Name: easy measurement of diffusion coefficients of egfp-tagged plasma membrane proteins using k-space image correlation spectroscopy
Uploaded: 2014-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy at JoVE.com

Detta arbete stöddes av en Lundbeck Junior gruppledare Fellowship till LNN. PWW erkänner bidragsfinansiering stöd från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC). Vi tackar också det danska Molekylär Bioimaging Center vid Syddansk Universitet för tillgång till spinning disk mikroskopi.

Förvärv av EGFP-märkta proteiner i plasmamembranet för KIG analys kan göras på ett epifluorescensmikroskop, en TIRF uppkoppling eller på en roterande skiva mikroskop inställt att förvärva bilder av membranet av intresse. Kameran pixelstorlek samt tiden mellan bildramar behövs för analysen. Bildsekvenser av 100-1,200 bildrutor på en bildhastighet av 4-30 Hz kan användas för analysen. Under förvärvs, är det viktigt att hålla membranet i fokus under hela varaktigheten av den avbildning och fokusera på e...

<ol>
	<li>Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=k-Space+image+correlation+spectroscopy:+A+method+for+accurate+transport+measurements+independent+of+fluorophore+photophysics.">k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics.</a> Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).</li><li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+Applications+to+membrane+dynamics.">Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).</li><li>Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lateral+diffusion+of+membrane+molecules+with+quantum+dots.">Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots.</a> Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat Methods. 5, 695-702 (2008).</li><li>Pinaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+partitioning+of+a+glycosyl-phosphatidylinositol-anchored+protein+in+glycosphingolipid-rich+microdomains+imaged+by+single-quantum+dot+tracking.">Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking.</a> Traffic. 10, 691-712 (2009).</li><li>Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+analysis+of+single-molecule+tracking+data+by+comprehensive+testing+against+Monte+Carlo+simulations.">Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations.</a> Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).</li><li>Durisic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+correction+of+blinking+bias+in+image+correlation+transport+measurements+of+quantum+dot+tagged+macromolecules.">Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules.</a> Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).</li><li>Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+regulated+membrane+diffusion+of+a+green+fluorescent+protein-aquaporin+2+chimera.">cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera.</a> Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).</li><li>Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+the+endoplasmic+reticulum+of+an+aquaporin-2+mutant+causing+human+nephrogenic+diabetes+insipidus.">Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).</li><li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+image+correlation+spectroscopy+(PICS):+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data.">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys J. 92, 613-621 (2007).</li><li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy:+concept+and+application.">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).</li><li>Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., L&#248;cke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+cAMP+increases+aquaporin-3+plasma+membrane+diffusion.">Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).</li></ol>

I dokumentet presenterades en detaljerad steg-för-steg överblick av hur man tillämpar KI-grupperna analysmetod för att bestämma diffusionskoefficienter från mikroskopi bilder av proteiner märkta med fluorescerande proteiner. Analysen är oberoende av sond val med ett mycket brett dynamiskt omfång i märkning densitet och kan därför också tillämpas på proteiner märkta med kvantprickar samt färgämnen och fluorescerande proteiner såsom EGFP. För att beräkna giltiga diffusions...

