Name: a proboscis extension response protocol for investigating behavioral plasticity in insects: application to basic, biomedical, and agricultural research
Uploaded: 2014-09-08T13:00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research at JoV

Esta pesquisa foi apoiada por financiamento do NIH NCRR (R01 RR014166 a BHS), NIH NIDCD (R01 DC011422 BHS co-PI), o Departamento de Agricultura dos EUA (J Trumble PI; BH Smith co-PI) e da Universidade Estadual do Arizona. O financiamento para a oficina para treinar os alunos (dados da Figura 4) foi fornecido pela Fundação para a Ciência do Chile.

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The authors have no conflicts of interest to disclose.

Este protocolo apresentou dois métodos confiáveis ​​para o condicionamento usando o procedimento PER. Estes são dois dos vários métodos que têm sido empregados com sucesso 27, 21. Nós empregamos o método 2 para todos os estudos experimentais utilizando PER, pois é consistente e confiável, mesmo em diferentes experimentadores. O mesmo procedimento básico foi adaptado para muitos tipos diferentes de estudos com as abelhas, incluindo o uso de diferentes estímulos condicionado e diferentes reflexos comportamentais. Também tem sido associada com as investigações da base genética de diferenças na aprendizagem 28,29, as correlações fisiológicas de percepção olfactiva e memória no cérebro 13,14,30, e as bases genéticas e moleculares moduladores de comportamento 15,16,31 . Devido ao avançado conhecimento da relevância ecológica de aprendizado olfativo para as abelhas, que começou com os primeiros estudos realizados por Karl von Frisch mais de 100 anos atrás <sup&gt; 31, os resultados do PER pode ser facilmente ligado a necessidades de sobrevivência de uma colônia. Mais recentemente, ele foi adaptado para um estudo agrícola para investigar os efeitos comportamentais subletais de pesticidas e toxinas ambientais 17. O procedimento básico é poderosa em que ele pode ser aplicado para estudar problemas em outras espécies. Duas espécies de mariposas, Manduca sexta e Spodoptera littoralis, foram utilizados nos estudos por investigar as bases neurais da identificação odor e capacidades de aprendizagem olfativos de cada espécie 32,33. Experimentos com moscas de frutas POR forneceram muitos insights sobre as cascatas de sinalização moleculares envolvidos na chemosensation e aprendizagem 34. E PER recentemente tem sido usado para estudar a habituação no pulgas (Rhodnius prolixus) 35, um importante vetor da doença. Em geral, o processo é robusto às alterações no método; o uso de dmétodos iferentes provavelmente irá produzir a mesma diferença relativa entre os grupos de tratamento. Apesar de o processo relativamente simples, vários problemas podem impedir, por vezes, as abelhas de aprender a associação de odor-sacarose. Os tópicos a seguir são possíveis alterações ao protocolo e alguns dos problemas mais comuns que podem surgir durante PER condicionado. Considerações sobre o número eo tipo de ensaios, no Protocolo Condicionado Tanto o protocolo de aprendizagem requer exposição das abelhas a uma série de ensaios em fase de aquisição. Este número depende em larga medida da dificuldade da tarefa. As abelhas do mel pode aprender uma tarefa simples depois de uma única tentativa, mas eles precisam de pelo menos um de três ensaios para induzir a formação da memória de longo prazo. Como esperado, as abelhas exigirá significativamente mais ensaios para aprender adequadamente uma tarefa difícil. Geralmente, existe um número máximo de tentativas para além do qual as abelhas não melhoram significativamente adesempenho IR. Este máximo depende da tarefa específica, os tipos e concentrações de odor e a concentração de sacarose. Ao utilizar mais de um tipo de teste com diferentes odores, apresentar os diferentes tipos de teste em uma seqüência pseudo-aleatórios para manter as abelhas de memorizar uma sequência simples de apresentações de odor em vez de aprender as diferenças entre os odores 36. Nestas sequências pseudo-aleatórios, deve haver um número igual de ensaios para cada um dos tipos de odores. Além disso, a probabilidade de um ensaio de um tipo de odor serem precedidos por e seguido pelo mesmo odor, ou qualquer dos outros odores, devem ser iguais para todos os odores. Por dois odores - A e B - use a seguinte seqüência: ABBABAAB. Nos oito ensaios cada odor é apresentado quatro vezes. Concatenar sequências idênticas a atingir o número desejado de ensaios para cada odor. Independentemente do desenho experimental, existem alguns parâmetros que devem permanecerconstante, a fim de optimizar a aprendizagem. A sobreposição entre o CS e os EUA é fundamental para o condicionamento eficaz. O intervalo inter-julgamento (Figura 1, Tabela 1) precisa ser constante e ser otimizado, porque a irregularidade ou a um intervalo inter-julgamento muito curto ou muito longo pode influenciar significativamente a eficácia do protocolo condicionado 1. Considerações sobre a importância ea concepção dos ensaios testes comportamentais As respostas obtidas durante a &quot;fase de aquisição&quot; de