+a+protease-activatable+collagen+targeting+probe.">Semi-synthesis of a protease-activatable collagen targeting probe.</a> Chem. Commun. 47, 7998-8000 (2011).</li><li>Wang, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+modification+of+collagen+scaffolds+mediated+by+triple+helical+propensity.">Spatio-temporal modification of collagen scaffolds mediated by triple helical propensity.</a> Biomacromolecules. 9, 1755-1763 (2008).</li><li>B&#228;chinger, H. P., Morris, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+thermal+stability+of+type+II+collagen+in+various+solvents+used+for+reversed-phase+high+performance+chromatography.">Analysis of the thermal stability of type II collagen in various solvents used for reversed-phase high performance chromatography.</a> Matrix. 10, 331-338 (1990).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+collagenous+proteins+by+fluorescently+labeled+collagen+mimetic+peptides.">Direct detection of collagenous proteins by fluorescently labeled collagen mimetic peptides.</a> Bioconjugate Chem. 24, 9-16 (2013).</li><li>Li, Y., Mo, X., Kim, D., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-tethered+collagen+mimetic+peptides+for+studying+heterotrimeric+triple-helical+interactions.">Template-tethered collagen mimetic peptides for studying heterotrimeric triple-helical interactions.</a> Biopolymers. 95, 94-104 (2011).</li><li>Stahl, P. J., Cruz, J. C., Li, Y., Yu, S. M., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-the-resin+N-terminal+modification+of+long+synthetic+peptides.">On-the-resin N-terminal modification of long synthetic peptides.</a> Anal. Biochem. 424, 137-139 (2012).</li><li>Wang, A. Y., Mo, X., Chen, C. S., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+modification+of+collagen+directed+by+collagen+mimetic+peptides.">Facile modification of collagen directed by collagen mimetic peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 4130-4131 (2005).</li><li>Wang, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+growth+factors+on+collagen+scaffolds+mediated+by+polyanionic+collagen+mimetic+peptides+and+its+effect+on+endothelial+cell+morphogenesis.">Immobilization of growth factors on collagen scaffolds mediated by polyanionic collagen mimetic peptides and its effect on endothelial cell morphogenesis.</a> Biomacromolecules. 9, 2929-2936 (2008).</li><li>Mo, X., An, Y. J., Yun, C. S., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-assisted+visualization+of+binding+interactions+between+collagen+mimetic+peptide+and+collagen+fibers.">Nanoparticle-assisted visualization of binding interactions between collagen mimetic peptide and collagen fibers.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2267-2270 (2006).</li><li>Chan, T. R., Stahl, P. J., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-bound+VEGF+mimetic+peptides:+design+and+endothelial+cell+activation+in+collagen+scaffolds.">Matrix-bound VEGF mimetic peptides: design and endothelial cell activation in collagen scaffolds.</a> Adv. Funct. Mater. 21, 4252-4262 (2011).</li><li>van Hagen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+radiolabelled+cyclic+DTPA-RGD+analogue+for+tumour+imaging+and+radionuclide+therapy.">Evaluation of a radiolabelled cyclic DTPA-RGD analogue for tumour imaging and radionuclide therapy.</a> Int. J. Cancer. 90, 186-198 (2000).</li><li>Boudko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleation+and+propagation+of+the+collagen+triple+helix+in+single-chain+and+trimerized+peptides:+transition+from+third+to+first+order+kinetics.">Nucleation and propagation of the collagen triple helix in single-chain and trimerized peptides: transition from third to first order kinetics.