Name: imaging denatured collagen strands in vivo and ex vivo via photo-triggered hybridization of caged collagen mimetic peptides
Uploaded: 2014-01-31T13:00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides at JoVE.com

Författarna tackar Gilbert Grönt för tekniskt stöd. Detta arbete har finansierats med bidrag från NIAMS / NIH (R01-AR060484) och DOD (W81XWH-12-1-0555) tilldelas SMY, och från NIH (U24 CA92871 och U54 CA151838) delas MGP

Samtliga djurstudier genomfördes i enlighet med reglerna i den Johns Hopkins Animal Care och användning kommittén. 1. Near Infrared (NIR) fluorescens avbildning av skelettet Collagen remodeling In vivo <ol><li> Fotoaktivering av det inburade CMP och injektion i svansvenen <ol><li> Förbered 110 l av bur CMP-lösning för varje mus (20-30 g mus vikt): 100 pl lösning för dosering, med en extra 10 l kudde för eventuell förlust under överföringen och injektion. Blanda 11 pl av IR680-Ahx-NB (GPO) 9 stamlösning (400 | iM) med 11 pl av 100 pM cystein i steril PBS-lösning, och sedan bringa den totala volymen till 110 pl med 1 x PBS-buffert. Den slutliga peptidlösningen innehåller 4 nmol IR680-Ahx-NB (GPO) 9 och 1 nmol cystein i 100 ^ il 1 x PBS-lösning. </li><li> Långsamt withdraw peptiden lösningen i en spruta 0,5 ml insulin med en transparent fat och en liten mätare (28-30 G) nål och försiktigt bort luftbubblorna. Slå på UV-lampan så att lampan att värmas upp i 2-5 minuter. </li><li> Placera peptidinnehållande spruta direkt under UV-lampa (365 nm,&gt; 25 mW / cm 2) under 5 min för att tillåta fotoaktivering. </li><li> Under tiden, placera musen i fixeringsutrustning under ett uppvärmt lampa, märka musen med en permanent markör på svansen eller andra metoder för identifiering, såsom öronmärke eller tå tatuering, och desinficera svansen med 70% alkohol. </li><li> Omedelbart efter det att UV-aktivering, injicera 100 ul av UV-aktiverad IR680-Ahx-NB (GPO) 9 lösning i svansvenen, företrädesvis vid den bakre delen av svansen. Placera musen tillbaka till buren efter injektionen. </li></ol></li><li> NIR fluorescens avbildning av kollagen remodeling aktivitet <ol><li> Setvärmeplattan av avbildnings bädd av impuls imager till 37 ° C med användning av Pearl Bärväska 2,0 programvara. </li><li> Sätt naken eller rakat musen i anestesi induktion kammare som innehåller 2% isofluran i syre. Verifiera djup anestesi planet med brist på musrörelser under hantering och genom att övervaka frekvensen av andning (~ 1/sek). </li><li> När musen är sövda, öppna Pearl kameran lådan och placera djuret på bild sängen. Snabbt bort noskonen pluggen och skjut musens nosen innanför noskonen för att hålla musen under narkos (med 2% isofluran i syre levereras vid 2 L / min genom noskonen) under avbildningsprocessen. När musen är på plats, stäng lådan. </li><li> När instrumentet visar &quot;klar&quot; på Bildprogramvarupanelen, klicka på &quot;700-kanalen,&quot; &quot;vitt ljus&quot; och &quot;85 micron&quot; boxar följt av &quot;knappen förvärva bild&quot;. NIR (excitation 685 nm, emission 720 nm) end vitt ljus fotografier kommer då att tas med hjälp av automatisk fokusering och exponering. </li><li> När inspelningen är klar, öppna lådan, slå på musen, och få bilder från en annan vinkel. Musen kan placeras med sin front (ventrala), back (ryggen) eller sidorna vända mot kameran. Smala remsor av tejp kan användas som tvångsmedel för att sträcka ut sina armar och ben för att få den bästa visningen av regionen av intresse (t.ex. bröstkorgen, fotleder och handleder). </li><li> En ordentlig tid att observera skelettupptag av IR680-CMP är mellan 24 till 96 h efter injektion (HPI), baserat på den dosering (~ 4 nmol / mus). För att få högupplösta bilder, offra musen genom halsdislokation medan under djup anestesi efter 72 hpi, ta bort huden (och hår) med hjälp av kirurgisk pincett och sax, och image genom NIR fluorescens enligt ovan. </li><li> Analysera de förvärvade NIR fluorescens bilder. </li></ol></li></ol> 2. Visualisering av kollagener i Ex vivo0; vävnadssnitt <ol><li> Material preparatet <ol><li> Bered en ml av 10% (vikt / volym) BSA-lösning i avjoniserat vatten. Tina 1 ml getserum i ett