um experimento, quando o CS e US forem apresentados juntos, pode ser útil. No entanto, tomar cuidado para que as condições de apresentação odor pode variar de um tipo de julgamento para outro. Durante os ensaios reforçados, o odor, seguido da sacarose é apresentado em conjunto com um estímulo visual (o movimento do dispositivo para entregar a gota de sacarose) que pode afectar a resposta do abelha. E as abelhas têm apenas três segundos para mostrar uma resposta (de quatro segundos de estimulação de odor, menos a um segundo sobreposição com a apresentação de sacarose, Figura 1). Se o experimento envolve as abelhas aprendem a diferenciar dois odores (por exemplo, armado e não armado), o odor sem reforço apresentado em ensaios alternativos ocorre sem o estímulo visual da apresentação recompensa e as abelhas têm o total de quatro segundos para responder. Portanto, as respostas aos dois odores não são totalmente comparáveis ​​durante a aquisição. Com qualquer protocolo condicionado, não dependa exclusivamente de curvas de aquisição de um. Para melhor conhecer o que as abelhas aprenderam, introduzir uma série de ensaios de teste sem reforço, durante a qual nem odor é reforçada, o que garante que os testes de todos os estímulos ocorre em condições idênticas. Dependendo da finalidade específica da experiência, o teste pode consistir em ensaios de teste individuais do odor condicionado ou uma série de ensaios com o od condicionadoou, ou uma combinação dos odores condicionado e novos. Um ensaio único teste do odor condicionado proporciona um simples ensaio de saber se as abelhas &#39;lembrar o odor condicionado. No entanto, a resposta ao primeiro ensaio de teste pode refletir o nível de motivação das abelhas, bem como a sua recordação do odor condicionado. Uma série de ensaios de teste, ou uma série de testes de extinção do odor condicionado ou uma série de testes individuais da condicionado e um ou mais novos odores, também pode ser utilizado para avaliar a memória. A série de testes de extinção pode avaliar o quão fortemente as abelhas &#39;lembrar a associação condicionado. Quanto mais forte a lembrança do maior número de ensaios necessários para extinguir a resposta condicionada. Uma série de testes individuais de odores condicionados e novos podem também avaliar a especificidade de memória do odor condicionado das abelhas. É também imperativo para condicionar e testar grupos controle e tratados no mesmo intervalo de tempo. Comparção do desempenho de abelhas logo após o condicionamento para as abelhas realizadas por períodos de tempo mais longos é problemática por causa da exposição para os EUA sacarose alimentando as abelhas até a saciedade. Por exemplo, uma diminuição no desempenho depois de longos intervalos pode ser devido a deterioração da memória ou pode ser devido a alterações no estado de motivação e / ou de aprendizagem induzidas pela exposição não reforçada para os EUA, tornando os resultados ambíguos. Por conseguinte, o desempenho de um grupo de tratamento deve ser sempre considerada em relação a um grupo de controlo de ar e testados nos mesmos pontos de tempo. Concentração Odor e Integridade Existem várias maneiras pelas quais a concentração e a integridade do odor (CS) podem ser comprometidas. O problema mais comum com a entrega de odor é a depleção dos cartuchos de odor por excesso de uso (Figura 2). Substitua os cartuchos de 10-12 usos (a cada 2 ou 3 estudos com grupos de cinco abelhas) para evitar essa armadilha. Também é crítico para utilizarcartuchos frescos para os ensaios de teste, uma vez que os cartuchos usados ​​podem ser diferencialmente esgotados e, portanto, apresentam estímulos odor desigual. Um outro problema comum é a contaminação do cartucho de odor devido à utilização do cartucho para mais do que um odor sem limpá-lo completamente. Um fluxo de ar sujo ou contaminado também pode introduzir involuntariamente estímulo olfativo adicional (filtros de carvão ativado pode evitar a contaminação de fundo). Isto é especialmente problemático quando o acoplamento POR condicionado com medições das respostas fisiológicas no odor. Cartuchos de odor Leaky apresentar um problema, já que as abelhas são expostas a um odor antes do julgamento começar, o que reduz a relevância do estímulo odor. Folgada sobre o suprimento de ar para entrega odor pode resultar em pouca ou nenhuma entrega odor quando a válvula abre, reduzindo artificialmente a resposta das abelhas para o odor pretendido. Solução de sacarose e estímulo incondicionado (Reward) A umde montagem, a concentração e a integridade da solução de sacarose utilizados como os EUA é vital para o sucesso da experiência. O condicionamento é uma função da quantidade e da concentração da solução de sacarose em água utilizado como os EUA 37. As seringas micrométricas utilizados no método 2 para permitir que muito precisa (até 0,2 l) de controle de entrega dos Estados Unidos, e recomendamos o uso deles para ambos os métodos descritos. O uso dos palitos (método 1) é adequado para situações em que as seringas caras não podem ser utilizados, tais como, na formação de grandes grupos