</a> J. Mol. Biol. 317, 459-470 (2002).</li><li>Ackerman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+dependence+of+the+folding+of+collagen-like+peptides.">Sequence dependence of the folding of collagen-like peptides.</a> J. Biol. Chem. 274, 7668-7673 (1999).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li><li>Brodsky, B., Persikov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+the+collagen+triple+helix.">Molecular structure of the collagen triple helix.</a> Adv. Prot. Chem. 70, 301-339 (2005).</li></ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Comme on peut le voir dans ce protocole, la livraison de CMP est simple puisque l&#39;UV-activation des CMP en cage est la seule étape supplémentaire à la queue commune protocoles d&#39;injection de la veine 19. La clé est d&#39;injecter les sondes peptidiques dans un état simple brin Uncaged et métastable. Le groupe de cage empêche CMP de l&#39;auto-assemblage et de liaison pour les collagènes (figure 2B) jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit retiré par la lumière UV à quel point la CMP commence à se replier en triple hélice. La formulation injectable contient de la cystéine, ce qui peut rapidement réagir avec le groupe de cage clivé au cours de l&#39;irradiation UV afin de minimiser la toxicité. De nombreuses souris avec différentes souches (par exemple SKH-1 et DR-1) ont été testés en utilisant cette formulation, et nous n&#39;avons pas de détecter les défauts de comportement ou d&#39;autres la santé chez ces souris jusqu&#39;à six mois. Si l&#39;injection ne suit pas immédiatement après l&#39;exposition aux UV, les CMP se replient dans des triples hélices homotrimérique, qui n&#39;ont pas la capacité d&#39;hybridation. Figure 2C montre un cas extrême où avant l&#39;injection des CMP ont été entièrement remontés en triples hélices par un long temps de retard (&gt; 2 jours). Pour contourner ce problème, une solution de CMP doit être préparé dans une concentration relativement faible (par exemple, ~ 40 uM), et injecté dans des souris immédiatement après UV-decaging. En raison de la lenteur triple hélice de pliage des CMP dans des conditions diluées (à mi-temps de repliement:&gt; 50 min) et l&#39;exposition aux UV à court et temps d&#39;injection (5 ~ 7 minutes au total), la plupart des CMP dans la circulation sanguine dans une seule brin forme lorsque ce protocole est suivi. Une fois injectées, CMP devraient rester aussi simples brins, comme la concentration est réduite par un facteur de 20 dans le pool sanguin, ce qui conduit à une réduction spectaculaire du taux remontage 18. Si l&#39;injection est retardé (par exemple en raison de la manipulation des animaux) et le repliement homotrimérique est suspectée, les peptides partiellement assemblés peuvent être réactivés par chauffage à plus de 7076; C à dissocier les CMP de simples brins, suivi d&#39;un refroidissement rapide et injection. Bien que moins pratique, ces CMP de chaleur dissocié également afficher les résultats de ciblage in vivo (figure 2D) attendus. Dans cette démonstration, les souris nudes ont été utilisés pour l&#39;imagerie de fluorescence NIR parce que jusqu&#39;à 50% du signal de NIR peut être bloqué par les cheveux. Lorsque vous travaillez avec des modèles de souris à poils (en particulier les ceux avec des poils noirs), nous vous recommandons le rasage de la souris dans la zone d&#39;intérêt avant imagerie utilisant un rasoir électrique ou