vattenbad vid rumstemperatur. Skär några bitar av Parafilm i storleken på ca 2 cm x 5 cm. </li><li> Bered 10 ml av blockerande buffert genom att blanda 500 | il getserum, 1 ml 10x PBS och 8,5 ml avjoniserat vatten. Bered 5 ml CMP utspädningsbuffert genom att späda 50 pl av 10% (vikt / volym) BSA med 4,45 ml avjoniserat vatten och 500 | il 10 x PBS. </li><li> Utspädda förrådslösningar av karboxifluorescein-märkt bur CMP, CF NB (GPO) 9 (480 ^ M), till 5 pM med användning av CMP-spädningsbuffert. Optimal CMP koncentrationen varierar från 2,5 till 30 ^ iM, beroende på typen av vävnader och arten av vävnadsprover. En volym av 100 | il rekommenderas för att färga en vävnadssektion slide. Förvara formuleras CMP solutjoner i mörker. </li><li> Låt musen hornhinnan vävnad diabilder anta rumstemperatur. Inkubera objektglasen i 1x PBS-buffert i 5 minuter. Musen hornhinna vävnader som används i denna demonstration har prefixet 4% paraformaldehyd i PBS-lösning under 1 timme, frysförvarade i Tissue-Tek oktober medium cryosectioned till 8 | im tjocklek, och monterad på laddade objektglas. </li></ol></li><li> Vävnads färgning och bildhantering <ol><li> Placera glasen i en fuktig kammare. Till varje objektglas, applicera 0,5 ml blockeringslösning och inkubera objektglasen under 30 min vid rumstemperatur. Avlägsna den blockerande lösningen genom blotting glasen på en pappershandduk. </li><li> Applicera ca 100 l av CF NB (GPO) 9-lösningar för att täcka delar av varje bild vävnad. Inkubera objektglasen i 2 min för att tillåta CMP lösningen att genomtränga vävnaden. </li><li> Sätt på UV-lampan. När lampan är uppvärmd, utsätta CMP-täckta vävnad SETGÄRDER till UV-ljus under 6 min (365 nm, ~ 8 mW / cm 2) att avskydda de caged CMP. Efter UV-exponering, täcka delar av varje bild med en bit Parafilm för att förhindra uttorkning vävnad. Placera objektglasen i fuktkammare och inkubera dem vid 4 ° C under 2 timmar. </li><li> Förbered en 1:3000 utspädning av DAPI-lösning i 1x PBS. Efter CMP färgning, försiktigt bort Parafilm med pincett, och blot bilderna på en pappershandduk för att avlägsna överskott CMP-lösning. Applicera ca 100 | il av utspädda DAPI lösningar till varje vävnad sliden och inkubera under 1 min vid rumstemperatur. </li><li> Efter färgning doppa skivorna i 1 x PBS-buffert i en färgnings burk för 5 min. Upprepa 3x i färskt 1x PBS för att tvätta bort obundna färgningsmedel. </li><li> Lägg en droppe monteringsmedium på vävnadssnittet och täck den med ett glas täckglas och samtidigt undvika att droppa luftbubblor. Placera glasen i en kartong slide fack för att skydda dem från ljus. </li><li>Bild kollagensträngar (FITC kanal) och cellkärnor (DAPI-kanal) i vävnadsglas med ett fluorescensmikroskop. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+collagen+strands+by+photo-triggered+triple-helix+hybridization.">Targeting collagen strands by photo-triggered triple-helix hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14767-14772 (2012).</li><li>Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fibrosis:+therapeutic+translation+for+fibrotic+disease.">Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease.</a> Nat. Med. 18, 1028-1040 (2012).</li><li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases:+regulators+of+the+tumor+microenvironment.">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li><li>Costa, A. G., Cusano, N. E., Silva, B. C., Cremers, S., Bilezikian, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+K:+its+skeletal+actions+and+role+as+a+therapeutic+target+in+osteoporosis.">Cathepsin K: its skeletal actions and role as a therapeutic target in osteoporosis.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 7, 447-456 (2011).</li><li>Perentes, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+imaging+of+extracellular+matrix+remodeling+by+tumor-associated+fibroblasts.">et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts.</a> Nat. Methods. 6, 143-145 (2009).</li><li>Breurken, M., Lempens, E. H. M., Meijer, E. W., Merkx, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-synthesis+of+a+protease-activatable+collagen+targeting+probe.">Semi-synthesis of a protease-activatable collagen targeting probe.