de alunos, o trabalho no campo, ou com orçamentos mais baixos. Implementação cuidadosa do método 1 é bom, desde que tempo é mantida com a substituição regular de palitos de dente para evitar o acúmulo de sacarose (ea concentração entregues). No entanto, utilizando palitos é mais difícil de controlar com precisão e estimar a quantidade e magnitude de os EUA entregue, o que é importante para os estudos de condicionamento 1. A concentração de sacarose necessária paraoferecer uma recompensa suficiente para manter as abelhas motivados para aprender a associação condicionada pode depender da dificuldade da tarefa e estado interno das abelhas ou época do ano. As tarefas mais difíceis exigem uma solução de sacarose maior para o abelhas &#39;para aprender com sucesso a tarefa. Molde pode acúmulo em soluções de sacarose até a 5 ° C, o que irá comprometer a integridade da solução, afetando a saúde ea percepção da recompensa das abelhas durante o experimento. O melhor é substituir a solução de todos os dias. Precision, Timing, e consistência de CS e US Entrega A questão mais crítica sobre a aplicação adequada de um procedimento PER, ou para essa matéria qualquer procedimento condicionado, envolve precisão, tempestividade e consistência do CS e entrega US (Figura 1). Os investigadores que são novos para o procedimento freqüentemente são imprecisas sobre a entrega de um ou ambos os estímulos. ISI doque não permitir a sobreposição do CS e US resultar num desempenho fraco condicionado. O PLC automatiza um sinal sonoro para o experimentador para entregar sacarose 3 segundos após o início do fornecimento do odor. Os investigadores devem realizar a sacarose / gota de água perto da abelha para entrega rápida após o sinal. Estes procedimentos ajudar arrastam uma ISI consistente. Colocar um cronômetro na arena condicionado permite a colocação do julgamento tempo conveniente, bem como monitorar o tempo das abelhas na arena, tanto antes como após a entrega de estímulos. Dessa forma, as ITI do pode ser relativamente consistente e todo o procedimento pode ser executado em um ritmo controlado. ITI do que são muito curtos, por exemplo, menos de 1 min, ou muito tempo pode levar a um mau desempenho condicionado 1. Sazonais, ambientais e contextuais Efeitos sobre a Honey Bee Desempenho Desempenho das abelhas produtoras de mel pode ser significativamente influenciados por seus arredoresantes e durante o condicionamento. Freqüentemente, as variações de temperatura e disponibilidade de alimentos que vêm com a mudança das estações irá alterar a motivação das abelhas para aprender. Quando as flores estão em flor, a motivação das abelhas para aprender a associação condicionado no laboratório diminui 38. Quando a colônia é sublinhada - de temperaturas extremas, falta de alimentos ou estresse relacionado à doença - as abelhas &#39;mostrará uma redução do desempenho escolar no interior. As abelhas do mel mantido em um quarto de vôo pode aprender bem por um tempo, mas há também o estresse da doença e envelhecimento degradar seu desempenho de aprendizagem ao longo do tempo. O contexto durante condicionado também pode diminuir o desempenho das abelhas. Quaisquer cheiros estranhos, movimento e outros estímulos podem distrair a abelha a partir dos estímulos experimentais. Para evitar este problema, manter um contexto visual razoavelmente consistente, simplificado. Genótipo e experiência afeta o desempenho por &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; trabalhadores de abelhas podem diferir consideravelmente no desempenho em qualquer procedimento de condicionamento devido à especialização de tarefas, genótipo, ou outros fatores ambientais 20. Portanto, é importante para padronizar, tanto quanto possível, os tipos de animais utilizados em uma experiência de modo a reduzir a variação inter-individual. Em uma colônia liderada por uma rainha open-acoplado, o que significa que ela acasalou com vários drones diferentes, os trabalhadores serão diferentes no genótipo paterno. Background genético pode levar a grandes diferenças na capacidade de resposta sensorial 39 e 29 de desempenho de aprendizagem. Usando colônias lideradas por rainhas inseminadas instrumentalmente por esperma de drones individuais 28 reduz esta variação inter-individual. Os protocolos acima descritos, inclui um método para coleta de trabalhadores da abelha do mel da entrada do ninho. No entanto, estas abelhas diferem uns dos outros no que diz respeito à idade ou ao teste comportamental. Eles podem ser jovens (inexperienced) ou experientes) forrageiras mais velhos (mais. Eles podem ser abelhas jovens fazendo seus primeiros vôos de orientação. Ou podem ser abelhas de guarda. Para reduzir a variabilidade, marque as abelhas com uma tinta de esmalte de secagem rápida ou marcação etiquetas ou como eles emergem como adultos (para controlar para a idade) e / ou quando começam forrageamento (para controle de experiência). Então, alguns dias depois, recolher as abelhas marcadas para o condicionamento. Trabalhadores que estão envolvidas no comportamento de enfermagem podem ser coletadas a partir dos quadros dentro