épilateur. Sur la figure 1, il existe des signaux faux positifs provenant de la région abdominale de l&#39;animal, qui est provoquée par l&#39;auto-fluorescence de la chlorophylle dans l&#39;alimentation animale. Ces signaux de fond peuvent être considérablement réduits en passant la souris pour les régimes purifiés environ 4 jours avant l&#39;imagerie. Comme on le voit sur ​​les figures 1 et 2A, il existe de fortes absorptions de CMP dans la vrillee. Par conséquent, pour éviter les artefacts résultant de imparfaits intraveineuse dans la queue, nous recommandons l&#39;injection à la partie postérieure de la queue ainsi que le site d&#39;injection n&#39;est pas capturé dans l&#39;image de fluorescence. La CMP marqué permet un ciblage et l&#39;imagerie des endroits spécifiques de remodelage du collagène in vivo qui sont difficiles à détecter à l&#39;aide d&#39;autres méthodes. Par exemple, le sang et l&#39;urine des dosages basés sur ELISA sont sensibles à des fragments de collagène télopeptidiques clivées, mais le procédé ne peut pas localiser la source de la rotation du collagène, car elle cible les antigènes solubles. Les principales limites de la technique d&#39;imagerie in vivo en utilisant NIR sont étiquetés CMP atténuation de la profondeur de pénétration et la trempe par les globules rouges proximale mis en commun comme l&#39;hémoglobine est un quencher endogène de 680/710 nm colorants NIR. Les applications futures de CMP en imagerie in vivo comprennent SPECT ou TEP utilisant CMP marqués avec des radionucléides émetteurs gamma directs ou positron emitters, pour le diagnostic d&#39;états pathologiques impliquant le remodelage du collagène (par exemple, l&#39;ostéoporose, l&#39;arthrite, l&#39;athérosclérose, et la fibrose). Ces analogues CMP radio-marqués permettront d&#39;éliminer les limites de perte de signal due à la profondeur des tissus et de la présence de globules rouges communs, et permettront des mesures quantitatives de tissus malades. En outre, le temps d&#39;imagerie relativement tard (par exemple 48-96 HPI) résultant de l&#39;apurement de liaison et lente de CMP pourrait faire du mal à suivre les changements rapides dans le remodelage du collagène. Une telle limitation peut être surmontée en outre l&#39;ingénierie de la cinétique de liaison et l&#39;affinité de CMP agents d&#39;imagerie. Depuis CMP se lie à collagènes dénaturés qui ont peu de structure, l&#39;imagerie à base de collagène-CMP est complémentaire à la seconde microscopie génération d&#39;harmoniques qui ne peut images collagène des fibres 5. Lors de la coloration des coupes de tissus avec marquage fluorescent CMP, nous avons trouvé qu&#39;il est avantageux pour incuber l&#39;échantillons dans les solutions de peptides activés par les UV à 4 ° C, en raison de l&#39;hybridation en triple hélice est facilitée à une température inférieure à 1,20. Il a également été constaté que de plonger les lames dans un tampon PBS frais dans un bocal de coloration est le moyen le plus efficace pour laver CMP non liés, qui fonctionne beaucoup mieux que simplement pipetage tampons de lavage sur les échantillons. L&#39;hybridation CMP-collagène brin est très spécifique et robuste, donc le protocole simple de coloration présenté dans cette vidéo peut être facilement modifié pour costaining biomarqueurs supplémentaires, et pour identifier les collagènes dégradées dans des coupes de tissus non fixées. Ceci est une alternative efficace et pratique à l&#39;aide d&#39;anticorps anti-collagène pour détecter les collagènes fibreux dans différents échantillons histologiques.