</a> Chem. Commun. 47, 7998-8000 (2011).</li><li>Wang, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+modification+of+collagen+scaffolds+mediated+by+triple+helical+propensity.">Spatio-temporal modification of collagen scaffolds mediated by triple helical propensity.</a> Biomacromolecules. 9, 1755-1763 (2008).</li><li>B&#228;chinger, H. P., Morris, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+thermal+stability+of+type+II+collagen+in+various+solvents+used+for+reversed-phase+high+performance+chromatography.">Analysis of the thermal stability of type II collagen in various solvents used for reversed-phase high performance chromatography.</a> Matrix. 10, 331-338 (1990).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+collagenous+proteins+by+fluorescently+labeled+collagen+mimetic+peptides.">Direct detection of collagenous proteins by fluorescently labeled collagen mimetic peptides.</a> Bioconjugate Chem. 24, 9-16 (2013).</li><li>Li, Y., Mo, X., Kim, D., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-tethered+collagen+mimetic+peptides+for+studying+heterotrimeric+triple-helical+interactions.">Template-tethered collagen mimetic peptides for studying heterotrimeric triple-helical interactions.</a> Biopolymers. 95, 94-104 (2011).</li><li>Stahl, P. J., Cruz, J. C., Li, Y., Yu, S. M., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-the-resin+N-terminal+modification+of+long+synthetic+peptides.">On-the-resin N-terminal modification of long synthetic peptides.</a> Anal. Biochem. 424, 137-139 (2012).</li><li>Wang, A. Y., Mo, X., Chen, C. S., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+modification+of+collagen+directed+by+collagen+mimetic+peptides.">Facile modification of collagen directed by collagen mimetic peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 4130-4131 (2005).</li><li>Wang, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+growth+factors+on+collagen+scaffolds+mediated+by+polyanionic+collagen+mimetic+peptides+and+its+effect+on+endothelial+cell+morphogenesis.">Immobilization of growth factors on collagen scaffolds mediated by polyanionic collagen mimetic peptides and its effect on endothelial cell morphogenesis.</a> Biomacromolecules. 9, 2929-2936 (2008).</li><li>Mo, X., An, Y. J., Yun, C. S., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-assisted+visualization+of+binding+interactions+between+collagen+mimetic+peptide+and+collagen+fibers.">Nanoparticle-assisted visualization of binding interactions between collagen mimetic peptide and collagen fibers.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2267-2270 (2006).</li><li>Chan, T. R., Stahl, P. J., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-bound+VEGF+mimetic+peptides:+design+and+endothelial+cell+activation+in+collagen+scaffolds.">Matrix-bound VEGF mimetic peptides: design and endothelial cell activation in collagen scaffolds.</a> Adv. Funct. Mater. 21, 4252-4262 (2011).</li><li>van Hagen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+radiolabelled+cyclic+DTPA-RGD+analogue+for+tumour+imaging+and+radionuclide+therapy.">Evaluation of a radiolabelled cyclic DTPA-RGD analogue for tumour imaging and radionuclide therapy.</a> Int. J. Cancer. 90, 186-198 (2000).</li><li>Boudko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleation+and+propagation+of+the+collagen+triple+helix+in+single-chain+and+trimerized+peptides:+transition+from+third+to+first+order+kinetics.">Nucleation and propagation of the collagen triple helix in single-chain and trimerized peptides: transition from third to first order kinetics.</a> J. Mol. Biol. 317, 459-470 (2002).</li><li>Ackerman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+dependence+of+the+folding+of+collagen-like+peptides.">Sequence dependence of the folding of collagen-like peptides.</a> J. Biol. Chem. 274, 7668-7673 (1999).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li><li>Brodsky, B., Persikov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+the+collagen+triple+helix.">Molecular structure of the collagen triple helix.</a> Adv. Prot. Chem. 70, 301-339 (2005).</li></ol>

