Name: genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration
Uploaded: 2014-03-17T17:45:00
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우리는 통계 분석과 도움, 우수한 기술 지원을 C. 망치와 S. Papiol를 N. Schwedhelm-Domeyer 감사합니다. 우리의 작업은 막스 플랑크 협회, 도이치 Forschungsgemeinschaft, 나노 현미경을위한 센터, 뇌의 분자 생리학 (CNMPB), 괴팅겐, 독일 괴팅겐 대학의 GGNB 주니어 그룹 장학금으로 후원된다.

CGNs 어느 생후 (P) 5 마우스 새끼 또는 P6 래트 새끼로부터 제조 할 수있다. 우리는 postmitotic CGNs (13)를 선택하는 유사 분열 억제제를 사용 Bilimoria 및 동료에 의해 ​​기술 된 프로토콜을 따르십시오. 윤리 문 : 살아있는 동물을 포함한 모든 실험은 낮은 작센, 독일의 &quot;Verbraucherschutz 싶게 Lebensmittelsicherheit&quot;의 승인을 동물의 프로토콜에 따라 수행되었다. <p ...

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	<li>Cajal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histology of the nervous system of man and vertebrates. , (1995).</li><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).</li><li>White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wholemount+immunohistochemistry+for+revealing+complex+brain+topography.">Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Palay, S. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII-NeuroD+Signaling+Pathway+Specifies+Dendritic+Morphogenesis.">CaMKII-NeuroD Signaling Pathway Specifies Dendritic Morphogenesis.</a> Neuron. 41, 229-241 (2004).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cdc20-APC+ubiquitin+signaling+pathway+regulates+presynaptic+differentiation.">A Cdc20-APC ubiquitin signaling pathway regulates presynaptic differentiation.</a> Science. 326, 575-578 (2009).</li><li>Litterman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+OBSL1-Cul7Fbxw8+ubiquitin+ligase+signaling+mechanism+regulates+Golgi+morphology+and+dendrite+patterning.">An OBSL1-Cul7Fbxw8 ubiquitin ligase signaling mechanism regulates Golgi morphology and dendrite patterning.</a> PLoS Biol. 9, (2011).</li><li>Kim, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+centrosomal+Cdc20-APC+pathway+controls+dendrite+morphogenesis+in+postmitotic+neurons.">A centrosomal Cdc20-APC pathway controls dendrite morphogenesis in postmitotic neurons.</a> Cell. 136, 322-336 (2009).</li><li>Shalizi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium-regulated+MEF2+sumoylation+switch+controls+postsynaptic+differentiation.">A calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls postsynaptic differentiation.</a> Science. 311, 1012-1017 (2006).</li><li>Vadhvani, M., Schwedhelm-Domeyer, N., Mukherjee, C., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Centrosomal+E3+Ubiquitin+Ligase+FBXO31-SCF+Regulates+Neuronal+Morphogenesis+and+Migration.">The Centrosomal E3 Ubiquitin Ligase FBXO31-SCF Regulates Neuronal Morphogenesis and Migration.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Puram, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKIIbeta+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nat. Neurosci. , (2011).</li><li>Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC+channels+promote+cerebellar+granule+neuron+survival.">TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival.</a> Nat. Neurosci. 10, 559-567 (2007).</li><li>Huynh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isoform-specific+SnoN1-FOXO1+repressor+complex+controls+neuronal+morphogenesis+and+positioning+in+the+mammalian+brain.">An isoform-specific SnoN1-FOXO1 repressor complex controls neuronal morphogenesis and positioning in the mammalian brain.</a> Neuron. 69, 930-944 (2011).</li><li>de la Torre-Ubieta, L., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+neuronal+polarity+and+morphogenesis+in+the+mammalian+brain.">Transcriptional regulation of neuronal polarity and morphogenesis in the mammalian brain.</a> Neuron. 72, 22-40 (2011).</li><li>Calissano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+insulin-like+growth+factor+I+exerts+a+trophic+action+and+confers+glutamate+sensitivity+on+glutamate-resistant+cerebellar+granule+cells.">Recombinant human insulin-like growth factor I exerts a trophic action and confers glutamate sensitivity on glutamate-resistant cerebellar granule cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8752-8756 (1993).</li></ol>

장점 및 시험 관내 및 생체 내 방법에 기술의 한계 : 마우스와 쥐에서 배양 CGNs은 동일하게 형태 학적 분석을 위해 적합합니다. 쥐의 소뇌의 큰 크기 때문에, 쥐 새끼에서 CNGs의 수율은 마우스 새끼 3 배의 초과합니다. 이외에도 CGNs에서, 대뇌 피질 및 해마 뉴런뿐만 아니라 배양 시스템으로 사용될 수있다. 인산 칼슘 방법은 개별 뉴런의 형태를 분석하기 위해 요구되는 ?...

