Name: easy measurement of diffusion coefficients of egfp-tagged plasma membrane proteins using k-space image correlation spectroscopy
Uploaded: 2014-05-10T14:00:00
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이 작품은 LNN에 룬드 벡 주니어 그룹 리더 원정대에 의해 지원되었다. PWW는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC)의 보조금 지원을 인정합니다. 우리는 또한 디스크 현미경을 회전에 액세스 남부 덴마크 대학에서 덴마크 분자 바이오 이미징 센터 감사합니다.

KICS 분석 세포막에서 EGFP-태그 된 단백질의 취득은 표면 형광 현미경 TIRF 설정 또는 그 막의 이미지를 얻기위한 설정 회전 디스크 현미경에서 수행 될 수있다. 영상 프레임 간의 카메라 화소 크기뿐만 아니라 시간은 분석을 위해 필요하다. 4-30 Hz의 프레임 속도 100-1,200 프레임 이미지 시퀀스가​​ 분석을 위해 사용될 수있다. 획득 동안, 영상의 재생 시간에 걸쳐 초점 멤브레인을 유지하고 형광이 ?...

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	<li>Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=k-Space+image+correlation+spectroscopy:+A+method+for+accurate+transport+measurements+independent+of+fluorophore+photophysics.">k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics.</a> Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).</li><li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+Applications+to+membrane+dynamics.">Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).</li><li>Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lateral+diffusion+of+membrane+molecules+with+quantum+dots.">Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots.</a> Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat Methods. 5, 695-702 (2008).</li><li>Pinaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+partitioning+of+a+glycosyl-phosphatidylinositol-anchored+protein+in+glycosphingolipid-rich+microdomains+imaged+by+single-quantum+dot+tracking.">Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking.</a> Traffic. 10, 691-712 (2009).</li><li>Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+analysis+of+single-molecule+tracking+data+by+comprehensive+testing+against+Monte+Carlo+simulations.">Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations.</a> Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).</li><li>Durisic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+correction+of+blinking+bias+in+image+correlation+transport+measurements+of+quantum+dot+tagged+macromolecules.">Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules.</a> Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).</li><li>Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+regulated+membrane+diffusion+of+a+green+fluorescent+protein-aquaporin+2+chimera.">cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera.</a> Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).</li><li>Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+the+endoplasmic+reticulum+of+an+aquaporin-2+mutant+causing+human+nephrogenic+diabetes+insipidus.">Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).</li><li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+image+correlation+spectroscopy+(PICS):+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data.">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys J. 92, 613-621 (2007).</li><li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy:+concept+and+application.">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).</li><li>Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., L&#248;cke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+cAMP+increases+aquaporin-3+plasma+membrane+diffusion.">Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).</li></ol>

이 논문은 형광 단백질 태그로 단백질의 현미경 화상으로부터 확산 계수를 결정하기 위하여 통신 학회 분석 방법을 적용하는 방법의 상세한 단계별 개요를 제시했다. 분석 라벨링 밀도 매우 광범위한 동적 범위를 가진 프로브 선택 독립적이며, 따라서 또한 양자점뿐만 아니라 염료 등 EGFP 같은 형광 단백질로 표지 단백질에 적용될 수있다. 단백질 유효 확산 계수를 계산하기...

세포막 단백질의 사 차원 시공간 조직 횡 이동성 단단히 규제 및 단백질 기능, 활성 및 단백질 - 단백질 상호 작용의 역할을 할 수있다. 세포막 단백질의 측면 확산은, 전통적으로 양자점의 저속 촬상로부터 단일 입자의 확산 계수를 산출하거나 표시된 세포막 단백질 2-4 염색에 의해 연구되었다. 이 방법은 단백질 폴딩과 기능을 손상시킬 수 있으므로, 일부 단백질을 얻을 수없는 양자점 나 염료 라벨링 세포막 단백질의 세포 외 태그의 삽입을 필요로한다. 양자점의 입체 볼륨은 단백질 5의 확산 속도를 느리게하고, 또한, 인구의 단백질의 단지 작은 부분이 양자 도트로 표시되어 보여왔다,이 분수는 총 대표적인 경우는 알려져 있지 않다 세포막 단백질의 풀. 단일 입자 TRA양자점 표지 단백질의 이미지 시리즈에서 확산 계수의 요리하는 (SPT) 측정 매핑 두 차원 가우스와 함께 입자의 이미지가 피크 위치 광범위한 분석 알고리즘 다음에 적합하다을 포함한다. 분석 기술 입자 궤적에 현미경 점 분포 함수 (전형적 이차원 공간 가우시안) 및 입자 위치의 후속 링크의 근사치에 경과 시퀀스의 각 화상 프레임에 피팅 유용한 비 - 선형 곡선을 필요 계산적 매우 집약적 단일 분자 6,7의 움직임. 최근에 개발 된 이미지 상관 기법은 K-공간 이미지 상관 분광학 (KICS)는 찬란 세포막 단백질을 태그 확산 계수의 상대적으로 간단한 측정을 가능하게한다. 일상적 KICS 의해 형광 단백질로 표지 막 단백질의 확산 계수를 계산하는 가능성 보유 고유 도구전통적인 양자에 비해 여러 장점이 SPT 분석 점 : 세포 라벨링 소모 세포 태그와 시간의 삽입은 없음 (형광 단백질을 발현하는 세포주가 사용될 수있다) 요구되지 않는다; 확산 계수는 양자 점으로 표시된 부분 집합에 비해 형광 단백질의 전체 풀에서 추출된다; 분석은 단일 단백질을 추적 할 필요없이 간단하고, 분석은 추가적인 사용자 프로그래밍 대한 요구와 함께 기존의 코드를 사용하여 수행 될 수있다. 는 확산 계수의 고속 연산 및 계산을 가능하게 평균화 기법이므로 방법은 빠르다. 단백질 인구 이러한 급속한 확산 측정 근면 SPT 방법으로 인구의 서브 세트에 대해 얻은 분자량보다 상세한 교통 정보를 보완. KICS 시간 먼저 푸리에 공간으로 변환 된 형광 현미경 이미지 시퀀스의 상관 관계를, 이에 플로리다를 분리분자 수송 1에 의한 것과 광 물리학에 의한 uorescence 변동. 결과적으로, 통신 학회는 수밀도를 결정 속도를 흐르게하고, 복잡한 광표백 의해 공정한 지거나, 형광의 점멸 중에 확산의 형광 분자를 표지 할 수있다. 이것은 통신 학회 신속 정의 기입 알고리즘 없이도 형광 표지 된 세포 막 단백질의 확산 동성을 결정하기위한 유용한 도구를 만든다. 게다가 형광 표지 된 단백질은 KICS 또한 양자점 표지 된 막 단백질 (8)에 적용될 수있다. 이 문서는 코드와 방법에 생성 된 플롯을 평가하는 방법을 사용하는 방법, 작물을 배치하는 방법을 보여줌으로써 EGFP-태그 세포막 단백질의 확산 계수를 추출하기 위해 한국 통신 학회를 사용하는 방법을 단계별로 소개를 제공하는 확산에서 계수가 추출된다. 예로서, 반 내부 전반사에 디스크 현미경 세트를 회전하여 얻어진 데이터는 형광EGFP 태그 신장 물 채널 단백질 아쿠아 포린 -3 (AQP3)의 후부 (TIRF) 모드가 표시됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31600-083</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicilin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/13752?lang=en&amp;region=DK">13752</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15160070</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11860038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol red free medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11880-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8418?lang=en&amp;region=DK">D8418&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15630056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning Disk Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Ti Eclipse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:71px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">Ixon+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy measurement of diffusion coefficients of egfp-tagged plasma membrane proteins using k-space image correlation spectroscopy