da colméia. Enfermeiros podem ser identificados positivamente quando inserir suas cabeças em uma célula de cria para alimentar e cuidar da larva dentro. Usando Virgin Rainhas ou Drones para PER Condicionado Além de abelhas operárias, rainhas virgens de abelhas e zangões podem ser facilmente acondicionados em um procedimento PER de estudos visando ao desenvolvimento de linhas genéticas de abelhas que diferem em desempenho 28 aprendendo. Rainhas virgens devem ser coletadas logo após ªey emergir da fase de pupa e colocado diretamente em arreios de contenção, sem anestesia. Drones jovens, imaturos coletados a partir do favos de cria dentro da colônia geralmente não são motivados a aprender. Depois que eles começaram a acasalar vôos, drones prontamente aprender tarefas por 28. Eles devem ser recolhidos ao retornarem de um vôo de acasalamento e mantido durante a noite em uma pequena gaiola em uma colônia utilizada para a criação de rainhas. Não tente aproveitá-los no dia anterior condicionado; eles não sobrevivem bem em arneses durante a noite. Um par de horas antes de condicionamento, os drones podem ser recolhidos das gaiolas e colocados em arreios de contenção, sem anestesia. Conclusões Este procedimento de PER, na forma de métodos, eleva-se a um ponto de partida para a concepção de experiências PER. A maioria dos protocolos por exigirá que o procedimento descrito ser alterado de alguma forma para implementar as metas específicas de cada ensaio e accommodate grupos de tratamento múltiplos. Ele é fácil de implementar. No entanto, a aplicação correcta exige atenção aos detalhes e prática. Uma vez dominado, pode ser um procedimento poderoso para adicionar uma ferramenta de pesquisa para vários programas de pesquisa básica e aplicada com diferentes espécies de insetos.

Muitos insetos aprender sobre estímulos ecologicamente relevantes, e, em seguida, mudar suas respostas comportamentais a esses estímulos, a fim de adaptar-se a novas relações preditivas em seu ambiente. Vários mecanismos diferentes podem estar subjacentes a esta plasticidade comportamental (por exemplo, não associativa, associativa / pavloviano e operante / instrumental 1). Estes tipos de plasticidade diferem na forma como os estímulos ou comportamentos estão associados com eventos importantes, tais como a ocorrência de comida, um companheiro, ou perigo. Entender essas formas de plasticidade é muito importante para a pesquisa básica sobre como o sistema nervoso muda para codificar novas memórias 2. Também é importante para a compreensão dos comportamentos adaptativos de insetos que são vetores importantes da doença (por exemplo, tsé-tsé e mosquitos) e insetos que são importantes na agricultura, seja na produção agrícola (abelhas) ou como pragas. Estudando plasticidade comportamental em qualquer animal requer um nível de controle experimental sobre um número de variáveis ​​que não é viável no campo 1. É necessário o desenvolvimento de um protocolo de condicionamento robusta que pode ser empregue sob condições mais controladas, mas que ainda são relevantes para o comportamento em condições naturais. O mel de abelha (Apis mellifera) é um excelente modelo de como desenvolver um protocolo para a realização de análises de controlo comportamental 3,4 plasticidade. O narigudo Extensão Resposta (PER) em abelhas é um reflexo do comportamento natural em que a abelha estende sua tromba em resposta à estimulação da antena com uma solução de açúcar. Durante o forrageamento normal, PER ocorre quando a abelha encontra o néctar em uma flor. Felizmente, as abelhas prontamente apresentar este comportamento simples e facilmente quantificáveis ​​em laboratório. Isso torna possível para estudar, em um ambiente controlado, os mecanismos que influenciam esse comportamento ecologicamente relevante 5. PER can também ser usado dentro de um protocolo de condicionamento para investigar a percepção do estímulo e aprendizagem e memória em diferentes condições de tratamento, que são projetados para revelar os mecanismos comportamentais e neurais subjacentes à plasticidade 6. Desde os primeiros estudos realizados por Kuwabara 7, PER condicionado tem sido amplamente utilizada para revelar não associativa, associativa e mecanismos operantes que fundamentam a plasticidade comportamental em abelhas 8. Estes mecanismos são idênticas àquelas reveladas em estudos de que voam livremente abelhas 9. Ao contrário dos estudos de voar livremente abelhas, protocolos POR condicionado pode ser acoplado com eletrofisiologia 10,11 ou células vivas imagens de fluorescência 12-14 do cérebro. Além disso, protocolos por permitir a manipulação experimental de vias neurais através de tratamentos farmacológicos ou genéticos moleculares para testar hipóteses sobre os papéis dos componentes específicos da rede, tais como neuromodulators 15,16. Protocolos por também ter fornecido uma forma importante de avaliar os efeitos subletais de condições ambientais, bem como toxinas sobre a saúde e a eficiência de forrageamento das abelhas 17. Este procedimento descreve dois métodos de entrega de odor em paralelo. Método 1 é uma versão de