Le collagène, la protéine la plus abondante chez les mammifères, joue un rôle critique dans le développement et la régénération des tissus en soutenant la prolifération et la différenciation des cellules. Alors que les collagènes fibreux (par exemple de type I, II), dans les tissus conjonctifs donner une résistance mécanique aux tissus, le collagène de type réseau (type IV) forment échafaudage de base de la membrane de sous-sol où les cellules se fixent et forment tissus organisés. Remodelage du collagène implique à la fois la dégradation du collagène (par des proteases) et la synthèse (favorisé par des facteurs de croissance). Bien que le remodelage du collagène, par exemple dans l&#39;os, fait partie du processus normal de renouvellement du tissu, de l&#39;activité de remodelage en excès, ou sa présence dans des endroits anormaux, indique typiquement réponse de cicatrisation d&#39;une blessure ou d&#39;états pathologiques chroniques telles que le cancer, l&#39;ostéoporose, l&#39;arthrite, et fibrose 1-4. La capacité de directement collagènes d&#39;image en cours de remodelage in vivo pourrait conduire à la compréhension de l&#39;évolutionion de ces maladies, ainsi que de nouveaux outils diagnostiques et thérapeutiques. Par exemple, l&#39;imagerie en temps réel peut fournir des informations au sujet de la gravité et de l&#39;emplacement des maladies, et peut également être utilisé pour évaluer l&#39;efficacité de nouveaux agents thérapeutiques. La microscopie multiphotonique à balayage laser et génération de second harmonique ont été appliquées à l&#39;image des collagènes fibrillaires de suivi de remodelage de la matrice extracellulaire dans une tumeur chez des souris 5 direct. Cependant, cette technique exige que les animaux pour être monté avec transparents chambres dorsale du pli cutané, qui est une procédure invasive. Imagerie directe et non invasive de remodelage du collagène bénéficiera d&#39;une sonde qui cible spécifiquement le collagène subit une réorganisation. Une telle sonde est difficile à préparer, car il faut distinguer les collagènes de remodelage des collagènes intactes et matures, qui sont abondants dans les tissus normaux 6. Le collagène est composé de la structure des protéines extrêmement rare appelée triple hélice, qui estclivée par des protéases telles que les métalloprotéinases matricielles (MMP) pendant le remodelage du collagène. Les fragments de collagène clivés perdent leur structure hélicoïdale triple et deviennent des brins (dépliées de gélatine), qui sont en outre digérés par des protéases non spécifiques 1. Il a été récemment découvert que le peptide mimétique de collagène (CMP) qui a la propension à se replier dans une structure triple hélice peut cibler spécifiquement les brins de collagène qui sont dissociées à partir de son état ​​en triple hélice par l&#39;une dénaturation par la chaleur ou par dégradation enzymatique 1,7. La liaison est principalement entraînée par une triple hélice hybridation entre CMP monomères et les brins de collagène dénaturé. Parce CMP s&#39;auto-assembler en triples hélices homotrimérique à température ambiante avec une force d&#39;entraînement peu pour le collagène hybridation, un CMP en cage [(GPO) 4 NB GPO (GPO) 4, désigné comme NB (GPO) 9, O: hydroxyproline], a été développé , qui contient un photo-nitrobenzyle clivablegroupe (NB) fixée à la glycine centrale du peptide. Le groupe de cage NB empêche stériquement la CMP de repliement en triple hélice, et pourtant, l&#39;élimination du groupe de la cage par irradiation UV déclenche immédiatement le repliement en triple hélice du collagène et une hybridation. Lorsque CMP monomères marqués au proche infrarouge (NIR) fluorophores sont systématiquement livrés à modéliser des souris, ils peuvent cibler spécifiquement et permettre l&#39;imagerie in vivo des collagènes dénaturés dans des tissus subissant une normale (par exemple, dans les os et le cartilage) et pathologiques (par exemple, dans les tumeurs) remodelage 1 . CMP marquées par fluorescence peuvent également être utilisés pour l&#39;imagerie de collagènes dans des coupes de tissus histologiques. Dans l&#39;étude histologique, les tissus récoltés sont souvent préservés par la fixation afin de maintenir les composants cellulaires et la morphologie générale du tissu de la détérioration. Les procédures de fixation, qui comprennent la chaleur, et le traitement avec des solvants organiques, et le contre-linkin chimiqueg réactifs (par exemple paraformaldéhyde), dénaturer la structure en triple hélice de collagène 8. Cette dénaturation génère des sites pour la CMP hybridation. Il a été démontré que les CMP marquées par fluorescence peuvent se lier spécifiquement à des collagènes dans des coupes de tissus fixes (par exemple la peau, la cornée et l&#39;os) d&#39;autant plus efficacement que l&#39;anticorps anti-collagène, ce qui a permis l&#39;identification facile des conditions pathologiques dans les tissus hépatiques fibrotiques 9. Le CMP cible brins de collagène dénaturé contenant la séquence d&#39;acides aminés de motifs triple hélice, qui est commune à tous les types de collagènes. Par conséquent CMP peut être considéré comme un agent de collagène coloration à large spectre. Ici, nous présentons des procédures expérimentales détaillées pour i) l&#39;imagerie brins de collagène dénaturé in vivo