Name: imaging denatured collagen strands in vivo and ex vivo via photo-triggered hybridization of caged collagen mimetic peptides
Uploaded: 2014-01-31T13:00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides at JoVE.com

Forfatterne takker Gilbert Grønn for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra NIAMS / NIH (R01-AR060484) og DOD (W81XWH-12-1-0555) tildelt SMY, og fra NIH (U24 CA92871 og U54 CA151838) tildelt til MGP

Alle dyrestudier ble foretatt i samsvar med bestemmelsene i Johns Hopkins Animal Care og bruk komité. En. Nær infrarød (NIR) Fluorescens Imaging av Skeletal Kollagen Remo In vivo <ol><li> Bilde-aktivering av bur CMP og hale vene injeksjon <ol><li> Forbered 110 mL av bur CMP løsning for hver mus (20-30 g mus vekt): 100 mL av løsning for dosering, med en ekstra 10 mL pute for mulig tap under overføring og injeksjon. Bland 11 ul av IR680-Ahx-NB (GPO) 9 stamløsning (400 mM) med 11 ul av 100 mM cystein i steril PBS-løsning, og deretter bringe det totale volumet til 110 pl med 1 x PBS-buffer. Den endelige peptid løsningen inneholder 4 nmol av IR680-Ahx-NB (GPO) 9 og 1 nmol av cystein i 100 mL 1x PBS løsning. </li><li> Sakte withdraw peptid-løsning i en 0,5 ml insulinsprøyte med en gjennomsiktig sylinder og en liten måler (28-30 G) p, og forsiktig fjerne luftbobler. Slå på UV-lampen, slik at pæren til å varme opp for 2-5 min. </li><li> Plasser peptid-inneholdende sprøyten direkte under UV-lampe (365 nm,&gt; 25 mW / cm 2) i 5 min for å la foto-aktivering. </li><li> I mellomtiden, plasserer du musen i en rainer under en oppvarmet lampe; merke musen med en permanent markør på halen eller andre identifikasjonsmetoder som øremerke eller tå tatovering, og desinfisere halen med 70% alkohol. </li><li> Umiddelbart etter UV-aktivering, injisere 100 ul av UV-aktivert IR680-Ahx-NB (GPO) 9-løsning inn i halevenen, fortrinnsvis ved den bakre del av halen. Plasser mus tilbake til buret etter injeksjon. </li></ol></li><li> NIR fluorescens avbildning av kollagen ombygging aktivitet <ol><li> Setvarmeplaten på bilde seng av impulsen imager til 37 ° C ved hjelp av Pearl Impulse 2.0 programvare. </li><li> Sett naken eller barbert mus inn i anestesi induksjonskammeret inneholdende 2% isofluran i oksygen. Verifiseringsanestesidybden planet ved manglende mus bevegelse under håndtering og ved å overvåke frekvensen av respirations (~ 1/sek). </li><li> Etter at musen er bedøvet, åpner Pearl imager skuffen, og legg hunden på bilde seng. Raskt fjerne nesen membran pluggen, og skyv musa snute inne i nesen kjegle å holde musen under narkose (med 2% isofluran i oksygen levert på 2 L / min gjennom nesen membran) under bildeprosessen. Når musen er på plass, lukk skuffen. </li><li> Når instrumentet indikerer &quot;klar&quot; på bildeprogramvare panelet, klikker du på &quot;700-kanal,&quot; &quot;hvitt lys&quot; og &quot;85 mikron&quot; bokser etterfulgt av &quot;erverve image&quot;-knappen. NIR (eksitasjon 685 nm, emisjon 720 nm) end hvitt lys fotografier vil da bli tatt med automatisk fokus og eksponering. </li><li> Når opptaket er ferdig, åpne skuffen, slår musa, og hente bilder fra en annen vinkel. Musen kan plasseres med fronten (ventral), bak (rygg) eller sider som vender mot kameraet. Smale strimler av tape kan brukes som begrensninger for å strekke sine lemmer for å få den beste utsikten over regionen av interesse (f.eks brystkassen, ankler og håndledd). </li><li> En skikkelig tid til å observere skjelett opptak av IR680-CMP er mellom 24-96 hr etter injeksjonen (HPI), basert på dosering (~ 4 nmol / mus). Å tilegne seg høyoppløselige bilder, ofre musen ved halshugging mens under dyp narkose etter 72 HPI, fjerne hud (og hår) med kirurgisk pinsett og saks, og bildet det av NIR fluorescens som beskrevet ovenfor. </li><li> Analysere de innsamlede NIR fluorescens bilder. </li></ol></li></ol> 2. Visualisering av kollagen i Ex vivo0; vevsdelene <ol><li> Materiale forberedelse <ol><li> Forbered 1 ml av 10% (w / v) BSA-løsning i avionisert vann. Tin 1 ml geiteserum i et vannbad ved romtemperatur. Skjær et par stykker av Parafilm i størrelsen på omtrent 2 cm x 5 cm. </li><li> Forbered 10 ml blokkeringsbuffer ved å blande 500 ul av geit serum, 1 ml av 10x PBS og 8,5 ml av deionisert vann. Forbered 5 ml CMP fortynningsbuffer ved å fortynne 50 pl 10% (vekt / volum) BSA med 4,45 ml avionisert vann og 500 mL 10 x PBS. </li><li> Fortynne lager løsninger av karboksyfluorescens-merket bur CMP, CF NB (GPO) 9 (480 mm), til 5 mikrometer ved hjelp av CMP fortynningsbuffer. Optimal CMP-konsentrasjon varierer 2,5 til 30 mikrometer, avhengig av typen av vev og arten av vevsprøver. Et volum på 100 ul er anbefalt for farging av en vev-delen lysbilde. Oppbevar formulert CMP solutioner i mørket. </li><li> La musehornhinnen vev lysbilder romtemperatur. Inkuber lysbilder i 1x PBS buffer for 5 min. Muse hornhinne vev som brukes i denne demonstrasjonen er prefiks med 4% paraformaldehyd i PBS-løsning i 1 time, cryopreserved i Tissue-Tek oktober medium, cryosectioned til 8 mikrometer tykkelse, og som er montert på ladede glassplater. </li></ol></li><li> Tissue farging og bildebehandling <ol><li> Plasser lysbildene i en fuktet kammer. For hvert bilde påføres 0,5 ml blokkeringsløsning og inkuber lysbildene i 30 min ved romtemperatur. Fjern blokkering løsningen av blotting lysbildene på et papirhåndkle. </li><li> Påfør ca 100 mL av CF NB (GPO) 9 løsninger for å dekke vevsdelene av hvert lysbilde. Inkuber objektglassene i 2 min for å tillate at CMP løsningen å trenge gjennom vevet. </li><li> Slå på UV-lampen. Når lampen er varmet opp, utsett CMP-dekket vev sections til UV-lys for 6 min (365 nm, ~ 8 mW / cm 2) å avbeskytte bur CMPS. Etter UV-eksponeringen, dekke vevet seksjoner av hvert lysbilde med et stykke av Parafilm for å hindre tørking. Legg objektglassene i fuktet kammer og inkuber dem ved 4 ° C i 2 timer. </li><li> Forbered en 1:3,000 fortynning av DAPI løsning i 1x PBS. Etter CMP farging, fjern forsiktig Parafilm med pinsett, og blot lysbildene på et tørkepapir for å fjerne overflødig CMP løsning. Påfør omtrent 100 pl av fortynnet DAPI løsninger på hvert vev lysbilde og inkuberes i 1 min ved romtemperatur. </li><li> Etter farging, fordype lysbildene i 1x PBS buffer i en flekker krukke for 5 min. Gjenta dette 3x i frisk 1x PBS å vaske av ubundne fargemidler. </li><li> Legg en dråpe montering medium på vev delen og dekke den med et glass dekkglass og samtidig unngå fangst luftbobler. Sett lysbildene i en papp lysbilde skuffen for å beskytte dem mot lys. </li><li>Bilde kollagen tråder (FITC kanal), og cellekjerner (DAPI-kanal) i vevet lysbilder ved hjelp av et fluorescens mikroskop. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+collagen+strands+by+photo-triggered+triple-helix+hybridization.">Targeting collagen strands by photo-triggered triple-helix hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14767-14772 (2012).</li><li>Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fibrosis:+therapeutic+translation+for+fibrotic+disease.">Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease.</a> Nat. Med. 18, 1028-1040 (2012).</li><li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases:+regulators+of+the+tumor+microenvironment.">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li><li>Costa, A. G., Cusano, N. E., Silva, B. C., Cremers, S., Bilezikian, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+K:+its+skeletal+actions+and+role+as+a+therapeutic+target+in+osteoporosis.">Cathepsin K: its skeletal actions and role as a therapeutic target in osteoporosis.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 7, 447-456 (2011).</li><li>Perentes, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+imaging+of+extracellular+matrix+remodeling+by+tumor-associated+fibroblasts.">et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts.</a> Nat. Methods. 6, 143-145 (2009).</li><li>Breurken, M., Lempens, E. H. M., Meijer, E. W., Merkx, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-synthesis+of+a+protease-activatable+collagen+targeting+probe.">Semi-synthesis of a protease-activatable collagen targeting probe.</a> Chem. Commun. 47, 7998-8000 (2011).</li><li>Wang, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+modification+of+collagen+scaffolds+mediated+by+triple+helical+propensity.">Spatio-temporal modification of collagen scaffolds mediated by triple helical propensity.</a> Biomacromolecules. 9, 1755-1763 (2008).</li><li>B&#228;chinger, H. P., Morris, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+thermal+stability+of+type+II+collagen+in+various+solvents+used+for+reversed-phase+high+performance+chromatography.">Analysis of the thermal stability of type II collagen in various solvents used for reversed-phase high performance chromatography.</a> Matrix. 10, 331-338 (1990).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+collagenous+proteins+by+fluorescently+labeled+collagen+mimetic+peptides.">Direct detection of collagenous proteins by fluorescently labeled collagen mimetic peptides.</a> Bioconjugate Chem. 24, 9-16 (2013).</li><li>Li, Y., Mo, X., Kim, D., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-tethered+collagen+mimetic+peptides+for+studying+heterotrimeric+triple-helical+interactions.">Template-tethered collagen mimetic peptides for studying heterotrimeric triple-helical interactions.</a> Biopolymers. 95, 94-104 (2011).</li><li>Stahl, P. J., Cruz, J. C., Li, Y., Yu, S. M., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-the-resin+N-terminal+modification+of+long+synthetic+peptides.">On-the-resin N-terminal modification of long synthetic peptides.</a> Anal. Biochem. 424, 137-139 (2012).</li><li>Wang, A. Y., Mo, X., Chen, C. S., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+modification+of+collagen+directed+by+collagen+mimetic+peptides.">Facile modification of collagen directed by collagen mimetic peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 4130-4131 (2005).</li><li>Wang, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+growth+factors+on+collagen+scaffolds+mediated+by+polyanionic+collagen+mimetic+peptides+and+its+effect+on+endothelial+cell+morphogenesis.">Immobilization of growth factors on collagen scaffolds mediated by polyanionic collagen mimetic peptides and its effect on endothelial cell morphogenesis.</a> Biomacromolecules. 9, 2929-2936 (2008).</li><li>Mo, X., An, Y. J., Yun, C. S., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-assisted+visualization+of+binding+interactions+between+collagen+mimetic+peptide+and+collagen+fibers.">Nanoparticle-assisted visualization of binding interactions between collagen mimetic peptide and collagen fibers.