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Som kan ses i detta protokoll, är leveransen av CMP okomplicerat eftersom UV-aktivering av de inlåsta i burar sådana planer är det bara ytterligare ett steg på den vanliga svansen ven injektion protokoll 19. Det viktiga är att injicera peptid sonder i en uncaged och metastabil enkelsträng tillstånd. Buren gruppen förhindrar CMP från självorganisering och binda till kollagen (figur 2B) tills den tas bort av UV-ljus vid vilken punkt CMP börjar lägga sig i triple helix. Formuleringen innehåller injektions cystein, som snabbt kan reagera med den klyvda bur gruppen under UV-bestrålning för att minimera toxicitet. Många möss med olika stammar (t.ex. SKH-1 och DR-1) har testats med hjälp av denna formulering, och vi inte upptäcka några beteendemässiga eller andra hälso defekter i dessa möss upp till sex månader. Om injektionen inte följer direkt efter UV-exponering, kommer CmpS vika in homotrimeric trippelspiraler, som inte har någon hybridisering kapacitet. Figur 2C visar ett extremt fall där före injektion CmpS var helt ihop i trippelspiraler med lång fördröjning (&gt; 2 dagar). För att kringgå detta problem bör CMP lösning framställas i relativt låg koncentration (t.ex. ~ 40 pM), och injicerades i möss omedelbart efter UV-decaging. På grund av den långsamma trippelhelix vikning hastighet av CmpS i utspädda betingelser (halva tiden för återveckning:&gt; 50 min) och det korta UV-exponering och insprutningstiden (5 ~ 7 min totalt), de flesta av CmpS in i blodomloppet i singel- strängform när detta protokoll följs. När injicerade, CMP förväntas förbli som enkelsträngar, då koncentrationen är reducerad med en faktor av 20 i blodpoolen, vilket leder till dramatisk minskning av återmontering hastigheten 18. Om injektionen fördröjs (t.ex. på grund av djurhantering) och misstänks homotrimeric återveck är, kan de delvis sammansatta peptider återaktiveras genom upphettning till över 7076, C för att dissociera CmpS till enkelsträngar, följt av snabb kylning och injektion. Även mindre bekvämt, även sådana värme dissocierade CMP visar förväntat resultat från in vivo-inriktade (figur 2D). I denna demonstration var nakna möss användes för NIR fluorescens avbildning, eftersom upp till 50% av NIR-signal kan blockeras av hår. När du arbetar med haired musmodeller (speciellt de med svart hår), rekommenderar vi att raka musen i regionen av intresse innan avbildning med en elektrisk rakapparat eller hår remover. I figur 1, det finns falska positiva signaler från djurets bukhålan, som orsakas av auto-fluorescens av klorofyll i djurets kost. Sådana bakgrundssignaler kan sänkas signifikant genom att byta musen till renade dieter ca 4 dagar före avbildning. Såsom framgår av fig. 1 och 2A, finns det starka CMP uptakes i svansen spinne. Därför, för att undvika artefakter som härrör från ofullkomliga svansvenen injektioner rekommenderar vi att injicera vid den bakre delen av svansen, så att injektionsstället inte fångas i fluorescensbilden. Den märkta CMP möjliggör inriktning och avbildning av specifika platser av kollagen ombyggnad in vivo som är svåra att upptäcka med hjälp av andra metoder. Till exempel, de ELISA-baserade blod-och urinanalyser är känsliga för kluvna kollagentelopeptid fragment, men metoden kan inte lokalisera källan till kollagenomsättningen, eftersom det mål lösliga antigener. De viktigaste begränsningarna i vivo imaging-tekniken att använda NIR märkta sådana planer är djup-of-penetration dämpning och släckning av proximala poolade röda celler som hemoglobin är en endogen släckare på 680/710 nm NIR färgämnen. Framtida tillämpningar av CMP in vivo imaging inkluderar SPECT eller PET-avbildning med sådana planer märkta med direkta gammastrålande radionuklider eller med positron emitters, för diagnostik av sjukdomstillstånd som involverar kollagen remodellering (t.ex. osteoporos, artrit, ateroskleros och fibros). Dessa radiomärkta CMP-analoger kommer att eliminera de begränsningar av signalförlust på grund av vävnadsdjup och förekomst av poolade röda blodkroppar, och kommer att möjliggöra kvantitativa mätningar av sjuka vävnader. Dessutom relativt sent imaging tid (t ex 48-96 hpi) till följd av den långsamma bindande och klarering av sådana planer skulle kunna göra det svårt att följa snabba förändringar i kollagen ombyggnad. En sådan begränsning kan övervinnas genom ytterligare modifiering av de bindande kinetik och affinitet hos CMP-avbildningsmedel. Eftersom CMP binder till denaturerade kollagener som har liten struktur är CMP-baserad kollagen avbildning komplementär till andra harmoniska generationen mikroskopi som endast kan bildkollagenfibrer 5. Vid färgning vävnadssnitt med fluorescerande sådana planer, fann vi det fördelaktigt att inkuberaprov i UV-aktiverad peptidlösningar vid 4 ° C, eftersom trippelspiral hybridisering underlättas vid lägre temperatur 1,20. Man fann också att nedsänkning av objektglasen i färsk PBS-buffert i en färgnings burk är det mest effektiva sättet för att tvätta bort obundna CMP, som fungerar mycket bättre än att bara pipettvättbuffertar över proverna. CMP-kollagensträngen hybridisering är mycket specifik och robust, alltså den enkla färgningsprotokollet presenteras i denna video kan lätt modifieras för costaining ytterligare biomarkörer, och för att identifiera försämrade gener i ofixerade vävnadssnitt. Detta är ett effektivt och praktiskt alternativ till att använda anti-kollagen antikroppar för att detektera fibrösa gener i olika histologiska prover.