측면 확산과 세포막 단백질의 구획화 단단히 세포에서 조절되고, 따라서, 이러한 프로세스를 연구하는 세포막 단백질 기능 및 규제에 새로운 통찰력을 밝힐 것이다. 최근 K-공간 이미지 상관 분광학 (KICS) (1)는 직접 프로브 광 물리학에 의해 도입 된 체계적인 편견을 피할 찬란 태그 세포막 단백질의 이미지에서 확산 계수의 일상적인 측정을 가능하게하기 위해 개발되었다. 분석을위한 이론적 근거는 복잡하지만,이 방법은 단백질의 확산 계수를 측정하기 위해 개방 코드를 사용 비전문가에 의해 구현 될 수있다. 한국 통신 학회는 상호 (K-) 공간에 각 이미지의 푸리에 변환 한 후 형광 현미경 이미지 스택에서 시간 상관 함수를 계산합니다. 이어서, 원형 평균화, 자연 대수는 변환 및 선형 산출 상관 함수에 확산 계수를 적합하다. 이논문은 한국 통신 학회를 통한 이미지 분석 및 확산 계수의 측정에 대한 단계별 가이드를 제공합니다. 먼저, 형광 표지 된 세포막 단백질의 높은 프레임 레이트 콘텐츠의 시퀀스는 형광 현미경을 이용하여 획득된다. 그런 다음, 관심 (ROI) 막 영역을, 세포 내 소기관을 피하고 소포를 이동하거나 돌출의 영역이 선택됩니다. 투자 수익 (ROI) 스택은 자유롭게 사용할 코드로 가져 여러 정의 된 매개 변수 (방법 섹션을 참조하십시오) 한국 통신 학회 분석을 위해 설정됩니다. 프로그램은 K-시공간 상관 함수에서 플롯 &quot;슬로프의 기울기&quot;이 발생하고, 확산 계수는 플롯의 기울기로부터 계산된다. 아래 정식 예로 EGFP 태그로 신장 수로 아쿠아 포린 -3 이용한 세포막 단백질의 확산 계수를 측정하는 단계별 KICS 절차이다.

KICS로 분석하기에 적합한 화상 스택을 획득하기 위해, 다른 현미경 시스템이 사용될 수있다. 그것은 에피 형광 현미경 등 TIRF 또는 스피닝 디스크 설정으로부터 이미지 시퀀스를 분석하는 것이 가능하다. 막 어떤 큰 움직이는 세포 소기관없이 또는 소포 / 움직이는 물체 평면해야합니다. 이 논문은 23.4 ㎐의 프레임 속도 원형질막으로 설정된 초점 회전 디스크 현미경에 결상 라이브 MDCK 세포에서 EG...

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Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

이 논문은 형광 라이브 포유 동물 세포에서 세포막 단백질을 표지 확산 계수를 측정 변동 분석 기술 K-공간 이미지 상관 분광학 (KICS)에 대한 단계를 안내하여 단계를 제공합니다.

K-공간 이미지의 상관 관계 분광학을 사용하여 EGFP-태그 플라즈마 막 단백질의 확산 계수의 간편한 측정

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Photobleaching 후 두 광자 형광 복구를 통해 확산 계수 측정

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

연구

생물학

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

유동세포계측법에 의해 플라즈마 막에 GLUT4 Translocation의 양적 측정

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 결정화

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

다중 타겟 추적 (MTT)에 의해 플라즈마 막의 분자 확산을 매핑

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 높은 처리량을 결정하기위한 로봇의 사용

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

pTIRFM와 이미징 플라즈마 막 변형

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

디지털 이미지의 상관 관계를 사용하면 혈관 조직 표본의 로컬 균주의 특성을

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...