Name: easy measurement of diffusion coefficients of egfp-tagged plasma membrane proteins using k-space image correlation spectroscopy
Uploaded: 2014-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en Lundbeck Junior gruppeleder Fellowship til LNN. PWW erkjenner bevilge midler støtte fra naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (NSERC). Vi vil også takke den danske Molecular Bioimaging Center ved Syddansk Universitet for tilgang til spinne disk mikroskopi.

Oppkjøp av EGFP-merket proteiner i plasmamembranen for kICS analyse kan gjøres på en epifluorescence mikroskop, en TIRF oppsett eller på en roterende disk mikroskop satt til å hente bilder av membranen av interesse. Kameraet pikselstørrelse, så vel som tiden mellom bilderammer som er nødvendig for analysen. Bilde sekvenser av 100-1,200 rammer ved en frekvens på 4-30 Hz kan anvendes for analyse. Under kjøpet, er det viktig å holde membranen i fokus gjennom hele varigheten av avbildning, og fokusere på en brø...

<ol>
	<li>Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=k-Space+image+correlation+spectroscopy:+A+method+for+accurate+transport+measurements+independent+of+fluorophore+photophysics.">k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics.</a> Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).</li><li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+Applications+to+membrane+dynamics.">Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).</li><li>Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lateral+diffusion+of+membrane+molecules+with+quantum+dots.">Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots.</a> Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat Methods. 5, 695-702 (2008).</li><li>Pinaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+partitioning+of+a+glycosyl-phosphatidylinositol-anchored+protein+in+glycosphingolipid-rich+microdomains+imaged+by+single-quantum+dot+tracking.">Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking.</a> Traffic. 10, 691-712 (2009).</li><li>Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+analysis+of+single-molecule+tracking+data+by+comprehensive+testing+against+Monte+Carlo+simulations.">Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations.</a> Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).</li><li>Durisic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+correction+of+blinking+bias+in+image+correlation+transport+measurements+of+quantum+dot+tagged+macromolecules.">Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules.</a> Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).</li><li>Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+regulated+membrane+diffusion+of+a+green+fluorescent+protein-aquaporin+2+chimera.">cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera.</a> Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).</li><li>Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+the+endoplasmic+reticulum+of+an+aquaporin-2+mutant+causing+human+nephrogenic+diabetes+insipidus.">Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).</li><li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+image+correlation+spectroscopy+(PICS):+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data.">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys J. 92, 613-621 (2007).</li><li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy:+concept+and+application.">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).</li><li>Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., L&#248;cke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+cAMP+increases+aquaporin-3+plasma+membrane+diffusion.">Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).</li></ol>

Denne artikkelen presentert en detaljert steg-for-steg oversikt over hvordan du skal bruke den kICS analysemetode for å bestemme diffusjonskoeffisienter fra mikroskopi bilder proteiner merket med fluorescerende proteiner. Analysen er uavhengig av sonden valg med et meget bredt dynamisk område i etikette densitet og kan således også anvendes på proteiner merket med kvanteprikker samt fargestoffer og fluorescerende proteiner som EGFP. For å beregne gyldige diffusjonskoeffisienter for pro...

Den firedimensjonal tid og rom organisering og lateral mobilitet av plasmamembranproteiner er strengt regulert, og kan spille en rolle i proteinfunksjon, aktivitet og protein-protein interaksjoner. Lateral spredning av plasma membran proteiner, har tradisjonelt blitt studert ved å beregne diffusjonskoeffisienter for enkeltpartikler fra time-lapse avbildning av quantum dot eller dye merket plasma membran proteiner 2-4. Denne tilnærmingen krever innsetting av et ekstracellulært tag i plasmamembranprotein for quantum prikk eller fargestoff merking, som kan kompromittere proteinfolding og funksjon og derved kan ikke oppnås for noen proteiner. Den sterisk volum av et kvantesprang dot har vist seg å forsinke diffusjonen av proteinet 5 og dessuten bare er en liten brøkdel av proteinene i populasjonen merket med quantum prikker, og det er ikke kjent om denne fraksjon er representativt for den totale pool av plasma membran proteiner. Enkelt partikkel tracking (SPT) målinger av diffusjonskoeffisienter fra bildeserie av quantum dot merkede proteiner innebærer kartlegging de fotografert topposisjonene av partiklene med todimensjonal Gaussian passer fulgt av omfattende analyse algoritmer. Analysen er beregningsmessig svært intensiv, som krever omfattende ikke-lineær kurvetilpasning i hvert bilderammen fra en intervallsekvensen til tilnærmelser av mikroskopet punktspredefunksjon (typisk to-dimensjonal romlig Gaussians), og etterfølgende kobling av partikkelposisjoner i partikkelbaner som beskriver bevegelse av enkle molekyler 6,7. En nylig utviklet bilde korrelasjon teknikk, k-Space Bilde Korrelasjon spektroskopi (kICS) gjør relative enkle målinger av diffusjonskoeffisienter av fluorescently tagget plasma membran proteiner. Muligheten til rutinemessig beregne diffusjonskoeffisienter av membran proteiner merket med fluorescerende proteiner ved kICS er et unikt verktøy som holderflere fordeler fremfor tradisjonelle quantum dot SPT-analyse: Ingen innsetting av ekstracellulære koder og tidkrevende ekstracellulære merking er nødvendig (cellelinjer som uttrykker fluorescerende proteiner kan anvendes); diffusjonskoeffisienter blir trukket ut fra den totale pool av fluorescerende proteiner sammenlignet med en delmengde som er merket med kvanteprikker; Analysen er enkel, uten behov for å spore enkle proteiner, og analysen kan utføres ved å bruke en eksisterende kode uten krav om økt brukerprogrammering. Metoden er hurtig, fordi det er en midlingsteknikk som muliggjør rask beregning og beregning av diffusjonskoeffisienter. Disse raske diffusjon målinger for protein befolkningen utfylle mer detaljert molekylær transport informasjon innhentet for en undergruppe av befolkningen av de møysommelig SPT metoder. kICS tid korrelerer fluorescens mikrosbildesekvenser som har første blitt forvandlet til Fourier plass, og dermed skiller fluorescence svingninger som følge av photophysics fra de som skyldes molekylære transport en. Som et resultat, kan kICS bestemme antall tetthet, strømningshastighet, og spredning av fluorescensmerkede molekyler som samtidig er objektivt ved komplekse fotobleking eller blinking av fluoroforer. Dette gjør kICS et nyttig verktøy for raskt å bestemme diffusjon dynamikken i fluorescently-merket celle membran proteiner uten å måtte tilpassede skrive algoritmer. Foruten fluorescensmerkede proteiner, kan kICS også brukes på quantum dot-merket membran proteiner åtte. Denne artikkelen gir en trinn-for-trinn innføring av hvordan du bruker kICS å trekke diffusjonskoeffisienter av EGFP-tagget plasma membran proteiner ved å demonstrere hvordan man skal plassere beskjære, hvordan å bruke koden, og hvordan man skal vurdere de genererte tomter, som diffusjon koeffisientene er hentet. Som et eksempel av data som oppnås fra den roterende disk-mikroskopi-apparatet i semi-total intern refleksjon fluoresceNCE (TIRF) modus, av en nedsatt vann kanal protein aquaporin-3 (AQP3) merket med EGFP presenteres.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31600-083</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicilin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/13752?lang=en&amp;region=DK">13752</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15160070</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11860038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol red free medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11880-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8418?lang=en&amp;region=DK">D8418&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15630056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning Disk Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Ti Eclipse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:71px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">Ixon+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy measurement of diffusion coefficients of egfp-tagged plasma membrane proteins using k-space image correlation spectroscopy