odor e de estímulo não condicionado (sacarose) de entrega que fornece um método barato e tecnicamente simples para a apresentação do odor e recompensa sacarose. Este método é bom para o treinamento básico e quando a automatização não é possível. É uma excelente maneira de introduzir esta técnica para uma sala de aula ou laboratório de ensino. Durante o condicionamento para experimentos envolvendo tarefas mais difíceis e as avaliações fisiológicas acopladas de percepção de odor, a aprendizagem, ou de memória, é muito importante para a precisão e exatidão regular o início, o tempo de entrega da duração dos estímulos. Para a entrega de estímulo mais fiável, utilizar um meio de automatizar a entrega de um odornd um método preciso de entrega recompensa. Método 2 emprega automatizado entrega odor e entrega de sacarose mais precisa. É tecnicamente mais sofisticado e exige mais para a configuração inicial do método 1, mas aumenta significativamente a coerência entre o calendário ea quantidade de estímulos utilizados para o condicionamento e deve ser usado sempre que possível.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1278">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:587px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Sucrose</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9378-1KG</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Odorant compounds (for example):</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td rowspan="6" style="width:587px;">For additional examples of odorants, see any of the papers on olfactory processing from the Smith lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">1-hexanol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">471402-100ML</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">2-octanone</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W280208-800G-K</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">heptanol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">51778-5ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">gerianol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">163333-25G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">nonanal</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">131210-100ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Hexane</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">296090-1L</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Heavy Mineral Oil</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">330760-1L</td>
			<td style="width:587px;">Make sure it&#8217;s odorless</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ethanol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459836-1L</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Scintillation vials</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z190535-1PAK</td>
			<td style="width:587px;">Use a small drill bit to bore a small hole in the cap of the vials&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Bee harness</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;">Custom-made from 0.9 cm diameter plastic soda straws or hard plastic/metal tubing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Duct tape</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z188956-1PAK</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Wash bottles</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z560847-3EA</td>
			<td style="width:587px;">For the 70% ethanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Small fan in mountable housing</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Dryer tubing</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">FOR METHOD 1 ONLY</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Name</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:587px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">20 ml disposable plastic syringes</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">WU-07945-18</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">15 mm filter paper circles</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z274844-1PAK</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Pushpins</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Toothpicks</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">FOR METHOD 2 ONLY</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Name</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:587px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Gilmont Micrometer syringe, 0.2 mL</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-07840-00</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Gilmont micrometer syringe tip</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-07841-00</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">26G 3/8&#8221; Leur hub hypodermic needles</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-826-10</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:371px;">1cc tuberculin syringes (plastic/glass)</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z181641-1EA&#160;&#160; OR &#160;&#160;Z192090-200EA</td>