Kollagen, det vanligast förekommande proteinet i däggdjur, spelar en kritisk roll vid vävnadsutveckling och regenerering genom att stödja tillväxt och differentiering av celler. Medan fibrösa gener (t.ex. typ I, II), i bindväv ger mekanisk styrka till vävnaderna, nätverksliknande kollagen (typ IV) utgör grundläggande byggnadsställning av basalmembranet där celler fäster och bildar organiserade vävnader. Kollagen ombyggnad innebär både kollagen nedbrytning (av proteaser) och syntes (stöds av tillväxtfaktorer). Även kollagen ombyggnad, t ex i ben, är en del av den normala förnyelsevävnadsprocessen, överskotts ombyggnad aktivitet, eller dess förekomst i onormala lägen, indikerar vanligtvis sårläknings svar på en skada eller kroniska sjukdomstillstånd som cancer, benskörhet, artrit, och fibros 1-4. Möjligheten att direkt bildgener som genomgår ombyggnad in vivo kan leda till förståelse av de framstegion av dessa sjukdomar, såväl som ny diagnostik och terapi. Till exempel, kan levande avbildning ge information om svårighetsgraden och placeringen av de sjukdomar, och kan också användas för att bedöma effekten av nya läkemedel. Multilaserskanning mikroskopi och andra harmoniska generationen har tillämpats på bilden fibrillära kollagener för övervakning av extracellulärt matrix remodellering i tumör i levande möss 5. Detta kräver dock att tekniken djur som skall monteras med transparent rygg skinfold kammare, vilket är en invasiv förfarande. Direkt och icke-invasiv avbildning av kollagen ombyggnad kommer att gynnas av en sond som specifikt riktar kollagen som genomgår ombyggnad. En sådan sond är svårt att förbereda sig eftersom den behöver för att skilja de remodeling gener från de intakta och mogna gener, som är rikligt förekommande i normala vävnader 6. Kollagen är uppbyggd av extremt sällsynt proteinstruktur kallad trippelhelix, som ärspjälkas av proteaser såsom metalloproteinaser (MMP) under kollagen ombyggnad. De klyvda koUagenfragment förlorar sin trippelhelixstrukturen och blir ovikta strängar (gelatin), som ytterligare bryts ner av icke-specifika proteaser 1. Det upptäcktes nyligen att kollagenet mimetiska peptiden (CMP) som har benägenhet att vika in i trippelspiralstruktur specifikt kan rikta kollagensträngar som dissocieras från sin trippelspiral tillstånd av antingen värmedenaturering eller genom enzymatisk nedbrytning 1,7. Bindningen är främst drivet av triple-helix hybridisering mellan mono sådana planer och de denaturerade kollagen strängarna. Eftersom CMP själv montera in homotrimeric trippelspiraler vid rumstemperatur med liten drivkraft för kollagen-hybridisering, en bur CMP [(GPO) 4 NB GPO (GPO) 4, betecknad som NB (GPO) 9, O: hydroxiprolin], utvecklades , som innehåller ett foto-klyvbart mtrobensylgrupp (NB) fäst vid den centrala glycin av peptiden. NB bur gruppen förhindrar steriskt CMP från att vika in i triple helix, ännu, borttagande av buren gruppen genom UV-strålning utlöser omedelbart trippelspiral vikning och kollagen hybridisering 1. När mono sådana planer märkta med nära infraröd (NIR) fluoroforer är system levereras till modell möss, kan de specifikt mål och släppa in vivo avbildning av denaturerade kollagener i vävnader som genomgår normal (t.ex. i ben och brosk) och patologisk (t.ex. tumörer) ombyggnad 1 . Fluorescensmärkta CMP kan också användas för avbildning av kollagener i histologiska vävnadssnitt. Vid histologisk undersökning, skördas vävnader ofta konserverade med fixering för att hålla de cellulära komponenterna och övergripande vävnadsmorfologin från försämring. Fäst förfaranden, som inkluderar värme, och behandling med organiska lösningsmedel och kemisk tvär linking reagens (t.ex. paraformaldehyd), denaturera trippelhelixstruktur av kollagen 8. Denna denaturering skapar platser för CMP hybridisering. Det har visat sig att fluorescensmärkta CMP kan specifikt binda till kollagener i avsnitten fixerad vävnad (t ex hud, hornhinna, och ben) ännu mer effektivt än en anti-kollagen-antikropp, som tillät facile identifiering av patologiska tillstånd i fibrotiska levervävnader 9. CMP riktar denaturerat kollagen-strängar som innehåller aminosyrasekvensen av trippel-helixmotiv, som är gemensam för alla typer av kollagener. Därför CMP kan betraktas som en bredspektrumkollagenfärgningsmedel. Här presenterar vi detaljerade experimentella förfaranden för i) avbildning denaturerade kollagensträngar in vivo och ii) visualisera gener i ex vivo vävnadssnitt med hjälp av fluorescerande Caged sådana planer. En NIR-tagg, IR680, konjugerades till den bur CMP för live-avbildning, while karboxyfluorescein (CF) användes i vävnadsfärgning arbete för sin kompatibilitet med standardfluorescensmikroskop. Detta protokoll är inriktat på bildprogram i sådana planer som relaterade till kollagen ombyggnad. Metoder för CMP-syntes finns i tidigare rapporter 1,7,9-15. I den här videon rapporten, var att avbilda skelett vävnader i normala möss och vävnadssnitt av mus hornhinnan som valts för demonstration, men de metoder som presenteras här kan lätt tillämpas på många sjukdomar och biologiska modeller som involverar kollagen ombyggnad (t.ex. tumörer, sårläkning), som samt till nästan alla prefix vävnadsprov som innehåller kollagen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IRdye 680RD Maleimide (IR680)</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">929-71050</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5(6)-Carboxyfluorescein</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">21877-5G-F</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:123px;">Advanced Chemtech</td>
			<td style="width:137px;">YC2200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:123px;">Butler Veterinary Supply</td>
			<td style="width:137px;">4/4/5260</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat Serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">G9023-10ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A9647</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:123px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:137px;">10236276001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluoroshield mounting medium</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">F6182-20ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:643px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringes</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:137px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV lamp</td>
			<td style="width:123px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:137px;">1447T17</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Pearl impulse imager</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">9400</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Surgical forceps and scissors</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EasyDip slide staining system</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;">M900-12B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">20-place cardboard microscope slide tray</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:123px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">12-545-c</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;">Eclipse TE2000-E</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging denatured collagen strands in vivo and ex vivo via photo-triggered hybridization of caged collagen mimetic peptides