De fyra dimension Spatiotemporal organisation och rörlighet i sidled av plasmamembranproteiner är hårt reglerad och kan spela en roll i proteiners funktion, aktivitet och protein-proteininteraktioner. Lateral diffusion av plasmamembranproteiner, har traditionellt studerats genom att beräkna diffusionskoefficienter för enstaka partiklar från time-lapse avbildning av quantum dot eller färgämne märkta plasmamembranproteiner 2-4. Detta tillvägagångssätt kräver införing av en extracellulär tagg i plasmamembranprotein för quantum dot eller färgämnesmärkning, som kan kompromissa proteinveckning och funktion, och således kan inte uppnås för vissa proteiner. Den steriska volymen för en quantum dot har visat sig bromsa diffusionen av proteinet 5 och dessutom är det bara en liten del av proteinerna i populationen märkt med kvantprickar, och det är inte känt om denna fraktion är representativ för den totala pool av plasmamembranproteiner. Enstaka partikel tracking (SPT) mätningar av diffusionskoefficienter från bildserien av quantum dot märkta proteiner innebär kartläggning de avbildade topppositioner partiklarna med tvådimensionell Gauss passar följt av omfattande analysalgoritmer. Analysen är beräkningsmässigt mycket intensiv, kräver omfattande icke-linjär kurvanpassning i varje bildruta av en time-lapse-sekvens till approximationer av mikroskopet punktspridningsfunktion (normalt tvådimensionell rumslig Gaussians) och efterföljande länkning av partikelpositioner i partikelbanor som beskriver rörelse av enstaka molekyler 6,7. En nyutvecklad bildkorrelationsteknik, k-Space Bildcorrelation Spectroscopy (KI-grupper) möjliggör relativt enkla mätningar av diffusionskoefficienter av fluorescerande taggade plasmamembranproteiner. Möjligheten att rutinmässigt beräkna diffusionskoefficienter av membranproteiner märkta med fluorescerande proteiner genom KI-grupperna är ett unikt verktyg som hållerflera fördelar jämfört med traditionella quantum dot SPT-analys: Det krävs ingen insättning av extracellulära taggar och tidskrävande extracellulär märkning (cellinjer som uttrycker fluorescerande proteiner kan användas); diffusionskoefficienter extraheras från den totala poolen av fluorescerande proteiner jämfört med en delmängd märkt med kvantprickar; Analysen är enkel utan behov av att spåra enstaka proteiner och analysen kan utföras med användning av en befintlig kod utan krav på ytterligare användarprogrammering. Metoden är snabb, eftersom det är en medelvärdesteknik som möjliggör snabb beräkning och beräkning av diffusionskoefficienter. Dessa snabba diffusion mätningar för protein befolkningen kompletterar den mer detaljerade molekylära transportinformation för en delmängd av populationen av de mödosamma SPT metoder. KI-grupperna tid korrelerar fluorescens mikroskopi bildsekvenser som först har transformerats till Fourier-rymden, och därmed separerar fluorescence svängningar som beror på fotofysik från dem som på grund av molekylär transport 1. Som ett resultat kan KIG bestämma antalet täthet, flödeshastighet, och diffusion av fluorescensmärkta molekyler samtidigt som den är ett idealiskt genom komplexa fotoblekning eller blinkar av fluoroforerna. Detta gör KIG ett användbart verktyg för att snabbt bestämma de diffusion dynamiken i fluorescensmärkta cellmembranproteiner utan att behöva anpassade skriv algoritmer. Förutom fluorescerande proteiner kan KIG även appliceras på quantum dot-märkta membranproteiner 8. Detta dokument ger en steg-för-steg införa hur man använder KI-grupperna för att extrahera diffusionskoefficienter av EGFP-märkta plasmamembranproteiner genom att visa hur man placerar grödan, hur man använder koden och hur man ska värdera de genererade tomter, där diffusion Koefficienterna extraheras. Som ett exempel kan data som erhållits genom spinning disk-mikroskopi uppsättning i semi-total inre reflektion fluorescerarnce (TIRF) läget av en njurvattenkanal protein aquaporin-3 (AQP3) taggade med EGFP presenteras.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31600-083</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicilin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/13752?lang=en&amp;region=DK">13752</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15160070</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11860038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol red free medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11880-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8418?lang=en&amp;region=DK">D8418&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15630056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning Disk Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Ti Eclipse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:71px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">Ixon+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy measurement of diffusion coefficients of egfp-tagged plasma membrane proteins using k-space image correlation spectroscopy