et les collagènes ii) de visualisation en ex vivo sections de tissus à l&#39;aide de CMP en cage marquées par fluorescence. Une étiquette de NIR, IR680, a été conjugué à la CMP en cage pour l&#39;imagerie en direct, while carboxyfluorescéine (CF) a été utilisé dans les tissus travail de coloration pour sa compatibilité avec les microscopes à fluorescence standard. Ce protocole porte sur l&#39;application de l&#39;imagerie de CMP par rapport aux remodelage du collagène. Des procédés pour la synthèse de CMP peuvent être trouvés dans les rapports précédents 1,7,9-15. Dans ce reportage vidéo, l&#39;imagerie des tissus squelettiques chez les souris normales et des coupes de tissus de la cornée de souris ont été choisis à des fins de démonstration, mais les méthodes présentées ici peuvent être facilement appliquées à de nombreuses pathologies et des modèles biologiques impliquant le remodelage du collagène (par exemple, les tumeurs, la cicatrisation des plaies), comme ainsi que de presque n&#39;importe quel échantillon de tissu préfixé qui contient les collagènes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IRdye 680RD Maleimide (IR680)</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">929-71050</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5(6)-Carboxyfluorescein</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">21877-5G-F</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:123px;">Advanced Chemtech</td>
			<td style="width:137px;">YC2200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:123px;">Butler Veterinary Supply</td>
			<td style="width:137px;">4/4/5260</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat Serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">G9023-10ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A9647</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:123px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:137px;">10236276001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluoroshield mounting medium</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">F6182-20ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:643px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringes</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:137px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV lamp</td>
			<td style="width:123px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:137px;">1447T17</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Pearl impulse imager</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">9400</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Surgical forceps and scissors</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EasyDip slide staining system</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;">M900-12B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">20-place cardboard microscope slide tray</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:123px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">12-545-c</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;">Eclipse TE2000-E</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging denatured collagen strands in vivo and ex vivo via photo-triggered hybridization of caged collagen mimetic peptides

Le collagène est un composant structurel majeur de la matrice extracellulaire qui prend en charge la formation de tissu et de maintenance. Bien que le remodelage du collagène est une partie intégrante du renouvellement des tissus normaux, la quantité excessive de l&#39;activité de rénovation est impliqué dans les tumeurs, l&#39;arthrite, et de nombreuses autres pathologies. Pendant le remodelage du collagène, la structure en hélice triple des molécules de collagène est perturbée par des protéases dans le milieu extracellulaire. De plus, les collagènes présents dans de nombreux échantillons de tissus histologiques sont partiellement dénaturés par les procédés de fixation et de conservation. Par conséquent, ces brins de collagène dénaturé peuvent servir de cibles efficaces pour l&#39;imagerie biologique. Nous avons déjà mis au point un peptide mimétique du collagène de cage (CMP) pouvant être photo-déclenchée pour s&#39;hybrider avec des brins de collagène dénaturé par la formation d&#39;une structure en triple hélice, qui est unique pour les collagènes. Les objectifs généraux de cette procédure sont: i) à l&#39;image de brins de collagène dénaturé resulting des activités normales de remodelage in vivo, et ii) pour visualiser les collagènes dans les anciens articles in vivo de tissus en utilisant les CMP en cage photo-déclenchée. Pour réaliser une hybridation réussie et efficace in vivo et l&#39;imagerie ex vivo, CMP en cage marqués par fluorescence sont soit photo-activé immédiatement avant l&#39;injection intraveineuse, ou sont directement actionnés sur des coupes de tissus. Normale remodelage du collagène osseux chez des souris nues et les collagènes dans des coupes de tissu de la cornée de souris préfixés sont imagés dans cette procédure. La méthode d&#39;imagerie basée sur la technologie d&#39;hybridation CMP-collagène présenté ici pourrait conduire à une meilleure compréhension du processus de remodelage tissulaire, ainsi que de permettre le développement de nouveaux outils de diagnostic pour les maladies associées à l&#39;activité de rénovation haute de collagène.