소뇌는 축삭의 성장과 이동의 메커니즘을 연구 할 수있는 훌륭한 시스템입니다. 소뇌는 신경 과학 (1)의 새벽부터 해부학 적 연구의 대상이되고있다. 현대 현미경과 면역 조직 화학 기술은 크게 확대와 산티아고, 라몬,과를 Cajal 2-4으로 초기 발견을 정제했다. 마우스 유전학과 분자 연구는 소뇌 과립 뉴런 (CGNs) 5-7를 포함하여 신경 세포의 다른 유형의 적절한 배선에 필요한 중요 사건의 더 큰 이해를 주도, 소뇌 개발의 제어에 필수적인 성장과 전사 인자를 발견. 소뇌는 개발 후뇌 8 rhombomere 1의 유도체이다. 제 4 뇌실의 지붕 부분 마름모꼴 립은에서 대부분의 수많은 신경 세포 집단을 구성하는 것이다 소뇌 과립 신경 전구 세포로 일으킨다성인 소뇌 9. 주동이의 이동에 따라, 그들은 소뇌 anlage에 정착. 여기에, 과립 신경 세포 전구체의 유사 분열은 설치류에서 출생 후에 일어나는 외부 세분화 층 (EGL)의 극적인 확장으로 이어집니다. EGL에서 뉴런은 조롱박 세포 층이 궁극적으로 내부 과립 층 (IGL 2)에 거주를 데리고 과거, 분자 층 (ML)를 통해 안쪽으로 마이그레이션을 시작. 이 이주 과정에서, 그들은 두 개의 축색 돌기는 ML로 확장과 양극성 모양을 취득. 상기 이동시에, 전지 본체 멀리 축삭에서 마이그레이션 및이 프로세스는 하나의 분기 된, T 자형 축삭 (10)를 형성하도록 융합. 그 후,이 축삭은 총생하고 병렬 섬유라고합니다. IGL에 정착하는 데, CGNs 이끼 섬유와 시냅스를 확립 돌기 발톱을 형성 수상 돌기를, 성장한다. , 현상 소뇌 근본적인 과정을 검토하는 시험 관내 및 생체 내에서 결합 approacH는 신뢰할 수있는 결과와 결론 수 있습니다. CGNs뿐만 아니라 소뇌하지만 뇌 전체에서 가장 많은 뉴런하고 높은 순도 11 ~ 13까지 배양 할 수있다. 문화,이 매우 균일 한 신경 세포의 인구는 빠르게 postmitotic되고, 쉽게 식별 축삭과 수상 돌기 극의 형태를 취득한다. 배양 CGNs은 조상의 증식, 분화, 축삭과 수상 돌기의 개발, 신경 세포 이동, 세포 사멸 및 전기 생리학 속성 (14-19 및 많은 다른 사람) 등의 신경 발달의 다양한 측면을 연구하는 것이 매우 유용하다는 것을 입증했다. 유전자 조작의 사용은 배양 CGNs의 다양성을 확대하고 상기 이벤트에 추가 기계론의 통찰력을 허용하고 있습니다. 저효율 인산 칼슘 또는 극성 마커 또는 소프트웨어 지원 분석 facili과 면역 세포 화학 다음에 친 유성 방법을 사용하여 배양 된 신경 세포의 형질조밀 한 신경 세포의 문화에서 개별 뉴런의 예를 들면 형태의 평가를 테이 츠. 이 방법을 사용 축삭 또는 수상 돌기의 성장에 대한 관심의 단백질의 역할은 20-25,26-28를 공부하실 수 있습니다. 이 배양 시스템은 그러나 마이그레이션이 매우 고밀도 배양에 한정되기 때문에 신경 마이그레이션을 분석하기 위해 덜 유용하고 공 배양을 필요로한다. 축삭 및 덴 드라이트 성장의 시험 관내 분석은 또한 RNA 방해 (I)의 조합을 통해 신호 경로의 상호 연결된 단백질의 검사를 허용, 과발현 또는 작은 분자. 축삭과 수상 돌기의 성장을 조절하거나 연결을 마이 그 레이션에 대한 관심의 단백질의 관련성을 확립하기 위해, 생체 전기 천공 (IVE) 기술은 개발 소뇌 피질에서 분석 할 수 있습니다. 설치류 소뇌 개발이 제 생후 주으로 이어져 있다는 사실로 인해, 소뇌 accessib를 의미축삭과 수상 돌기, 신경 세포의 이동, 시냅스와 세포 사멸 20-24,29,30,26,27,31-34을 개발하고 시험하는 유전자 조작에 대한 르 뇌 구조. 또한,이 모델 시스템은 또한 축삭 길 찾기, 배선과 함께 찍은 뉴런과 신경 세포 - glia의 상호 작용의 연결로 그대로 소뇌 피질을 필요로 신경 발달의 다른 측면에 유용합니다,이 프로토콜은 시험 관내 및 생체 기술을 해결하기에 제공 신경 세포의 형태 형성 및 마이그레이션에 대한 보완 방법.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="541">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">DMEM</td>
			<td style="width:125px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">11960-044</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">BME</td>
			<td style="width:125px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">41010-026</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Insulin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">Si-1-4011</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Poly-L-Ornithine</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">P-2533</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:160px;">CaCl2</td>
			<td style="width:125px;">Appli-Chem</td>
			<td style="width:88px;">A3652</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:160px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:125px;">Actavis Deutschland</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Tissue-Tek OCT</td>
			<td style="width:125px;">Sakura</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:160px;">Material Name</td>
			<td style="width:125px;">Company</td>
			<td style="width:88px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:168px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">ECM 830 and tweezertrodes</td>
			<td style="width:125px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:160px;">Epifluorescence microscope and camera</td>
			<td style="width:125px;">Nikon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">SP2 confocal microscope</td>
			<td style="width:125px;">Leica</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">ImageJ</td>
			<td style="width:125px;">NIH</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Imaris 7.4.2</td>
			<td style="width:125px;">Bitplane, Inc.</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:125px;">GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">MS Excel</td>
			<td style="width:125px;">Microsoft</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Loading tip 1-200 &#181;l</td>
			<td style="width:125px;">Costar</td>
			<td style="width:88px;">4853</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Pipette tip 200 &#181;l</td>
			<td style="width:125px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:88px;">70.760.502</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">Microlance 3 needle, 30 gauge</td>
			<td style="width:125px;">BD</td>
			<td style="width:88px;">302200</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">50 &#181;l gastight Syringe 1705</td>
			<td style="width:125px;">Hamilton</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">Glass coverslips&#160;</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific Menzel Glaeser</td>
			<td>CB00120RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration

신경 세포의 형태 형성 및 마이그레이션을 포함하여 뇌의 발달 이벤트는 높은 체외. 프로세스를 조율하고 생체 내에서 이러한 이벤트에 참여 경로를 식별하기 위해 심도있는 특성을 허용 분석된다. 개발 소뇌에서 파생 된 소뇌 과립 뉴런 (CGNs)의 형태 학적 분석을 위해 수있는 이상적인 모델 시스템이다. 다음, 우리는 유전자 CGNs를 조작하는 방법에 대한 방법과 방법을 개별 뉴런의 axono 및 dendritogenesis를 공부하는 방법에 대해 설명한다. 이 방법으로 RNA 간섭, 과발현 또는 작은 분자의 효과는 신경 세포를 제어하는​​ 비교 될 수있다. 또한, 쥐의 소뇌 피질은 지배적 인 출생의 개발로 인해 생체 시스템에 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 우리는 또한 유 전적으로 조작을 소뇌 현상 및 후속 소뇌를 설명하는 생체 전기 천공 기법을 제시하는 것은 신경 세포 모폴로지를 평가하는 분석ND 마이그레이션.

상술 한 바와 같이 서로 다른 배양 조건에 따라 CGNs의 형태를 분석하기 위해, 우리는 DIV 0에 신경을 형질 전환. 형질 전환 후, 우리는 전체 매체 (BME, 10 %의 혈청, 2 mM의 PSG, 25 밀리미터의 KCl) 및 최소 배지 포함 인슐린에 또 다른 세트 (BME, 25 mM의 포도당, 2 ㎜ PSG, 10 ㎍ /로 뉴런의 한 세트를 배치 ML 인슐린). 우리는 DIV 1, 2에서 GFP의 항체를 이용한 면역 세포 화학에 신경을 실시, 3 만 세트 2 세트 1 축삭?...

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Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

신경 세포의 형태 형성 및 마이그레이션 적절한 두뇌 발달의 기초가 중요 이벤트입니다. 여기서 우리는 유 전적으로 배양 소뇌 과립 뉴런과 형태와 신경 세포의 이동성 특성의 평가를위한 개발 소뇌를 조작하는 방법을 설명합니다.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

여러 스케일에서 디지털의 연결 형태론의 자동 숄 분석

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

연구

신경과학

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

강한 감각 뉴런의 Lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

설치류 Neuroblasts의 Nucleofection는 Neuroblast 마이그레이션을 연구하는<em&gt; 체외</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

소뇌 축삭의 레이저 Nanosurgery<em&gt; 생체</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는<em&gt; 생체</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

공 초점 Macroscopy을 사용하여 출생 후의 소뇌 과립 세포 이동의 생체 이미징

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

열 및 레이어에 수지상 형태학 분석

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...