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2267-2270 (2006).</li><li>Chan, T. R., Stahl, P. J., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-bound+VEGF+mimetic+peptides:+design+and+endothelial+cell+activation+in+collagen+scaffolds.">Matrix-bound VEGF mimetic peptides: design and endothelial cell activation in collagen scaffolds.</a> Adv. Funct. Mater. 21, 4252-4262 (2011).</li><li>van Hagen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+radiolabelled+cyclic+DTPA-RGD+analogue+for+tumour+imaging+and+radionuclide+therapy.">Evaluation of a radiolabelled cyclic DTPA-RGD analogue for tumour imaging and radionuclide therapy.</a> Int. J. Cancer. 90, 186-198 (2000).</li><li>Boudko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleation+and+propagation+of+the+collagen+triple+helix+in+single-chain+and+trimerized+peptides:+transition+from+third+to+first+order+kinetics.">Nucleation and propagation of the collagen triple helix in single-chain and trimerized peptides: transition from third to first order kinetics.</a> J. Mol. Biol. 317, 459-470 (2002).</li><li>Ackerman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+dependence+of+the+folding+of+collagen-like+peptides.">Sequence dependence of the folding of collagen-like peptides.</a> J. Biol. Chem. 274, 7668-7673 (1999).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li><li>Brodsky, B., Persikov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+the+collagen+triple+helix.">Molecular structure of the collagen triple helix.</a> Adv. Prot. Chem. 70, 301-339 (2005).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Som det kan sees i denne protokollen, er levering av CMP enkel ettersom UV-aktivering av bur CMPS er det eneste ytterligere trinn til de vanlige halevene-injeksjon protokoller 19. Nøkkelen er å injisere peptid sonder i en Uncaged og metastabil single-strand tilstand. Buret gruppe hindrer CMP fra selvbygging og binding til bindevevet (figur 2B) til den er fjernet av UV-lys på hvilket tidspunkt den CMP begynner å kaste seg inn i triple helix. Injeksjonen formuleringen inneholder cystein, noe som raskt kan reagere med den avspaltede gruppen bur under UV-bestråling for å redusere toksisitet. Mange mus med ulike stammer (f.eks SKH-1 og DR-1) har blitt testet med denne formuleringen, og vi gjorde ikke oppdage eventuelle atferdsmessige eller andre helsemessige defekter i disse musene opp til seks måneder. Hvis injeksjonen ikke følger umiddelbart etter UV-eksponering, vil CMPS folde inn homotrimeric trippel helikser, noe som ikke har noen hybridisering kapasitet. Figur 2C viser et ekstremt tilfelle der før injeksjon de CMPS var fullt sammen igjen i trippel helikser etter lang forsinkelse (&gt; 2 dager). For å omgå dette problemet, bør CMP-løsning fremstilles i relativt lav konsentrasjon (f.eks ~ 40 pM), og injisert i mus umiddelbart etter UV-decaging. På grunn av den langsomme triple helix folding rate av CMPS i fortynnede forhold (halve tiden av refolding:&gt; 50 min) og den korte UV eksponering og injeksjon tid (5 ~ 7 min totalt), de fleste av CMPS inn i blodbanen i single- STRAND skjema når denne protokollen er fulgt. Når injisert, CMPS ventes å holde seg som enkelt-tråder, som konsentrasjonen er redusert med en faktor på 20 i blodblandingen, som fører til vesentlig reduksjon i remontere sats 18.. Hvis injeksjon er forsinket (f.eks på grunn av dyrehåndtering) og homotrimeric refolding er mistenkt, kan de delvis montert peptider reaktiveres ved oppvarming til