Lateral diffusion och uppdelning av plasmamembranproteiner är hårt reglerad i celler och på så sätt kommer att studera dessa processer visar nya insikter till plasmamembranprotein funktion och reglering. Nyligen, k-Space Bild Korrelation spektroskopi (KI-grupper) 1 utvecklades för att möjliggöra rutinmässiga mätningar av diffusionskoefficienter direkt från bilder av fluorescerande taggade plasmamembranproteiner, som undvek systematiska fel som införs genom sondfotofysik. Även om den teoretiska grunden för analysen är komplex, kan förfarandet genomföras genom nonexperts med hjälp av en fritt tillgänglig kod för att mäta diffusionskoefficienter i proteiner. KI-grupperna beräknar en tidskorrelationsfunktion från en fluorescensmikroskopi bildstapel efter Fourier transformation av varje bild till ömsesidig (k-) utrymme. Därefter cirkulär medelvärdes, naturliga logaritmen omvandla och linjär passar till korrelationsfunktionen ger diffusionskoefficienten. Dettapapper ger en steg-för-steg guide till bildanalys och mätning av diffusionskoefficienter via KI-grupperna. För det första är en hög bildhastighet bildsekvens av en fluorescensmärkt plasmamembranprotein förvärvas med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Då är en region av intresse (ROI) undvikande intracellulära organeller, flytta blåsor eller utskjutande membranregioner som valts. ROI stack importeras till en fritt tillgänglig kod och flera definierade parametrar (se metod avsnittet) är inställda för KI-grupper analys. Programmet genererar sedan en &quot;lutning på backen&quot; plot från k-space tidskorrelationsfunktioner, och diffusionskoefficienten beräknas från lutningen på tomten. Nedan följer en steg-för-steg KICS förfarande för att mäta diffusionskoefficienten för ett membranprotein med användning av renalt vatten kanal aquaporin-3 etiketten EGFP som en kanonisk exempel.

Att förvärva lämpliga bildstaplar som skall analyseras med KI-grupperna, kan olika mikroskopsystem användas. Det är möjligt att analysera bildsekvenser från en epi-fluorescensmikroskop samt en TIRF eller spinning disk setup. Membranet måste vara plan utan några stora rörliga cellorganeller eller flytta blåsor / objekt. Denna uppsats presenterar en tid förfaller bildsekvens av AQP3 taggade med EGFP i levande MDCK celler som avbildas på en snurrande skiva mikroskop med fokus inställt på plasmamembranet med ...

Watch this Scientific Journal Video about Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy at JoVE.com

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy (Video) | JoVE

Detta dokument ger en steg för steg guide till fluktuationer analysteknik k-Space Bildcorrelation Spectroscopy (KI-grupper) för att mäta diffusionskoefficienter av fluorescerande plasmamembranproteiner i levande däggdjursceller.

Lätt Mätning av diffusionskoefficienter av EGFP-taggade Plasma membranproteiner Använda k-Space Bild korrelationsspektroskopi

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

Research

JoVE Journal

Biology

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching (Video) | JoVE

Mätning Diffusion Koefficienter via två-photon fluorescens återhämtning efter fotoblekning

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases (Video) | JoVE

Kristalliserande Membrane proteiner för strukturbestämning med Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry (Video) | JoVE

Kvantitativ mätning av GLUT4 Translokation till plasmamembranet med flödescytometri

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases (Video) | JoVE

Kristallisering av membranproteiner i Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry (Video) | JoVE

Kvantifiering av proteiner med Peptide Immunoaffinity Anrikning kombination med masspektrometri

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT (Video) | JoVE

Kartläggning molekylär diffusion i plasmamembranet med Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases (Video) | JoVE

Användning av en robot för hög kapacitet Kristallisering av membranproteiner i lipidisk mesofaser

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins (Video) | JoVE

Cell-baserade L-glutation Protection Analyser för att studera Endocytosis och återvinning av plasmamembranproteiner

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM (Video) | JoVE

Imaging Plasma Membrane Deformationer Med pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens (Video) | JoVE

Med hjälp av digital bild Korrelation att karaktärisera lokala stammar på Kärlvävnadsprover

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...