Kollagen är en viktig strukturell komponent i den extracellulära matrisen som stödjer vävnadsbildning och underhåll. Även kollagen remodeling är en integrerad del av normal förnyelse vävnad, är alltför mycket ombyggnad aktivitet inblandad i tumörer, artrit och andra sjukdomstillstånd. Under kollagen ombyggnad, är trippelhelixstruktur kollagenmolekyler störs av proteaser i den extracellulära miljön. Dessutom används kollagener är närvarande i många histologiska vävnadsprov delvis denatureras genom fixerings och konserveringsprocesser. Därför kan dessa denaturerade kollagen strängarna tjäna som effektiva mål för biologisk bildåtergivning. Vi har tidigare utvecklat ett caged kollagen mimetisk peptid (CMP), som kan vara foto-utlöst för att hybridisera med denaturerade kollagensträngar genom att bilda trippelspiralstruktur, som är unik för kollagener. De övergripande målen för detta förfarande är i) att bilden denaturerad kollagen trådar resulting från normala remodeling aktiviteter in vivo, och ii) att visualisera gener i ex vivo vävnadssnitt med hjälp av foto utlöst Caged sådana planer. För att uppnå en effektiv hybridisering och framgångsrik in vivo-och ex vivo-avbildning, fluorescensmärkta Caged CMP är antingen fotoaktiverad omedelbart före intravenös injektion, eller påverkas direkt på vävnadssektioner. Normal skelettkollagen remolding i nakna möss och kollagener i förutfastställt mouse cornea vävnadssektioner avbildas i detta förfarande. Den avbildningsmetod baserad på CMP-kollagen hybridisering teknik som presenteras här kan leda till djupare förståelse av vävnadsombildning processen samt möjliggöra utveckling av ny diagnostik för sjukdomar som förknippas med hög kollagen remodeling aktivitet.