over 7076, C for å distansere de CMPS til single-tråder, etterfulgt av rask avkjøling og injeksjon. Selv om mindre praktisk, slike varme dissociated CMPS også viser forventet resultat av in vivo målretting (figur 2D). I denne demonstrasjon ble det nakne mus brukt for NIR fluorescens avbildning fordi opp til 50% av NIR-signalet kan blokkeres av hår. Når du arbeider med haired musemodeller (spesielt de med svart hår), anbefaler vi å barbere musa i regionen av interesse før bildebehandling ved hjelp av en elektrisk barbermaskin eller hår remover. På figur 1, er det falske positive signaler fra dyrets buk-regionen, som er forårsaket av auto-fluorescens av klorofyll i dyrets diett. Slike bakgrunnssignaler kan reduseres betraktelig ved å bytte musen til rensede dietter ca 4 dager før bildebehandling. Som vist i figurene 1 og 2A, er det sterke CMP uptakes i hale spine. Derfor, for å unngå artifakter som skyldes ufullkommen halevenen injeksjoner, anbefales det å injisere i den bakre delen av halen, slik at innsprøytingsstedet ikke er fanget i fluorescens bildet. Det merkede CMP muliggjør målretting og avbildning av spesielle områder av kollagen remodeling in vivo som er vanskelig å påvise ved hjelp av andre metoder. For eksempel, de ELISA-baserte blod-og urinanalyser er følsomme for spaltede kollagen telopeptid fragmenter, men metoden kan ikke lokalisere kilden for kollagen omsetning, fordi den er rettet mot løselige antigener. De viktigste begrensninger av in vivo avbildningsteknikk ved hjelp av NIR-merket CMPS er dybdepenetrasjon dempning og quenching av proksimale samle røde celler som hemoglobin er en endogen quencher på 680/710 nm NIR-fargestoffer. Fremtidige anvendelser av CMP i vivo avbildning inkluderer SPECT eller PET billeddiagnostikk ved hjelp CMPS merket med direkte gamma-emitting radionuklider eller med positron emitters, for diagnostisering av sykdomstilstander som involverer kollagen remodellering (for eksempel osteoporose, artritt, aterosklerose, og fibrose). Disse radiomerkede CMP-analoger vil eliminere begrensningene for signaltapet på grunn av vev dybde og tilstedeværelse av samlede røde celler, og vil tillate kvantitative målinger av sykt vev. I tillegg er den relativt sent avbildning tid (for eksempel 48 til 96 hpi) som resulterer fra den langsomme binding og klaring CMPS kan gjøre det vanskelig å følge hurtige forandringer i kollagen ombygging. En slik begrensning kan overvinnes ved videre prosjektering av bindingskinetikk og affinitet av CMP bildebehandling agenter. Siden CMP binder seg til denaturert kollagen som har lite struktur, er det CMP-baserte kollagen bildebehandling komplementær til andre harmoniske generasjon mikroskopi som bare bildekollagenfibre fem. Når flekker vevsdelene med fluorescensmerkede CMPS, fant vi det fordelaktig å ruge påPrøvene i UV-aktiverte peptid-løsninger ved 4 ° C, fordi den trippel heliske hybridisering blir lettere ved lavere temperaturer 1,20. Det ble også funnet at fordype lysbildene i frisk PBS buffer i en flekker jar er den mest effektive måten å vaske av ubundne CMPS, som fungerer mye bedre enn bare å pipettere vaskebuffere over prøvene. CMP-kollagen tråd hybridisering er veldig spesifikk og robust, og derfor den enkle flekker protokoll som presenteres i denne videoen kan lett modifisert for costaining flere biomarkører, og for å identifisere degradert kollagen i ufestede vevssnitt. Dette er en effektiv og praktisk alternativ til bruk av anti-kollagen-antistoffer for påvisning av fibrøse kollagen i forskjellige histologiske prøver.