			<td style="width:587px;">glass tuberculin syringes are available, but plastic syringes are much less expensive and will work well for a limited number of uses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small rubber/silicone restrictors</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-95702-02</td>
			<td>Made from 4.8 mm outer diameter silicone tubing or the rubber tips of the 1 cc syringe plungers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Parafilm</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">75 X 100 mm filter paper</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z695106-500EA</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Direct Logic 05 Programmable Logic Controller</td>
			<td style="width:203px;">Koyo Electronics Industries Co, Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;">http://www.koyoele.co.jp/&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OR&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; english/support/dlc.html#plc</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">1 mm, 4mm &#38; 6 mm inner diameter PVC or silicone tubing&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td style="width:587px;">Cole-Parmer has a wide selection of suitable tubing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Polypropylene connectors &#38; leur fittings</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td style="width:587px;">Cole-Parmer has a wide selection of connectors and fittings for many tube sizes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">65-mm Correlated Flowmeter</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-03216-08</td>
			<td style="width:587px;">Aluminum with Glass float; For Liquids and Gases, With Valve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">&#160;&#160;&#160;&#160; OR&#160;</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Aquarium Air Pump</td>
			<td style="width:203px;">Aquacave</td>
			<td style="width:119px;">AE-TETRA-300</td>
			<td style="width:587px;">www.aquacave.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">LIF series Solenoid Valves for .042 &#34; ID Tubing, Configuration &#34;E&#34;</td>
			<td style="width:203px;">The Lee Company</td>
			<td style="width:119px;">LFAA1200118H</td>
			<td style="width:587px;">Neoprene, 430 SS, 302 SS, 280mWatts&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; http://www.theleeco.com/LEEWEB2.NSF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">PC-Board 12VDC 70dB Piezo Buzzer</td>
			<td style="width:203px;">RadioShack</td>
			<td style="width:119px;">273-074</td>
			<td style="width:587px;">www.radioshack.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a proboscis extension response protocol for investigating behavioral plasticity in insects: application to basic, biomedical, and agricultural research

Insetos modificar suas respostas a estímulos através da experiência de associar esses estímulos com eventos importantes para a sobrevivência (por exemplo, alimentos, companheiros, ameaças). Existem vários mecanismos comportamentais através do qual um inseto aprende associações salientes e relaciona-os com esses eventos. É importante compreender que esta plasticidade comportamental para os programas destinados para dar assistência aos insetos que são benéficos para a agricultura. Este entendimento também pode ser utilizado para descobrir soluções para problemas biomédicos e agrícolas criada por insectos que actuam como vectores de doenças e pragas. O protocolo condicionado narigudo Extensão Resposta (PER) foi desenvolvido para as abelhas (Apis mellifera) com mais de 50 anos atrás para estudar como eles percebem e aprender sobre os odores florais, que sinalizam os recursos de néctar e pólen de necessidades para a sobrevivência da colônia. O procedimento PER fornece uma estrutura robusta e fácil de empregar para estudar vários mecha ecologicamente relevantes diferentenismos de plasticidade comportamental. Ela é facilmente adaptável para utilização com várias outras espécies de insectos e outros reflexos comportamentais. Estes protocolos podem ser prontamente empregues em conjunto com vários meios para a monitorização da actividade neuronal no SNC através de electrofisiologia ou bioimaging, ou para manipular vias neuromoduladores segmentados. É um ensaio robusto para uma rápida detecção de efeitos subletais sobre o comportamento causados ​​por estressores ambientais, toxinas ou pesticidas. Nós mostramos como o protocolo PER é fácil de implementar utilizando dois procedimentos. Um deles é adequado como um exercício de laboratório para os estudantes ou para ensaios rápidos do efeito de um tratamento experimental. O outro fornece controle completo mais de variáveis, o que é importante para os estudos de condicionamento comportamental. Mostramos como várias medidas de resposta comportamental que variam de binários sim / não para mais variável contínua como latência e duração da extensão tromba pode ser usado para testar hypotheses. E, discutimos algumas armadilhas que os pesquisadores comumente se deparam quando usar o procedimento pela primeira vez.