Figur 1 visar ett typiskt resultat av hur bild-utlöst IR680-Ahx-(GPO) 9 distribuerar i en frisk kvinnlig SKH1 naken mus efter 24 till 96 h efter injektion. Det visar uppenbart CMP ackumulering i skelettet efter 24 hpi, vid vilken punkt de flesta av obundna peptider har i stort sett rensat ut. Processen för CMP hybridisera med remodeling kollagensträngar verkar relativt långsamt, särskilt i motsats till andra peptidavbildningssonder (t.ex. RGD 16). Detta är troligen på grund av den långsamma fällbara hastigheten för kollagen triple helix 17,18. Men en gång hybridiserade, CMP strängarna är starkt bundna till de kollagenartade vävnader, som endast smärre signal minskning ses efter 24 hpi (Figur 1). Vid 96 hpi, visar NIR fluorescens bild av musen efter borttagning hud tydligt skelett upptag av IR680-Ahx-(GPO) 9 i ryggrad och revben, samt inom knän, fotleder,handleder och undre käkarna (Figur 2A). I ex vivo vävnadsfärgning, foto-utlöst fluorescerande-märkta Caged sådana planer specifikt hybridisera till denaturerade kollagensträngar i vävnadssnitt. I fig. 3, avslöjar CMP färgning tydligt de fina parallella kollagenfibriller i hornhinnans stroma, vilket visar dess användning som en kollagenspecifik färgningsmedel. <img alt="Figur 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1.jpg" /> Figur 1. Serie NIR fluorescens bilder av en naken mus intravenöst med foto decaged IR680-Ahx-(GPO) 9 visar skelettupptag under fyra dagar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width = &quot;4I&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2.jpg&quot; /&gt; Figur 2. NIR-fluorescensbilder av möss administrerade med foto decaged IR680-Ahx-(GPO) 9 (A), caged IR680-Ahx-NB (GPO) 9 utan UV-exponering (B), förvikta trippelspiral [IR680-Ahx-(GPO ) 9] 3 (C), eller värme dissocierade enkelsträng IR680-Ahx-(GPO) 9 (D) vid 96 hpi efter borttagning hud. Skeletal målinriktning av CMP kan endast observeras i A och D. NIR fluorescens signaler visas i regnbågens skala. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3.jpg" /> Figur 3. Fluorescens micrographs av en co-musrneal vävnadssnitt prefix i paraformaldehyd och färgades med DAPI och foto utlöst CF (GPO) 9 med hjälp av protokoll 2, visar tät kollagen stroma (färgas av CMP, i grönt) och cell epitel och endotel (färgas med DAPI, i blått ) (skala bar: 100 nm).