Kollagen, det mest tallrike protein i pattedyr, spiller en kritisk rolle i utvikling av vev og regenerering ved å støtte proliferasjonen og differensieringen av celler. Mens fiberbindevevet (f.eks type I, II), i bindevev gi mekanisk styrke til vev, nettverk-lignende kollagen (type IV) danner grunnleggende stillas av basalmembranen der celler fester og danner organiserte vev. Kollagen ombygging innebærer både kollagen degradering (av proteaser) og syntese (fremmet av vekstfaktorer). Selv kollagen ombygging, for eksempel i ben, er en del av den normale vev fornyelsesprosessen overflødig ombygging aktivitet, eller dens forekomst i unormale steder, indikerer vanligvis sårheling respons til en skade eller kroniske patologiske tilstander så som kreft, osteoporose, artritt og fibrose 1-4. Evnen til å direkte bildecollaomgår ombygging in vivo kan føre til forståelse av fremdriftenion av disse sykdommer, så vel som nye diagnostikk og terapi. For eksempel kan direkte avbildning gi informasjon om hvor alvorlig og plasseringen av de sykdommer, og kan også brukes for å vurdere effekten av nye terapeutiske midler. Multiphoton laser scanning mikroskopi og andre harmoniske generasjon har blitt brukt på bilde fibrillar colla for overvåking ekstracellulære matrise ombygging i tumor i levende mus fem. Imidlertid krever denne teknikk dyr som skal monteres med transparente dorsal skinfold kamre, som er en invasiv prosedyre. Direkte og ikke-invasiv avbildning av kollagen ombygging vil dra nytte av en sonde som er spesielt rettet mot kollagen under ombygging. En slik sonde er vanskelige å fremstille, siden det er behov for å skille de ombygging kollagen fra de intakte og modne kollagen, som er rik på normale vev 6. Kollagen består av ekstremt sjeldne proteinstruktur kalt trippel heliks, som erspaltes av proteaser slik som matriks-metalloproteinaser (MMP) under kollagen ombygging. Den kløyvde kollagenfragmenter mister sin trippel spiralformede struktur og bli utfoldet tråder (gelatin), som er nærmere fordøyd av uspesifikke proteaser en. Det ble nylig oppdaget at kollagen mimetisk peptid (CMP) som har tilbøyelighet til å folde inn i trippel helisk struktur kan spesifikt mot kollagen tråder som er dissosiert fra dets trippel helisk tilstand enten ved varme-denaturering, eller ved enzymatisk nedbrytning 1,7. Bindingen er primært drevet av triple-helix hybridisering mellom monomere CMPS og denaturert kollagen tråder. Fordi CMPS selv montere inn homotrimeric trippel helikser ved romtemperatur med lite drivkraft for kollagen hybridisering, et bur CMP [(GPO) 4 NB GPO (GPO) 4, utpekt som NB (GPO) 9, O: hydroxyproline], ble utviklet , som inneholder en foto-spaltbar nitrobenzylgruppe (NB) som er festet til den sentrale glysin av peptidet. NB bur gruppen sterisk hindrer CMP fra brette inn trippel helix, men likevel, fjerning av buret gruppen ved UV-bestråling utløser umiddelbart trippel spiralformede folding og kollagen hybridisering en. Når monomere CMPS merket med nær infrarød (NIR) fluoroforene er systemisk levert til modellen mus, kan de spesifikt mål og la in vivo avbildning av denaturert kollagen i vev som gjennomgår normal (f.eks i bein og brusk) og patologisk (f.eks i svulster) remodeling en . Fluorescensmerkede CMPS kan også anvendes for avbilding av kollagen i histologiske vevssnitt. I histologisk undersøkelse, er høstet vev ofte bevart ved fiksering for å holde de cellulære komponenter og generelle vev morfologi fra forverring. Festefremgangsmåter, som omfatter varme og behandling med organiske løsningsmidler, og kjemisk kryss linking reagenser (f.eks Paraformaldehyde), denaturere trippel spiralformede strukturen av kollagen åtte. Dette denaturering genererer nettsteder for CMP hybridisering. Det har vist seg at fluorescensmerkede CMPS kan spesifikt bindes til kollagen i faste vev-seksjoner (f. eks hud, hornhinne og bein) enda mer effektivt enn et anti-kollagen antistoff, som tillot lettvint identifikasjon av patologiske tilstander i fibrotiske levervev 9. Den CMP er rettet mot denaturert kollagen tråder inneholdende aminosyre-sekvens av trippel skrueformede motiver, som er felles for alle typer av kollagen. Derfor CMP kan betraktes som et bredspektret kollagen farging agent. Her presenterer vi detaljerte eksperimentelle prosedyrer for i) bildebehandling denaturert kollagen tråder in vivo og ii) visualisere kollagen i ex vivo vevssnitt bruker fluorescensmerkede caged CMPS. En NIR tag, IR680, ble konjugert til den innestengte CMP for sanntidsavbildning while