Name: aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons
Uploaded: 2014-01-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons at JoVE.com

Vi takker oprigtigt Whitehall Foundation for deres finansieringsstøtte og opstartsmidler fra The Scripps Research Institute for at udføre dette arbejde.

1. Forberedelse af Abdominal Ganglia, elektrofysiologiske målinger, og isolering af enkelt identificerede neuroner fra Abdominal Ganglion af Aplysia californica
<ol><li>Hold Aplysia i laboratoriet akvarium med cirkulerende kunstigt havvand (ASW) ved 16 °C under 12:12 lys:mørke forhold.</li>
	<li>Isolation af abdominal ganglion.<ol>
<li>Bedøve dyr ved at injicere 380 mM MgCl2 opløsning i 5-10 min (svarende til 30-35% af dyrets kropsvægt).</li>
		<li>Identificer abdominal ganglion baser...

Neuron R15 er involveret i regulering af hjerte-kar-, fordøjelses-, åndedræts- og reproduktive systemer30. En regelmæssigt rytmisk sprængning aktivitet AP er et træk ved R15. Som vist i resultatafsnittet viser parret optagelse af R15 og L7, at gangliapræparatet har bevaret aktiviteten af R15 neuroner. R15 og L7 neuroner reagerede hensigtsmæssigt på Ach. Denne ganglia forberedelse kunne opretholdes op til 8-10 timer og elektrofysiologisk aktivitet kan løbende overvåges. Således kunne man studere de ...

Den menneskelige hjerne er ekstraordinært kompleks med næsten 100 milliarder neuroner og billioner af synaptiske forbindelser. Der er næsten et lige antal nonneuronale celler, der interagerer med neuroner og regulerer deres funktion i hjernen. Neuroner er organiseret i kredsløb, der regulerer specifik adfærd. På trods af fremskridtene i vores forståelse af hjernefunktioner og neurale kredsløb vides lidt om identiteten af kredsløbskomponenter, der styrer en bestemt adfærd. Kendskab til identiteten af forskellige komponenter i et kredsløb vil i høj grad lette vores forståelse af både cellulære og molekylære grundlag for adfærd og støtte til udvikling af nye terapeutiske strategier for neuropsykiatriske lidelser.
Den marine snegl Aplysia californica har været en arbejdshest til bestemmelse af neuronale kredsløb, der ligger til grund for specifik adfærd1-14. Aplysia nervesystemet indeholder ca 20.000 neuroner, der er organiseret i 9 forskellige ganglier. De neuroner af Aplysia er store og kan let identificeres baseret på deres størrelse, elektriske egenskaber, og position i ganglier. Aplysia har et rigt repertoire af adfærd, der kan studeres. En af de velundersøgte adfærd er gill-tilbagetrækning refleks (GWR). De centrale komponenter i denne refleks er beliggende i abdominal ganglier. Komponenterne i GWR-kredsløbet er blevet kortlagt, og bidrag fra forskellige komponenter er bestemt. Det er vigtigt, GWR kredsløb gennemgår associative og nonassociative læring5,6,15-19. Årtiers undersøgelse af denne refleks har også identificeret flere signalveje, der har en central rolle i læring og hukommelse20-24.
Flere forskellige præparater af Aplysia blev brugt til at studere cellulære og molekylære grundlag for hukommelse opbevaring. Disse omfatter intakt dyr2,3, semi-intakt forberedelse1,7,13,14,16 og rekonstituering af større komponenter af neurale kredsløb25-29. En reduceret forberedelse til at udforske Aplysia ganglier til de elektrofysiologiske og molekylære analyser af identificerede neuronale kredsløb er beskrevet her. De følgende fire identificerede neuroner blev undersøgt. R15, en sprængning neuron, L7 og L11, to forskellige motoriske neuroner og R2, en cholinrgic neuron blev undersøgt. R2 er den største neuron beskrevet i hvirvelløse nervesystem. Kort sagt, denne metode indebærer protease behandling af ganglier, elektrofysiologiske målinger før og efter farmakologiske behandlinger, og isolering af enkelt neuroner til kvantitativ analyse af genekspression. Denne metode gør det muligt for os at kombinere molekylære analyser med samtidig optagelse fra flere neuroner. Denne metode blev med succes brugt til at studere responser af R15 og L7 neuroner til acetylkolin (Ach) ved parret intracellulære optagelser. Efter elektrofysiologiske målinger blev R15 og L7 og andre identificerede neuroner som L11 og R2 isoleret for kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) analyse af udtryk for CREB1, en transskriberingsfaktor, der er vigtig for hukommelseslagring.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="372">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:120px;">Aplysia</td>
			<td style="width:123px;">National Aplysia Resource Facility, University of Miami</td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 3014-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">KCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">P 9333-500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">C5080- 500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">BP 214-501</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">NaHCO4</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 6297-250G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">H 3375-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Protease</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:129px;">17105-042</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Trizol</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">15596-026</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Chloroform</td>
			<td style="width:123px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:129px;">2194002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">ACROS</td>
			<td style="width:129px;">64-17-5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9515</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">3 M NaOAc, pH 5.5</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9740</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9737</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:120px;">MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM1751</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">qScript cDNA SuperMix</td>
			<td style="width:123px;">Quanta Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">95048-100</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Power SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">4367659</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">11252-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:120px;">Stainless Steel Minutien Pins&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">26002-10 or</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:129px;">26002-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">Veriti Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">5430R Centrifuge</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">5430R Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:120px;">Amplifier</td>
			<td>BRAMP-01R</td>
			<td style="width:129px;">NPI Electronics</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Digidata Converter</td>
			<td style="width:123px;">Instrutech ITC-18</td>
			<td style="width:129px;">HEKA ELEKTRONIK</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:123px;">Patch Star</td>
			<td style="width:129px;">Scientifica</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons

En stor udfordring i neurobiologi er at forstå det molekylære fundament af neurale kredsløb, der styrer en bestemt adfærd. Når de specifikke molekylære mekanismer er identificeret, kan der udvikles nye terapeutiske strategier til behandling af abnormiteter i specifik adfærd forårsaget af degenerative sygdomme eller aldring af nervesystemet. Den marine snegl Aplysia californica er velegnet til undersøgelser af cellulære og molekylære grundlag for adfærd, fordi neurale kredsløb, der ligger til grund for en bestemt adfærd let kunne bestemmes, og de enkelte komponenter i kredsløbet let kunne manipuleres. Disse fordele ved Aplysia har ført til flere grundlæggende opdagelser af neurobiologi af læring og hukommelse. Her beskriver vi et præparat af aplysiens nervesystem til de elektrofysiologiske og molekylære analyser af individuelle neuroner. Kort, ganglion dissekeret fra nervesystemet er udsat for protease at fjerne ganglion kappen sådan, at neuroner er udsat, men bevarer neuronal aktivitet som i intakt dyr. Dette præparat bruges til at udføre elektrofysiologiske målinger af enkelt- eller flere neuroner. Det er vigtigt, at neuronerne efter optagelsen ved hjælp af en simpel metode kan isoleres direkte fra ganglier til genekspressionsanalyse. Disse protokoller blev brugt til at udføre samtidige elektrofysiologiske optagelser fra L7 og R15 neuroner, studere deres reaktion på acetylkolin og quantiterende udtryk for CREB1-genet i isoleret enkelt L7, L11, R15 og R2 neuroner fra Aplysia.

Vægtene af dyr, der blev brugt i denne undersøgelse, varierede fra 100-200 g. Efter de beskrevne protokoller gennemførte vi elektrofysiologiske målinger og molekylær analyse af neuroner af abdominal ganglier isoleret fra dyr fra 2-5 g til 200-300 g.
Standardisering af protease behandling er vigtig for vellykkede elektrofysiologiske målinger af neuroner i ganglier. I første omgang blev der anvendt flere protease (Dispase) koncentrationer og varigheder, og sprængningsvirkningspotentialer...

Watch this Scientific Journal Video about Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons at JoVE.com

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Marine snegl Aplysia californica har været meget anvendt som en neurobiologi model for undersøgelser på cellulære og molekylære grundlag af adfærd. Her beskrives en metode til at udforske nervesystemet i Aplysia til de elektrofysiologiske og molekylære analyser af enkeltneuroner af identificerede neurale kredsløb.

Aplysia Ganglia Forberedelse til elektrofysiologiske og molekylære analyser af enkeltneuroner

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers

Molekylær Indvikling og Electrospinnability biopolymerer

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Hakket Væv i Komprimeret Collagen: A Cell-holdige Biotransplant for Single-iscenesat rekonstruktionskirurgi Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

En Label-fri teknik til Spatio-temporale Imaging af encellede Sekret

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Udarbejdelse af Silicon nanotrådene Field-effekt Transistor for Kemiske og biosensorer Applications

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Engineering Molekylær Anerkendelse med Bio-mimetiske Polymerer på Single Walled kulstofnanorør

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

Dissektion MicroCT Scanning og morfometrisk Analyser af Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Forberedelse, rensning og brug af fedtsyre-holdige Liposomer

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Optagelsen af nye Lipid-belagt nanopartikler som indeholder Falcarindiol af humane mesenkymale stamceller

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Evaluering af fotosyntetiske adfærd ved samtidige målinger af blad reflektans og chlorophyll fluorescens analyser

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Biopartikel mikroarrays til kemotaktisk og molekylær analyse af human neutrofil sværmer in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...