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides at JoVE.com

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Denna procedur visar in vivo nära IR fluorescens avbildning av kollagen remodeling aktiviteter hos möss samt ex vivo färgning av kollagen i vävnadssnitt med hjälp av caged kollagen mimetiska peptider som kan foto utlöst hybridisera med denaturerad kollagen trådar.

Imaging Denaturerat Kollagen Strands<em&gt; In vivo</em&gt; Och<em&gt; Ex vivo</em&gt; Via Foto-utlöst Hybridisering av Caged Collagen Mimetic peptider

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Hög upplösning 3D-avbildning av Ex vivo Biological Samples av Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Ex vivo Mimicry den normala respektive onormala mänskliga Hematopoiesis

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Virala Nanopartiklar för<em&gt; In vivo</em&gt; Tumöravbildning

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro-syntes av Native, Fibrös Lång avstånd och segment Lång avstånd Kollagen

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

En förbättrad metod för framställning av typ I kollagen från huden

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analys av Cell Migration inom en tredimensionell kollagenmatris

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingenjörs 3D Cellularized kollagengeler för kärlvävnad Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Planar Gradient Diffusion System för att undersöka Chemotaxis i en 3D kollagenmatris

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Engineered 3D Silk-kollagenbaserad modell av polariserat Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Skikt för skikt kollagendeponering i mikroflödessystem enheter för Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...