Name: aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons
Uploaded: 2014-01-13T13:00:00
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我们衷心感谢白厅基金会为斯克里普斯研究所开展这项工作提供的资金支持和启动资金。

1. 准备腹腔甘利亚，电生理测量，和隔离单一识别神经元从阿普利西亚加州的腹部刚利翁
<ol><li>在实验室水族馆中保持 阿普利西亚 ，在 12：12 光下在 16 °C 处循环人工海水 （ASW）：黑暗条件。</li>
	<li>腹部结肠分离。<ol>
<li>通过注射380毫米MGCl2 溶液5-10分钟（相当于动物体重的30-35%）麻醉动物。</li>
		<li>根据腹部在中枢神经系统中的位置24，28识别腹部结肠。</li>
		<l...

神经元R15参与调节心血管，消化，呼吸和生殖系统30。AP 的定期有节奏的爆裂活动是 R15 的一个功能。如结果部分所示，R15 和 L7 的配对记录显示，神经质制备保留了 R15 神经元的活性。R15和L7神经元对阿赫反应恰当。这种神经质制备可维持8-10小时，电生理活动可持续监测。因此，我们可以长期研究短暂神经递质暴露（局部暴露在特定神经元或洗澡中）的电生理效应。此外，人们还可以研究...

人脑极其复杂，有近1000亿个神经元和数万亿个突触连接。几乎有同样数量的非神经细胞与神经元相互作用，并调节其在大脑中的功能。神经元被组织成调节特定行为的电路。尽管我们对大脑功能和神经回路的理解有所进步，但对于控制特定行为的电路组件的身份却知之甚少。了解电路中各种成分的身份将大大促进我们对细胞和分子行为基础的理解，并有助于制定神经精神病的新治疗策略。
海洋蜗牛阿普利西亚卡利福尼卡一直是确定神经元电路的基础特定行为1-14的工作马。阿普利西亚神经系统包含大约20，000个神经元，这些神经元被组织成9个不同的神经质。Aplysia的神经元很大，可以根据它们的大小、电特性和在神经中的位置轻松识别。阿普利西亚有丰富的行为，可以研究。研究良好的行为之一是刺退出反射 （GWR）。这种反射的中心部分位于腹部结节。已绘制 GWR 电路的组件，并确定各种组件的贡献。重要的是，GWR电路经历关联和非关联学习5，6，15-19。数十年来对这种反射的研究也发现了几个信号通路，这些信号通路在学习和记忆20-24中起着关键作用。
几种不同的 阿普利西亚 制剂用于研究记忆存储的细胞和分子基础。其中包括完整的动物2，3，半完整的准备1，7，13，14，16 和重建神经电路的主要组成部分25-29。这里描述了为探索 阿普利西亚 神经元电路的电生理学和分子分析而减少的准备。研究了以下四个已识别的神经元。R15，一个爆裂的神经元，L7和L11，两个不同的运动神经元和R2，一个胆碱神经元被研究。R2是无脊椎动物神经系统中描述的最大神经元。简言之，该方法涉及结节蛋白酶治疗、药理治疗前后的电生理测量以及单个神经元的分离，用于基因表达的定量分析。这种方法使我们能够将分子分析与多个神经元同时记录相结合。这种方法通过配对细胞内记录成功地用于研究R15和L7神经元对乙酰胆碱（Ach）的反应。经过电子生理测量，R15和L7以及L11和R2等其他已识别的神经元被分离出来，用于定量聚合酶链反应（qPCR）对CREB1表达的分析，CREB1是记忆存储的重要转录因子。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="372">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:120px;">Aplysia</td>
			<td style="width:123px;">National Aplysia Resource Facility, University of Miami</td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 3014-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">KCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">P 9333-500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">C5080- 500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">BP 214-501</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">NaHCO4</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 6297-250G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">H 3375-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Protease</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:129px;">17105-042</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Trizol</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">15596-026</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Chloroform</td>
			<td style="width:123px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:129px;">2194002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">ACROS</td>
			<td style="width:129px;">64-17-5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9515</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">3 M NaOAc, pH 5.5</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9740</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9737</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:120px;">MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM1751</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">qScript cDNA SuperMix</td>
			<td style="width:123px;">Quanta Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">95048-100</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Power SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">4367659</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">11252-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:120px;">Stainless Steel Minutien Pins&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">26002-10 or</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:129px;">26002-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">Veriti Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">5430R Centrifuge</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">5430R Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:120px;">Amplifier</td>
			<td>BRAMP-01R</td>
			<td style="width:129px;">NPI Electronics</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Digidata Converter</td>
			<td style="width:123px;">Instrutech ITC-18</td>
			<td style="width:129px;">HEKA ELEKTRONIK</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:123px;">Patch Star</td>
			<td style="width:129px;">Scientifica</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons

神经生物学的一个主要挑战是了解控制特定行为的神经回路的分子基础。一旦确定特定的分子机制，就可以开发新的治疗策略，以治疗退行性疾病或神经系统老化引起的特定行为中的异常。海洋蜗牛 阿普利西亚卡利福尼卡 非常适合研究细胞和分子的行为基础，因为神经电路背后的特定行为可以很容易地确定，电路的各个组成部分可以很容易地操纵。 阿普利西亚的 这些优点导致了学习和记忆神经生物学的几个基本发现。在这里，我们描述了为个体神经元的电生理学和分子分析准备 的阿普利西亚 神经系统。简言之，从神经系统解剖的结膜暴露在蛋白酶中，以去除结膜护套，使神经元暴露，但保留神经元活动，就像在完整的动物中一样。这种制剂用于对单个或多个神经元进行电生理测量。重要的是，使用简单的方法进行记录后，神经元可以直接从神经中分离出来进行基因表达分析。这些协议用于同时进行L7和R15神经元的电生理记录，研究它们对乙酰胆碱的反应，以及在分离的单L7、L11、R15和 阿普利西亚R2神经元中对CREB1基因的量化表达。

本研究中使用的动物重量在100-200克之间。按照上述协议，我们对从2-5克到200-300克的动物分离的腹部神经元进行了电生理测量和分子分析。
蛋白酶治疗的标准化对于成功测量神经元的神经元具有重要意义。最初，使用多个蛋白酶（假发）浓度和持续时间，R15神经元的爆裂作用潜力记录为26，31。这些测量被比较成从完整的帮派中直接（没有蛋白酶治疗）记录。在随后的...

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Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

海洋蜗牛 阿普利西亚卡利福尼卡 已被广泛用作神经生物学模型，用于细胞和分子行为基础的研究。这里描述了一种探索 阿普利西亚 神经系统的方法，用于识别神经回路单神经元的电生理学和分子分析。

阿普利西亚 单一神经元电生理学和分子分析的甘利亚制备

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阿普利西亚 单一神经元电生理学和分子分析的甘利亚制备

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