Apresentam-se dois exemplos de utilização dos protocolos POR descritos acima. O primeiro exemplo, feito uso do método 2 para estudar o modo como as abelhas perceber odores diferentes como uma função da semelhança molecular de odor utilizado como o CS 5,24,25. O segundo é um exemplo do uso do método 1 e algumas das precauções que devem ser tomadas quando começar a usar PER experimentos de condicionamento no laboratório de pesquisa. Estudos como este têm sido usados ​​para descrever o &#39;espaço perceptivo &quot;olfativa das abelhas e mariposas em conjunto com bioimaging 13 ou eletrofisiológico analisa 26. As abelhas do mel (n = 20) foram condicionados a associar o odorante decanal com reforço de sacarose ao longo de 12 ensaios para a frente emparelhamento condicionado (Figura 3A). Aproximadamente 10% das abelhas respondeu &quot;espontaneamente&quot; no primeiro ensaio, que é normal. Depois que o percentual que Responded aumentar ao longo dos próximos ensaios até 100% das abelhas respondeu na quinta tentativa e cada posterior julgamento. Vários estudos têm demonstrado que este aumento na resposta é específica para a condição para a frente o emparelhamento (Figura 1), em relação a vários processos de controlo importantes 3. Após a fase de aquisição, cada abelha foi submetido a uma série de ensaios teste não reforçada (Figura 3B), que envolveu a exposição ao odor CS e para vários outros odorantes que sistematicamente se diferenciou do CS em estruturas moleculares. As abelhas do mel responderam mais fortemente para o CS. Suas respostas para as outras odorants diminuiu em função das mudanças sistemáticas na estrutura, com as menores respostas aos odores menos como o CS. Na Figura 4, os resultados de um recente workshop em que os alunos aprenderam, pela primeira vez, como condicionar as abelhas utilizam o método 1 são ilustrados. Estudantes abetos<html> t condicionado abelhas por frente emparelhamento methycyclohexanone (HCM), ou octanol (OCT) com reforço de sacarose (Figura 4A). Respostas por cento foram menores no primeiro julgamento e aumentou em julgamentos posteriores, indicando que as abelhas aprenderam a associação odor-sacarose. Houve diferenças no grau que as abelhas aprenderam a associação condicionada pelos diferentes grupos de alunos. Na nossa experiência, estes tipos de diferenças podem ser devido ao odor, que foi usado como o CS, para os elementos imprecisos no método (Método 1), ou para o nível de formação dos experimentadores. No terceiro caso, o desempenho rapidamente torna-se mais consistente com o aumento da experiência dos pesquisadores. Após o condicionamento, cada abelha foi testado duas vezes com cada odor. Em grupos de abelhas que havia sido condicionado com emparelhamento frente de outubro ou MCH, a resposta foi, como esperado, o mais forte para o odor condicionado (Figura 4B). <html> ent &quot;&gt; O segundo grupo de abelhas que passaram para a frente de emparelhamento para outubro foi acondicionado em paralelo a um outro grupo no qual o odor outubro foi para trás combinado com sacarose. emparelhamento para trás é um dos vários tipos de procedimentos de controle para demonstrar que o aumento da resposta é específica de transmitir o emparelhamento e não devido a um outro processo, como a excitação não-específica de sensibilização. Para o emparelhamento para trás, os EUA sacarose e odor CS são apresentados em ordem inversa ao que é mostrado na Figura 1. Aquisição de Dados de emparelhamento para trás são não mostrado porque o RC não podem ser marcados dada a apresentação do odor SC após a apresentação de sacarose. Como seria previsível para o condicionamento associativo, os níveis de resposta para outubro foram maiores no grupo para a frente emparelhado em relação ao grupo de trás (Figura 4C). &quot;Width =&quot; 7fig1highres.jpg 500 &quot;/&gt; Figura 1: Diagrama de projeto experimental para o condicionamento usando a frente de emparelhamento. Ver Tabela 1 para a definição dos termos usados ​​nesta figura. (A) O CS (odor) precede e se sobrepõe com os EUA (solução / água sacarose). A relação entre o CS e US mostrado é o ideal para as abelhas produtoras de mel condicionado e mariposas. Mas o ISI ideal pode depender do protocolo condicionado e espécie animal 1. (B) Composição e temporização relativa de CS, CR, US e UR. O CR que ocorra antes da apresentação US ou durante os ensaios sem reforço &#39;test&#39; é a medida depende de protocolos experimentais. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 esgotamento Odor com reaproveitamento de cartuchos. Para esses dados, cartuchos de odor foramset-up com hexanol, como descrito no texto. Hexanol é comumente usado como um CS nos estudos por; no entanto, a taxa efectiva de depleção dependerá do odor e do solvente. Os cartuchos foram então usados ​​uma vez para 4 seg a cada minuto mais de 8 ensaios (assumindo 5 abelhas / trial em um experimento padrão que seria igual a 40 usos). As diluições no solvente indicado, que eram relativamente norma para experiências POR, foram de 2,0 M (A) e 0,2 M (B). (A, B) O odor foi amostrada após o primeiro e oitavo ensaios por adsorção sobre uma fase sólida microextração (SPME) de fibra que foi então dessorvido em um cromatógrafo a gás. As áreas relativas sob os picos foram superiores após o primeiro ensaio em relação ao oitavo para ambos os solventes e para ambas as concentrações (Wilcoxon pares assinado teste rank p &lt;0,05 [*] ou superior), o que mostra que menos odor foi entregue a partir do cartucho depois de o cartucho ter sido utilizado um número de vezes. (C, D) Os mesmos dados que mostram apenas o oitavo tr<html> ial com o eixo y expandido. Ela mostra que a depleção foi ligeiramente maior para hexano relativo ao óleo mineral, mas apenas a uma concentração mais baixa. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 Aquisição e teste usando decanal como o CS e método 2 para condicionado. (A) Teste-de-ensaio de resposta (CR) ao longo de 12 ensaios de emparelhamento para a frente (Figura 1). Os dados são de abelhas n = 20 mel condicionado em quatro grupos de cinco abelhas cada. O ISI foi de 3 segundos e o ITI foi 6 min. (B), utilizando testes não reforçada odores que diferem decanal pelo comprimento e / ou na posição do carbono do carbonilo da cadeia de carbono. Os odores foram apresentados numa série ao acaso entre os quatro grupos e foram intercaladas com ensaios reforçados com decanal (cada dois a três ensaios), a fim de evitar a extinção da CR. e_content &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Dados de um seminário durante o qual pós-graduação foram treinados para condicionar as abelhas usando PER método 1. dados (a) Aquisição de três grupos de abelhas condicionados a octanol (n = 23 e 15 para GPS 1 e 2, respectivamente) e metilciclohexanona (n = 10) (B) CRs durante os testes não reforçados com ambos os odores.; quatro ensaios apresentados na série aleatória entre os grupos. (C) sem reforço testes com ambos os odores em dois grupos de abelhas, um para a frente emparelhado (Gp 1, n = 23) e um para trás pareado (n = 25). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Prazo (abreviação) </td><td> Definição </td><td> Exemplo relevante </td></tr><tr><td> Estímulo condicionado (CS) </td><td> Aestímulo que provoca pouca ou nenhuma resposta às primeira e sinaliza US </td><td> CHEIRO </td></tr><tr><td> Resposta condicionada (CR) uma </td><td> A resposta ao CS após associação com os EUA </td><td> PROBOSCIS EXTENSÃO </td></tr><tr><td> Estímulo incondicionado (US) </td><td> Um estímulo biologicamente significativo que provoca uma resposta </td><td> Solução de sacarose / ÁGUA </td></tr><tr><td> Unconditioned Response (UR) a </td><td> A resposta para os EUA </td><td> PROBOSCIS EXTENSÃO </td></tr><tr><td> Inter-Stimulus Interval (ISI) </td><td> O tempo entre o início do CS e início de os EUA </td><td> CHEIRO de intervalo SACAROSE </td></tr><tr><td> Inter-Ensaio Interval (ITI) </td><td> O tempo entre sucessivos emparelhamentos CS-americanos para um único animal </td><td> CHEIRO (trial n) CHEIRO (trial n + 1) intervalo </td></tr></tbody></table> Tabela 1 Importante Terminologia. Consulte a Figura 1 para uma ilustração destes termos. um lucro por condicionar o CR e UR são os mesmos, embora para outros tipos de associações e reflexos do CR e UR podem ser diferentes. <a href="/files/ftp_upload/51057/BEE_4.avi" target="_blank">Filme 1.</a> Um vídeo de uma abelha do mel realizando PER depois de ter sido condicionado a responder a um odor. Observe a resposta PER da abelha aproximadamente 1,5 seg após o início odor. Acompanhando software mapeados os movimentos da antena, em resposta à apresentação do odor. As linhas traçadas no canto superior direito do vídeo mostram os movimentos reais da antena. Os dois gráficos na parte inferior da tela mostram movimentos antenais no X (à esquerda) e Y (direita) coordena. As linhas verticais no gráfico mostrado no vídeo indicam, da esquerda para a direita, a luz ON, PER, luz apagada e probóscide retração.

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A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Um protocolo de resposta narigudo Extensão para investigar plasticidade comportamental em Insetos: Aplicação para Basic, biomédica e Pesquisa Agropecuária

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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