Lateral spredning og compartmentalization av plasma membran proteiner er strengt regulert i celler og dermed vil studere disse prosessene avsløre nye innsikter til plasma membran protein funksjon og regulering. Nylig, k-Space Bilde korrelasjon spektroskopi (kICS) 1 ble utviklet for å muliggjøre rutinemålinger av diffusjonskoeffisienter direkte fra bilder av fluorescently merkede plasma membran proteiner, som unngikk systematiske skjevheter introdusert av probe photophysics. Selv om det teoretiske grunnlag for analysen er komplekse, kan fremgangsmåten gjennomføres ved nonexperts ved hjelp av en fritt tilgjengelig kode for å måle diffusjonskoeffisienter i proteiner. kICS beregner en tid korrelasjon funksjon fra en fluorescens mikrosbildestakk etter Fourier transformasjon av hvert bilde til gjensidige (k-) plass. Deretter sirkulær gjennomsnitt, naturlig logaritme transformere og lineær passer til korrelasjonen funksjonen gir den diffusjonskoeffisienten. DetteArtikkelen gir en steg-for-steg guide til bildeanalyse og måling av diffusjonskoeffisienter via kICS. Først blir en høy bildefrekvens bildesekvens fra et fluorescensmerkede plasmamembranprotein ervervet ved hjelp av et fluorescens mikroskop. Så, er en region av interesse (ROI) unngå intracellulære organeller, flytting vesikler eller utstående membran regioner valgt. Den avkastningen stabelen importeres til en fritt tilgjengelig kode og flere definerte parametere (se metode kapittel) er satt for kICS analyse. Programmet genererer deretter en &quot;skråningen av bakkene&quot; plottet fra k-space tid korrelasjonsfunksjoner, og spredningen koeffisienten beregnes fra skråningen av tomten. Nedenfor er en steg-for-steg kICS prosedyre for å måle spredningen koeffisient av en membran protein ved hjelp av nedsatt vann kanal aquaporin-3 tagget med EGFP som en kanonisk eksempel.

Å skaffe egnede bildestakker å bli analysert med kICS, kan ulike mikroskop systemer brukes. Det er mulig å analysere bildesekvenser fra en epi-fluorescens mikroskop samt en TIRF eller en roterende disk oppsett. Membranen må være flat uten noen store bevegelige celleorganeller eller flytte blemmer / objekter. Dette notatet presenterer en tid lapse bildesekvens av AQP3 tagget med EGFP i levende MDCK celler fotografert på en roterende disk mikroskop med fokus satt til plasmamembranen med en bildefrekvens på 9,2 Hz. ...

Watch this Scientific Journal Video about Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy at JoVE.com

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Denne artikkelen gir en trinnvis guide til svingninger analyseteknikken k-Space Bilde Korrelasjon spektroskopi (kICS) for å måle diffusjonskoeffisienter av fluorescensmerkede plasma membran proteiner i levende pattedyrceller.

Easy Måling av diffusjonskoeffisienter av EGFP-merket plasma membran Proteiner Bruke k-Space Bilde Korrelasjon spektroskopi

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Kartlegging Molekylær Diffusion i plasmamembranen ved Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Bruk av en robot for High-throughput Krystallisering av membran proteiner i Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

The Cell-baserte L-Glutathione Protection Analyser til Study endocytose og resirkulering av plasma membran Proteiner

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Imaging Plasma Membran Deformasjoner Med pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Ved hjelp av Digital Image Correlation å karakter Lokale Stammer på vaskulær vevsprøver

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...