karboksyfluorescens (CF) ble brukt i vev farging arbeid for sin kompatibilitet med standard fluorescensmikroskoper. Denne protokollen fokuserer på bildebehandlingsprogrammet av CMPS som relatert til kollagen ombygging. Metoder for CMP syntese kan finnes i tidligere rapporter 1,7,9-15. I dette video rapport ble avbildningsskjelettvevet hos normale mus og vevssnitt fra mus cornea valgt for demonstrasjon formål, men de fremgangsmåter som presenteres her, lett kan anvendes på mange patologiske og biologiske modeller som omfatter kollagen remodellering (for eksempel svulster, sårheling), i samt til nesten hvilken som helst prefiks vevsprøve som inneholder kollagen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IRdye 680RD Maleimide (IR680)</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">929-71050</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5(6)-Carboxyfluorescein</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">21877-5G-F</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:123px;">Advanced Chemtech</td>
			<td style="width:137px;">YC2200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:123px;">Butler Veterinary Supply</td>
			<td style="width:137px;">4/4/5260</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat Serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">G9023-10ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A9647</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:123px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:137px;">10236276001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluoroshield mounting medium</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">F6182-20ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:643px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringes</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:137px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV lamp</td>
			<td style="width:123px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:137px;">1447T17</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Pearl impulse imager</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">9400</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Surgical forceps and scissors</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EasyDip slide staining system</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;">M900-12B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">20-place cardboard microscope slide tray</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:123px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">12-545-c</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;">Eclipse TE2000-E</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging denatured collagen strands in vivo and ex vivo via photo-triggered hybridization of caged collagen mimetic peptides

Kollagen er en viktig strukturell komponent av den ekstracellulære matriks som støtter vev dannelse og vedlikehold. Selv kollagen remodeling er en integrert del av normal fornyelses vev, er overdreven mengde ombygging aktivitet er involvert i tumorer, artritt, og mange andre patologiske tilstander. Under kollagen ombygging, er den triple spiralformede strukturen av kollagen molekyler forstyrret av proteaser i det ekstracellulære miljøet. I tillegg er kollagen som er tilstede i mange histologiske vevsprøver delvis denaturert ved fiksering og konserveringsprosesser. Derfor kan disse denaturert kollagen tråder tjener som effektive mål for biologisk avbildning. Vi har tidligere utviklet et bur kollagen mimetic peptid (CMP) som kan være foto-utløst å hybridisere med denaturert kollagen tråder ved å danne trippel spiralformede struktur, noe som er unikt for kollagen. De overordnede målene for denne prosedyren er i) til bildet denaturert kollagen tråder resulting fra normal remodeling aktiviteter in vivo, og ii) å visualisere kollagen i ex vivo vevssnitt hjelp av foto-utløst caged CMPS. For å oppnå effektiv hybridisering og vellykket in vivo og ex vivo avbildning, fluorescensmerkede caged CMPS er enten foto-aktivert umiddelbart før intravenøs injeksjon, eller er direkte aktivert på vevssnitt. Normal skjelett kollagen remolding i nakne mus og bindevevet i prefiks musehornhinnen vev seksjoner er avbildes i denne prosedyren. Den bilde metode basert på CMP-kollagen hybridisering teknologi som presenteres her kan føre til en dypere forståelse av vev-omdanning prosessen, samt tillate utvikling av nye diagnostikk av sykdommer assosiert med høy collagen ombygging aktivitet.