La figure 1 montre un résultat typique de la façon dont la photo-déclenchée IR680-Ahx (GPO) 9 distribue dans une SKH1 femelle souris nude en bonne santé après injection 24-96 h de poste. Il montre accumulation apparente CMP dans le squelette après 24 hpi, à quel point la plupart des peptides non liés ont été largement vidé. Le procédé de la CMP s&#39;hybrider avec les brins remodelage du collagène semble relativement lente, en particulier par opposition à d&#39;autres sondes d&#39;imagerie (par exemple des peptides RGD 16). C&#39;est probablement à cause de la vitesse de pliage lente de la triple hélice de collagène 17,18. Cependant, une fois hybride, les brins CMP sont fortement liés aux tissus de collagène, comme seulement une légère diminution du signal est observée après 24 hpi (Figure 1). À 96 hpi, l&#39;image de fluorescence NIR de la souris après l&#39;enlèvement de la peau démontre clairement la fixation osseuse du IR680-Ahx (GPO) 9 dans la colonne vertébrale et des côtes, ainsi que dans les genoux, les chevilles,les poignets et les mandibules inférieures (Figure 2A). En ex vivo coloration des tissus, CMP en cage marqués par fluorescence photo-déclenchée s&#39;hybrident spécifiquement à des brins de collagène dénaturé dans des coupes de tissus. Sur la figure 3, CMP coloration révèle clairement les fines fibrilles de collagène parallèles dans le stroma de la cornée, ce qui démontre son utilisation comme agent de coloration spécifique du collagène. <img alt="Figure 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1.jpg" /> Figure 1. Série NIR images de fluorescence d&#39;une souris nude administrés par voie intraveineuse avec une photo-decaged IR680-Ahx (GPO) 9 montrant la fixation osseuse sur quatre jours. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width = &quot;4 po&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2.jpg&quot; /&gt; Figure 2. NIR images de fluorescence des souris ayant reçu de photo-decaged IR680-Ahx (GPO) 9 (A), mis en cage IR680-Ahx-NB (GPO) 9 sans exposition aux UV (B), prépliées triple hélice [IR680-Ahx (GPO ) 9] 3 (C), ou de la chaleur dissocié simple brin IR680-Ahx (GPO) 9 (D) à 96 hpi après l&#39;enlèvement de la peau. ciblage squelettique par la CMP ne peut être observée dans A et D. Signaux de fluorescence NIR sont présentés à l&#39;échelle d&#39;arc en ciel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3.jpg" /> Figure 3. micrographies de fluorescence d&#39;une coopération de la souriscoupe de tissu rneal précédé dans paraformaldéhyde, et coloré avec du DAPI et CF photo-déclenchée (GPO) 9 en utilisant le protocole 2, l&#39;affichage stroma collagène dense (souillé par CMP, en vert) ainsi que l&#39;épithélium cellulaire et de l&#39;endothélium (souillé par DAPI, en bleu ) (barre d&#39;échelle: 100 um).

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Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Cette procédure démontre in vivo proche IR imagerie de fluorescence des activités de remodelage du collagène chez la souris ainsi que ex vivo coloration des collagènes dans des coupes de tissus à l&#39;aide de cages collagène peptides mimétiques qui peuvent être photo-déclenchées à s&#39;hybrider avec des brins de collagène dénaturé.

Imagerie collagène dénaturé Strands<em&gt; In vivo</em&gt; Et<em&gt; Ex vivo</em&gt; Par photo-déclenchée hybridation de Caged collagène Mimetic peptides

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

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JoVE Journal

Bioengineering

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

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