Figur 1 viser et typisk resultat av hvordan foto utløst IR680-Ahx-(GPO) 9 distribuerer i en sunn kvinne SKH1 naken mus etter 24-96 hr etter injeksjonen. Det viser tydelig CMP opphopning i skjelettet etter 24 HPI, noe som medførte at de fleste av ubundne peptider har vært i stor grad ryddet ut. Prosessen med CMP hybridisere med ombygging kollagen trådene virker relativt langsomt, spesielt i motsetning til andre peptid avbildningsfølere (f.eks RGD 16). Dette er mest sannsynlig på grunn av den langsomme foldefrekvensen av kollagen trippel heliks 17,18. Imidlertid, når hybridisert, CMP trådene blir sterkt bundet til de collagenous vev, som bare liten signalreduksjon er sett etter 24 hpi (figur 1). På 96 HPI, NIR fluorescens bilde av musen etter hud fjerning demonstrerer tydelig skjelett opptak av IR680-Ahx-(GPO) 9 i ryggraden og ribbeina, samt innenfor knær, ankler,håndledd, og lavere underkjever (Figur 2A). I ex vivo vev farging, foto utløst fluorescently-merket caged CMPS spesielt hybridisere til denaturert kollagen tråder i vevssnitt. I figur 3, CMP farging viser klart den fine parallelle kollagen fibriller i det corneale stroma, som viser dens bruk som en kollagenspesifikke farvende middel. <img alt="Figur 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1.jpg" /> Figur 1. NIR fluorescens bilder av en naken mus Serial intravenøst ​​med foto decaged IR680-Ahx-(GPO) 9 viser skjelett opptak over fire dager. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde.</a> <img alt="Fig. 2" fo:content-width = &quot;4in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2.jpg&quot; /&gt; Figur 2. NIR fluorescens bilder av mus administreres med foto decaged IR680-Ahx-(GPO) 9 (A), bur IR680-Ahx-NB (GPO) 9 uten UV-eksponering (B), ferdigbrettete trippel-helical [IR680-Ahx-(GPO ) 9] 3 (C), eller varme-dissosiert single-strand IR680-Ahx-(GPO) 9 (D) ved 96 hpi etter at huden fjernes. Skeletal målretting av CMP kun kan observeres i A og D. NIR fluorescens signaler er vist i regnbue skala. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3.jpg" /> Figur 3. Fluorescens mikrografer av en mus corneal vev delen prefiks i paraformaldehyde, og farget med DAPI og foto-utløst CF (GPO) 9 bruker protokoll 2, viser tett kollagene stroma (farget av CMP, i grønt) samt cellulære epitel og endotel (farget av DAPI, i blått ) (skala bar: 100 mikrometer).

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides at JoVE.com

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Denne fremgangsmåte viser in vivo nær IR fluorescens avbildning av kollagen remodeling aktiviteter hos mus samt ex vivo farging av kollagen i vev-seksjoner ved hjelp av bur kollagen mimetiske peptider som kan være foto-utløst for å hybridisere med denaturert kollagen tråder.

Imaging denaturert kollagen Strands<em&gt; In vivo</em&gt; Og<em&gt; Ex vivo</em&gt; Via Photo-utløst Hybridisering av Caged Kollagen Mimetic Peptider

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Ex vivo Herming av normale og unormale Menneskelig hematopoiesis

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanopartikler for<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Syntese av Native, Fibrous Long Mellomrom og Segmental Long avstand Kollagen

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

En forbedret fremgangsmåte for fremstillingen av type I kollagen fra hud

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse av celle migrasjon innenfor en tre-dimensjonal Kollagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingeniør 3D Cellularized Kollagen Geleer til Vaskulær Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Planar Gradient Diffusion System for å etterforske Chemotaxis i en 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Engineered 3D Silk-kollagen-basert modell av polarisert Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Lag-på-lag Kollagen Nedfall i mikrofluid Enheter for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...